التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

الممرض المائية، العقدية iniae، هي المسؤولة عن أكثر من 100 مليون دولار في خسائر سنوية لصناعة تربية الأحياء المائية، وقادر على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر. فهم أفضل للS. يتطلب iniae المرض والتسبب في نظام النموذج المناسب. وقابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من مراحل النمو المبكرة من الزرد تسمح لتوليد وغير الغازية التصوير من خطوط المعدلة وراثيا مع الموسومة fluorescently الخلايا المناعية. جهاز المناعة التكيفية ليست وظيفية بالكامل حتى عدة أسابيع بعد الإخصاب، ولكن اليرقات الزرد لديها الفقاريات المحفوظة نظام المناعة الفطري مع كل من العدلات والضامة. وهكذا، وتوليد نموذج العدوى اليرقات يسمح دراسة مساهمة محددة الحصانة الفطرية في السيطرة S. عدوى iniae.

سوف موقع حقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هوالنظامية أو محلية في البداية. هنا، نقدم بروتوكولات لدينا أذني حقن حويصلة من الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين 2-3 أيام الإخصاب آخر فضلا عن تقنيات لدينا لتصوير مبائر الفلورسنت من العدوى. موقع عدوى موضعية يسمح مراقبة غزو ميكروب الأولي، وتجنيد الخلايا المضيفة ونشر العدوى. النتائج التي توصلنا إليها باستخدام نموذج اليرقات الزرد من S. عدوى iniae تشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها لدراسة مساهمات مختلفة من العدلات المضيفة والضامة في الالتهابات البكتيرية المحلية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف كيف يمكن استخدام photolabeling من الخلايا المناعية لتعقب المضيف فرد مصير خلية أثناء العدوى.

Introduction

العقدية iniae هو الممرض المائية الكبرى التي هي قادرة على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر ^1. في حين S. iniae مسؤولة عن خسائر كبيرة في صناعة تربية الأحياء المائية، وإنما هو أيضا الممرض الحيوانية المحتملين، القادرة على إحداث أمراض في المضيف البشري المناعة مع الأمراض السريرية مشابهة لتلك التي تسببها أخرى مسببات الأمراض البشرية العقديات. ونظرا التشابه مع مسببات الأمراض البشرية، فمن المهم دراسة S. iniae المرض والتسبب في سياق مجموعة الطبيعي. نموذج الزرد الكبار من S. وكشف العدوى iniae تسلل قوي من الكريات البيض المضيف الى الموقع المترجمة من العدوى وكذلك وقت سريع لاستضافة الموت، وهو وقت قصير جدا لإشراك جهاز المناعة التكيفية ^7. من اجل الحصول على نظرة متعمقة في الاستجابة المناعية الفطرية للS. iniae العدوى في الجسم الحي، فمن الضروري استخدام النموذج الذي هو أكثر قابلية لنعلى الغازية التصوير الحي.

الزرد اليرقات لديها عدد من المزايا التي تجعل من نموذج الفقاريات جذابة على نحو متزايد لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. الزرد غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام والحفاظ مقارنة نماذج الثدييات. الحصانة التكيف ليست ناضجة وظيفيا حتى 4-6 أسابيع الإخصاب آخر، ولكن اليرقات لها الفقاريات حفظا للغاية نظام المناعة الفطري مع تكملة، تول مثل مستقبلات، السيتوكينات، والعدلات والضامة مع قدرات مضادة للميكروبات بما في ذلك البلعمة وانفجر الجهاز التنفسي ^{2-6، 8-11.} وبالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من المراحل الجنينية واليرقات للتنمية تسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا مستقرة مع الخلايا المناعية fluorescently المسمى مما يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المضيف الممرض في الوقت الحقيقي في الجسم الحي. جيل من هذه خطوط المعدلة وراثيا باستخدام البروتين photoconvertible مثل دنdra2 يسمح لتتبع الفردي أصل الخلية المضيفة ومصير على مدار ¹² إصابة.

