מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Summary

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Abstract

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation.

Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

Introduction

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.¹ The core of NETs is nuclear DNA.¹ This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.¹ The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.² NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.^3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release.

Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.^3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.¹ Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.¹ MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.^1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.² NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).⁶ Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.⁶

Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

Protocol

הדירקטוריון סקירה מוסדיים מאוניברסיטת ג'ורג'יה אישרה את המחקר הסובייקט האנושי לאסוף דם היקפיים ממתנדבים בריאים (UGA # 2012-10769-06). ^5,7,8 מתנדבים חתם על טופס הסכמה מדעת נדרש לפני לקיחת הדם. המחקר מבוצע במאמר זה תואם עם הקווים המנחים האתיים מחקר רפואי, כולל בבני אדם של הצהרת הלסינקי.

1. ניתוק של נויטרופילים מן היקפיים ודם (איור 1)

הערה: ישנן מספר דרכים כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי. הפרוטוקול הבא מספק אפשרות אחת. פרוטוקול זה מניב כמויות גדולות של נויטרופילים אדם שאינו מופעל מסוגל לשחרר נטס על גירוי חיצוני. השתמש 40 מ"ל דם מלא המתקבל מתנדבים בריאים ידי venipuncture. ^7,9

1. Aliquot דם 20 מ"ל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל 6% Dextran. מערבבים בעדינות.
2. לאחר 20 דקות העברה לויקוציטים-ריקיםהשלב העליון h בלי לקחת שום כדוריות דם אדומות pelleted לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל נקי, למלא אותו עם PBS סטרילית.
3. צנטריפוגה ב 400 XG 10 דקות. Resuspend גלולה ב 4 מ"ל סטרילי PBS.
4. הכן שיפוע Percoll 5 שלבים של 85% -80% -75% -70% -65% בשני צינורות חרוטי 15 מ"ל ההשעיה לויקוציטים מ"ל שכבת 2 על גבי אחד שיפוע.
5. צנטריפוגה 800 XG במשך 30 דקות עם בלמים כבויים.
6. לאסוף את כל התאים (נויטרופילים) בשכבות על% 75% / 80 ו -70% / 75% ממשק.
7. פעמיים שטפו תאים PBS (350 XG, 10 דקות, RT) ולספור תאים באמצעות hemocytometer.

מדידה 2. קינטיקה של תאי DNA שחרור שימוש microplate fluorimeter

הערה: שיטה זו מאפשרת מדידה של שינויים הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר מעיד על שחרור DNA על פורמט microplate 96-היטב (איור 2).

1. כן השעיה של נויטרופילים במדיום assay (HBSS +1% (v / v) עצמיים סרום + 5 גלוקוז מ"מ) בריכוז של 2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
2. הוסף 5 μmol / L של צבע DNA מחייבת קרום חדיר. מערבבים בעדינות.
3. נויטרופילים האדם Aliquot (50 μl / טוב) על 96-היטב בתחתית שחור, שקוף microplates. ודא מדיום assay מכסה את כל תחתית הבאר. אם לא, הקש על צלחת בעדינות בצד.
4. לחמם את נויטרופילים המכיל צלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
5. בינתיים להכין תמיסות של גירויים במחיר כפול של הריכוזי הסופי שלהם כדי לשמש (37 ° בינוני assay החם C). כביקורת חיובית נטו להשתמש נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר phorbol-myristate-אצטט (PMA) עבור 4 שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. ^5,8 גירוי PMA עבור 4 שעות מבטיחה שחרור NET מקסימאלי, תוך היווצרות NET ספונטנית נשאר ^5,8 נמוכה.
6. הכן את microplate fluorimeter לשקילה (4 שעות, 37 ° C, 530 ננומטר עירור 590 ננומטר עבור פליטה).
7. לעורר נויטרופילים ידי הוספת פתרון הגירוי 50 μl 50 השעיות נויטרופילים μl. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​saponin אחד טוב כדי למדוד אות שחרור DNA מקסימלי.
8. מניחים צלחת בקורא ולמדוד שינויים הקרינה עבור 4 שעות ב כל 2 דקות עם לא רועד.
9. לניתוח נתונים, לחשב עליות מנורמלות קרינה לאורך זמן.
   1. קרינת בסיס פחת מן ערכי נקודות קצה עבור כל הבארות כולל saponin (איור 2 א ', ב'). עליית קרינת saponin צריכה להיות האות הגבוהה ביותר. זה נקרא "שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 א).
   2. חישוב אחוזי שחרור DNA בדגימות ידועות על ידי חלוקת עליות קרינה של דגימות ידועות על ידי שחרור DNA מקסימאלי.
   3. ממוצע תוצאות של משכפל ולהציגם כמו "% של שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 ג).

3. כימות של בנטוation ידי MPO-דנ"א-DNA HNE מבחני ELISA

הערה: אלה מבחנים שונים (דנ"א MPO) או הקים (HNE-DNA) במעבדה שלנו לכמת היווצרות NET ידי מדידת רמות של מתחמי MPO-דנ"א HNE-DNA ^5.