عند وضع الزرد نموذج عدوى اليرقات، فإن الموقع المختار لحقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هو في البداية موضعية أو جهازية. وتستخدم الالتهابات الجهازية الدم في الوريد الذيلية أو القناة كوفييه الأكثر شيوعا لدراسة مسببات الأمراض الميكروبية في الزرد ومفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والخلايا الميكروبية، والاستجابات خلوى، والاختلاف في الفوعة بين سلالات الممرض. لالكائنات الحية الدقيقة المتزايد أبطأ، والحقن في وقت مبكر في الكيس المحي من الجنين في مرحلة 16-1،000 الخلايا يمكن استخدامها لتوليد العدوى النظامية ^13،14، مع مرحلة التطوير الأمثل ل microinjection من الكائنات الحية الدقيقة التي تشهد نموا بطيئا جدت لتكون بين المرحلة 16-128 خلية ^15. ومع ذلك، صفار حقن SAC العديد من الميكروبات في مراحل لاحقة من التطور المضيف تميل إلى أن تكون قاتلة إلى tكان من المقرر أن تستضيف البيئة الغنية بالمغذيات للميكروب وعدم التسلل الكريات البيض ^16-18.

عدوى موضعية عادة النتائج في الهجرة موجهة من الكريات البيض نحو موقع العدوى التي يمكن قياسها كميا بسهولة مع التصوير غير الغازية. هذا النوع من العدوى يمكن أن تسمح للتشريح للآليات التي تتوسط هجرة الكريات البيض وكذلك التحقيق في قدرات المهاجرة وأكلة مختلفة من مختلف السكان الكريات البيض. التهابات موضعية مفيدة أيضا عند دراسة الاختلافات في الفوعة بين السلالات البكتيرية وكذلك دراسة آليات الغزو ميكروب منذ الحواجز المادية المضيف يجب أن عبرت عن عدوى موضعية لتصبح النظامية. وعادة ما تثار الزرد عند درجة حرارة 25-31 ° C ^19، ولكنها يمكن أيضا أن الحفاظ على درجات حرارة تصل إلى 34-35 درجة مئوية لمدة دراسات من الغزو من بعض مسببات الأمراض البشرية مع متطلبات درجة حرارة صارمةلالفوعة ^{20 و 21.}

وقد استخدمت العديد من المواقع المختلفة لتوليد عدوى بكتيرية موضعية في البداية بما في البطين الدماغ المؤخر ^22، الظهرية العضلات الذيل ^18، جوف التامور ^23، والحويصلة الأذنية (الأذن) ^{5، 16، 24.} ومع ذلك، فقد وجد أن حقن البكتيريا في عضلة الذيل يمكن أن يسبب تلف الأنسجة والتهاب مستقلة عن البكتيريا، والتي قد تحرف النتائج عند التحقيق استجابة الكريات البيض ^13. على الرغم من أن أقل ضرر يرتبط مع الحقن في الدماغ المؤخر وعلى الرغم من أنه يخلو في البداية من الكريات البيض في الأجنة الشباب، البطين الدماغ المؤخر مكاسب بشكل مطرد خلايا مناعية أكثر مع مرور الوقت كما تأخذ الخلايا الدبقية الصغيرة إقامة. البطين الدماغ المؤخر هو أيضا المكان أكثر صعوبة في الصورة. الحويصلة الأذنية هي تجويف جوفاء مغلقة مع أي الوصول المباشر إلى الأوعية الدموية ^{25 و 26.} فمن عادة خالية من ليوkocytes، ولكن الكريات البيض يمكن تجنيدهم للالحويصلة الأذنية في الاستجابة للمثيرات الالتهابية مثل التهاب. وهو أيضا الموقع المفضل من Microinjection من البكتيريا في العمر الزرد 2-3 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) بسبب سهولة التصوير والتصور للحقن. لذلك، اخترنا الحويصلة الأذنية كما موقعنا من عدوى بكتيرية موضعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

واستمرت الكبار والجنينية الزرد وفقا لمركز جامعة ويسكونسن ماديسون الثروة الحيوانية البحوث.

1. إعداد حقن مكروي إبر

1. إعداد الإبر حقن الزجاج الشعرية جدار رقيق (1.0 OD / 0.75 ID) باستخدام جهاز مجتذب micropipette مع الإعدادات التالية: ضغط الهواء 200، 502 الحرارة، وسحب 90، سرعة 80، 70 مرة، والوقت الهواء في بداية سحب 5، وقت البث في نهاية سحب 5.
2. باستخدام الملقط غرامة، وقطع غيض من إبرة سحب بحيث افتتاح قمة التي يبلغ قطرها حوالي 10 ميكرون.

2. إعداد أطباق حقن اليرقية

1. شطف مشط هلام مع عرض الممر حوالي 4-5 ملم في الماء المعقم والسماح ليجف.
2. إعداد 1.5-2٪ ذوبان عالية الحل الاغاروز في E3 المتوسطة ¹⁹ والميكروويف حتى الحل هو واضح. مرة واحدة يبرد، صب بعض الاغاروز في طبق بيتري (100 × 15 ملم) ودوامة،مضيفا مجرد الاغاروز ما يكفي لتغطية كامل الجزء السفلي من الطبق.
3. مرة واحدة وقد عزز طبقة الاغاروز، ضع تشطف وتجفف هلام مشط على رأس ذلك أن نهاية غير ممشط هو مجرد يستريح على الجزء العلوي من طبق بتري ونهاية بتمشيط لمس الاغاروز. تأكد من أن مشط هو أفقي قدر الإمكان، وخلق 30 درجة زاوية مع الاحترام لطبقة الاغاروز القاع.
4. صب كمية صغيرة إضافية من الاغاروز في واجهة بين المشط وطبقة الاغاروز أسفل بحيث تغطي طبقة الاغاروز جديدة آبار المشط. السماح لتبرد تماما قبل إزالة المشط. باستخدام طرف الماصة، وإزالة أي قطع المتدلية من الاغاروز من الآبار.
5. صب E3 المتوسطة على رأس حقن القالب وتخزينها في 4 ° C.
6. قبل كل استعمال، مع استبدال سلالم متوسطة وحقن الحار الطازجة في 28.5 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الحقن.
7. مباشرة قبل الحقن، واستبدال E3 على منحدر حقن معE3 المتوسطة التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل إيثيل 3-أمينوبنزوات (تريكين).

3. إعداد S. iniae اللقاح

1. إعداد والأوتوكلاف تود هيويت مرق المتوسطة تستكمل مع 0.2٪ مستخلص الخميرة و 2٪ بروتيوز ببتون (THY + P): 30 جم / L تود هيويت، 2 ز / L خلاصة الخميرة، و 20 غرام / L بروتيوز ببتون. لوحات أجار، إضافة 14 غرام / L أجار.
2. إعداد الثقافات البكتيرية في الليلة السابقة العدوى بواسطة pipetting قسامة 100 ميكرولتر من الأسهم البكتيرية المجمدة إلى 10 مل من THY + P مرق في مختومة أنبوب 15 مل. احتضان بين عشية وضحاها دون الإثارة عند 37 درجة مئوية. بعد 14-16 ساعة من النمو، واستخدام الثقافة بين عشية وضحاها إما لجعل الأسهم الفريزر أو التحضير لاستخدامها في الحقن.
3. جعل الأسهم الفريزر عن طريق وضع 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها في 500 ميكرولتر من 80٪ الجلسرين في أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي. لتجنب تجميد أذاب دورات، وجعل 100 ميكرولتر مأخوذة استخدام واحدة من هذا المزيج وتخزينها في -80 ° C.
4. لS. iniae المستخدمة في infectiإضافات، وتمييع الثقافة بين عشية وضحاها 1: 100 لإجمالي حجم 10 مل الثقافة بإضافة 0.1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 9.9 مل من THY + P مرق. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية دون التحريض على ما يقرب من 4-5 ساعة. مراقبة الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر باستخدام معمل NanoDrop وحصاد البكتيريا في مرحلة منتصف لوغاريتمي عندما OD600 نانومتر تصل إلى 0،250-0،500. ونانومتر OD600 من 0.250 يتوافق مع ما يقرب من 10 ⁸ مستعمرة (كفو) / مل.
5. بيليه 1 مل من ثقافة البكتيرية في أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد وتكرار. قياس نانومتر OD600 من البكتيريا في برنامج تلفزيوني، بيليه، و resuspend في برنامج تلفزيوني لتحقيق التركيز المطلوب.
6. للمساعدة في التصور من حقن مكروي، إضافة الفينول الأحمر إلى تعليق البكتيرية قبل الحقن لتركيز النهائي من 0.1٪.
7. للتجارب التي تنطوي على حقن البكتيريا قتلوا الحرارة، وتسخين البكتيريا في برنامج تلفزيوني في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.تأكد من أن عملية القتل الحرارة خفضت عدد من البكتيريا قادرة على البقاء إلى مستويات لا يمكن اكتشافها بواسطة الطلاء على حجم الحقن (حوالي 1 NL) على THY الصلبة + P لوحات أجار وتفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