1. מעיל 96-היטב גבוהה יכולת קשירה צלחות ELISA לילה עם נוגדנים לכידת (50 μl / טוב): אנטי-MPO (דילול 1: 2,000) או אנטי-HNE (1: 2,000).
2. צלחות לשטוף ELISA שלוש פעמים עם PBS (200 μl / טוב) ולחסום אותם עם BSA 5% ו -0.1% אלבומין בסרום אדם עבור שעה 2 ב RT (200 μl / טוב). לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
3. נויטרופילים זרע על 96 גם microplates בצפיפות של 100,000 תאים / היטב במדיום assay 100 μl, וממריץ היווצרות NET. דגירת תאים: 4 שעות עבור 37 ° C.
4. בצע עיכול DNase מוגבל על ידי הוספת 2 U / DNase מיליליטר supernatants נויטרופילים, לערבב אותם היטב. שמור אותם ב RT.
5. עצור את DNase לאחר 15 דקות על ידי הוספת 11 μl 25 מ"מ EGTA (הריכוז הסופי 2.5 מ"מ). לערבב היטב. אסוף supernatants צינורות microfuge נקי. דגימות ספין להיפטר פסולת התא XG ב 300 דקות 5 ב RT. העבר supernatants שלהם לתוך צינורות microfuge נקיים. ולשמור אותם על הקרח עד מוכן.
6. השתמש aliquot של "תקן NET" שהוכן קודם לכן.
   הערה: הסטנדרטית NET הוא שילוב של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים PMA מגורה המתקבלים לפחות 5 תורמים אנושיים שונים, עצמאיים.
   1. כדי להשתמש באותה רמה במשך זמן רב, לאסוף aliquot נפח גדול של supernatants נויטרופילים מכל תורם יחיד. איסוף למשל 2 מ"ל של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים מגורה PMA תגרום 200 aliquots (10 μl כל אחד) מספיק 200 צלחות ELISA. נתונים המאפיינים את תקן NET נמצאים איור 5.
   2. לעורר נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר PMA עבור 4 שעות ולהחיל DNase לעכל כדי supernatants שלהם על פי השלבים 3.4-3.5.
   3. אסוף, בריכה, aliquot (10 μl) וחופשיze (-20 ° C) supernatants נויטרופילים.
   4. כדי להכין את "NET סטנדרטי", הפשרה אחד aliquot / תורם המתקבל לפחות חמישה תורמים נפרדים, לערבב אותם ולשמור אותם על קרח.
   5. בטל דגימות מופשרות ולהשתמש נרות חדשים לניסוי הבא.
   6. כן 1: דילול סדרה 2 של התקן-NET ב PBS + EGTA.
7. לדלל דגימות מתעכלות DNase1 (סטנדרטי supernatants הידוע) פי 20 ב PBS + EGTA ו aliquot אותם על צלחות ELISA מצופות נוגדנים ללכוד.
8. דגירה צלחות ELISA במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
9. החל פתרון נוגדן איתור (100 μl / טוב): נוגדן אנטי DNA מצומדות peroxidase חזרת (1: 500, העכבר). דגירה עבור שעה 1 בחושך.
10. אחרי ארבעה שוטף עם PBS להוסיף מצע peroxidase TMB: 100 μl / היטב, 30 דקות. צבע הכחול הוא אינדיקציה לפעילות peroxidase (רשתות נוכחיות).
11. עצור תגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב 1 M HCl. הפתרונות כחולים יצהיבו (איור 5 א).
12. קראו ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות פוטומטר microplate.
13. לניתוח נתונים, לחשב את כמות MPO-DNA או מתחמים-DNA HNE בהשוואת לתקן NET.
    1. הפחת את ערך צפיפות אופטית רקע של המדיום assay מכל המדגמים.
    2. מגרש את הערכים הספיגים (ציר ה- X) של דגימות תקן בדילול נגד תוכן NET היחסי (ציר ה- Y) (איור 5 א).
    3. באמצעות מגוון nonsaturated של עקומת סטנדרט זה להקים קו המגמה (להשתמש בכושר מעריכי הטוב ביותר מהתוכנה בשימוש) (איור 5 א). המשוואה של קו מגמה זו קובעת את ההמרה של ערכי OD כדי כמותיים סכומי נטס.
    4. הכנס את ערכי OD המדודים של האלמונים למשוואת המגמה אונליין מ 3.13.3 זה תיתן את כמות הרשתות במדגם הידוע כאחוז התקן-NET (איור 5 א).
    5. לחשבממוצעים של משכפל (triplicates) ולהציג את הנתונים הסופיים כמו "כמות MPO-DNA או מתחמי-DNA HNE (% לסטנדרטים)" (איור 5 ג).

תוצאות

הנתונים בכתב היד הזה לתאר את שיטת בידוד נויטרופילים, פרוצדורות, ותוצאות נציג נוכחיות עם הסבר של ניתוח נתונים. איור 1 מציג את צעדי סדרתי של הכנת נויטרופילים אדם. פרוטוקול זה מייצג רק דרך אפשרית אחת של בידוד נויטרופילים. זה מניב כמויות גדולות ?...

Discussion

רשתות מייצגי מנגנון חדשני מרתק שבו נויטרופילים להרוג פתוגנים. ¹ למרות שהספרות של הנטס כבר ברציפות ההרחבה בעשר השנים האחרונות מאז גילויין, מספר שאלות חשובות הקשורות לתפקידם בביולוגיה, מנגנון ויסות עדיין אינן ברורות. יש במתודולוגיה שתפותח למדוד נטס, זה מנגנון מי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)	Millipore	07-496	1:2,000x coated
DNase-1	Roche	10-104-159-001	1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Eon Microplate Spectrophotometer	Biotek
Gen5 All-in-One microplate software	Biotek		analytical tool (ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0.2% final concentration/volume
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Use 10 mM final concentration.
1 M glucose	Sigma		Use 5 mM final concentration.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
ELISA Plate	Greiner bio-one	655061
Conical tubes 15 ml	Thermoscientific	339650
Conical tubes 50 ml	Thermoscientific	339652
Percoll (pH 8.5-9.5)	Sigma	P 1644	Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom	Costar	3603