4. وصفها S. INIA البريد مع CellTracker الأحمر نيون صبغ

1. لتسمية الخلايا الحية البكتيرية، وإعداد محلول المخزون من صبغة الفلورسنت CellTracker أو ما يعادلها. كما الصبغة المستخدمة يأتي في 20 × 50 ميكروغرام مأخوذة من مسحوق ويحتاج إلى معلق في DMSO، إضافة 7.3 ميكرولتر DMSO إلى أنبوب للحصول على تركيز الأسهم 10 ملم.
2. اختبار مجموعة من تركيزات صبغ (على سبيل المثال، ،5-25 ميكرومتر) على البكتيريا لتحديد تركيز أدنى الأمثل الذي البقع الخلايا. سرعة تقسيم الخلايا والتجارب أطول قد تتطلب تركيز أعلى من الصبغة.
   1. بيليه 1.0 مل من ثقافة البكتيرية في أنبوب 1.7 مل بواسطة الطرد المركزي على النحو المبين أعلاه (القسم 3). resuspend الكرية في 1مل PBS الطازجة وإضافة حجم مناسب لصبغ للثقافة البكتيرية.
   2. احتضان دون التحريض على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تدور باستمرار البكتيريا وresuspend في 1 مل من قبل تحسنت THY + P مرق واحتضان دون التحريض لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
   3. تدور باستمرار البكتيريا ويغسل مرتين في برنامج تلفزيوني قبل قياس نانومتر OD600 وتمييع البكتيريا ل microinjection على النحو المفصل أعلاه (القسم 3). نحن عادة حقن ما يقرب من 100 CFU في 1 حجم الحقن نيكولا لانغ لدراساتنا التوظيف الكريات البيض والبلعمة.

5. إعداد الزرد اليرقات للالتهابات

1. إعداد أزواج تربية في الليلة السابقة وجمع الأجنة كما وصفها روزن وآخرون ²⁷ الأجنة احتضان في E3 المتوسطة في 28.5 درجة مئوية لتصبح جاهزة لنقل العدوى.
2. لالزرد التي سيتم تصويرها، ومنع تطور الصباغ (التصبغ) وذلك بإضافة N-الفنيل (PTU) لE3 المتوسطة في 24 التسميد آخر ساعة (HPF) لتركيز النهائي من 0.2 نانومتر.
3. للالتهابات التي تنطوي على الأجنة الذين تتراوح أعمارهم بين 2 إدارة الشرطة الاتحادية والأجنة dechorionate يدويا مع زوج من ملاقط غرامة. بدلا من ذلك، الأجنة dechorionate عن طريق إزالة واستبدال E3 مع pronase (2 ملغ / مل) لمدة 5 دقائق أو حتى pipetting لطيف وقوع الأجنة من المشيمه. معظم اليرقات يجب أن تفقس بشكل طبيعي بنسبة 3 DPF.
4. تخدير الزرد عدة دقائق قبل العدوى عن طريق وضع اليرقات dechorionated في E3 المتوسطة التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل تريكين.

6. أذني الحويصلة حقن S. iniae إلى ثلاثة يوم قديم يرقات

1. بدوره على microinjector وضبط مدى الزمن ل"ميلي ثانية واحدة". فتح صمام على خزان غاز ثاني أكسيد الكربون للسماح الغاز في الخط. ضغط microinjector يجب قراءة ما يقرب من 20 PSI. ضبط الضغط في وحدة microinjector التي كتبها عقارب الساعة تحول مقبض مخرش الأسود لincrخفف الضغط أو عكس تحول للضغط انخفضت.
2. دوامة أعدت S. ثقافة iniae في الفينول الأحمر وبرنامج تلفزيوني واستخدام غيض microloader لتحميل 2-3 ميكرولتر من ثقافة إلى سحب حقن إبرة الشعرية.
3. تركيب إبرة تحميلها على micromanipulator متصلة الوقوف المغناطيسي وضعه تحت stereomicroscope ذلك أن الإبرة في حوالي زاوية 45-65 درجة فيما يتعلق قاعدة المجهر.
4. اضغط على دواسة القدم من microinjector إلى الاستغناء قطرة من اللقاح على رأس الإبرة. قياس قطرها من الانخفاض باستخدام شريط النطاق في عدسة العين المجهر.
   1. بدلا من ذلك، تقدير القطر من الانخفاض عن طريق حقن كمية إلى قطرة من الزيت المعدني على شريحة المجهر والزجاج مع شريط الحجم. يجب أن يكون قطرها من الانخفاض حوالي 0.10 ملم، وهي عبارة عن 1 حجم نيكولا لانغ.
   2. ضبط حجم قطرة من خلال تعديل مدة الإعداد علىوmicroinjector أو لقطة من أكثر من طرف الإبرة مع ملاقط غرامة. لاحظ أن الوقت الحقن يجب أن يكون بين 20 - 35 ميللي ثانية لتجنب التسبب في الكثير من تلف الأنسجة.
5. باستخدام الماصة نقل من البلاستيك، ونقل 12 تخدير اليرقات في كل بئر من العفن الحقن.
6. استخدام قضيب الزجاج، حلقة الشعر، أو غيض من البلاستيك لوضع بلطف اليرقات بحيث يتم أشار يتجه نحو الجزء الخلفي من المجهر والحويصلات صفار ضد الجانب الأيسر من البئر. نشير الأذن اليسرى لتصل اليرقة نحو السقف.
7. النظر من خلال عدسة العين من stereomicroscope، استخدام المقابض على مياداة مجهرية ليصطف الإبرة المحملة مع الحويصلة الأذنية حتى ان كل من هم في نفس مجال الرؤية. بيرس الطبقة الظهارية الخارجية للالحويصلة الأذنية مع طرف الإبرة بحيث غيض إبرة هو فقط داخل الحويصلة.
8. اضغط على دواسة القدم لحقن 1 NL من الجرعة المطلوبة من S. iniae. تأكد من استخدامانخفاض ضغط بما فيه الكفاية حتى لا تمزق تجويف. إذا كان حقن ناجحا، الحويصلة الأذنية، ولكن ليس الأنسجة المحيطة بها، يجب ملء مع الفينول اللقاح الأحمر (الشكل 1 منظمة العفو الدولية). على الفور إزالة أي نوع من الأسماك حقن سوء من لوحة الحقن.
9. التراجع بعناية الإبرة من اليرقة ونقل لوحة حقن باليد بحيث اليرقة التالية هي في الرأي. هل هذا تحت 5X التكبير.
   ملاحظة: المرجعة من الإبرة قد يؤدي إلى ترسب بعض أنواع البكتيريا خارج الحويصلة الأذنية، والتي قد تحرف البقاء والتوظيف الكريات البيض النتائج. لتجنب هذا، فمن المستحسن لحقن البكتيريا المسمى صبغة الفلورسنت وبصريا مسح اليرقات حقن تحت المجهر الفلورسنت لإزالة أي اليرقات حيث حدث هذا. ويرد يرقة حقن بشكل صحيح في (الشكل 1 بي).
10. لضمان يبقى حجم الحقن / اللقاح نفسها على مدار التجربة، حقن قطرة من ليالي البكتيريةuspension في أنبوب 1.7 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 100 ​​ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة بعد كل جنين 48 ^عشر. لوحة 100 ميكرولتر على THY + P أجار لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتحديد CFU في حجم الحقن.
11. عندما تم حقن مجموعة كاملة من 12 اليرقات على منحدر حقن، استخدم بعناية ماصة نقل البلاستيكية لإزالة اليرقات من الآبار ووضعها في طبق بتري جديد (35 × 10 مم ^2). إزالة الحل تريكين واستبدالها مع ما يقرب من 2 مل من المتوسط ​​E3 جديدة للسماح لليرقات لاسترداد.
12. الماصة حقن اليرقات في الآبار واحدة من لوحة 96-جيدا واحتضان عند 28.5 درجة مئوية. مراقبة اليرقات على مر الزمن من أجل البقاء في هذه اللوحات أو إزالة في وقت لاحق للتصوير أو CFU التهم الموجهة إليه.

7. السودان الأسود تلون العدلات

ملاحظة: الخطوات التالية يمكن أن يتم في درجة حرارة الغرفة في طبق بيتري صغير (35 × 10 مم ²⁾ على شاكر المداري إلا بعد التمديدذكر herwise. لكل خطوة، ومقدار كاشف المستخدم هو ما يقرب من 2 مل لكل طبق، وذلك باستخدام ما يكفي من السوائل لتغطية كامل اليرقات.

1. لتثبيت اليرقات المصابة، واستخدام ماصة باستير الزجاج لإزالة E3 المتوسطة واستبدال مع بارافورمالدهيد 4٪ الجليد الباردة في حل PBS. وضع على الفور الأسماك في 4 درجات مئوية إلى الموت ببطء. إصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
3. وصمة عار مع السودان الأسود (الأسهم 0.18٪ المخفف 1: 5 في 70٪ من الإيثانول، 0.1٪ الفينول) لمدة 30 دقيقة إلى 5 ساعة. استخدام stereomicroscope للتحقق مما إذا اتخذت حبيبات العدلات يصل وصمة عار.
4. تنفيذ سلسلة من 5 دقائق يغسل بدءا من غسل واحد في الايثانول 70٪ تليها غسل واحد من نسبة 1: 1 من 70٪ من الإيثانول وPBS، تليها غسل النهائي في برنامج تلفزيوني.
5. ترطيب في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ توين (PBT).
6. لمسح الصباغ من اليرقات، ويغسل في 1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم / 1٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 6-10 دقيقة. رصد عينة closelذ وبعد حوالي 5 دقائق، والتحقق من اليرقات تحت stereomicroscope لمعرفة مدى الصباغ طهر. إذا تم ترك حل لفترة طويلة جدا، فإن الحويصلات صفار تنتفخ وتنفجر.
7. يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني.
8. تخزين العينات في أي برنامج تلفزيوني أو PBT في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع حتى جاهزة للصورة والعد.
9. لصورة السودان الأسود الملون واليرقات، ونقل الأسماك إلى PBT ومن ثم إلى 80٪ الجلسرين ومكان على واحدة شريحة تجويف الاكتئاب. موقف ثابت اليرقات تحت stereomicroscope باستخدام طرف ماصة. الصورة باستخدام كاميرا رقمية اللون على stereomicroscope (الشكل 1 أخي-IV).

8. تعداد البكتيريا قابلة للحياة من اليرقات المصابة

1. الموت ببطء اليرقات في الأوقات المرجوة إصابة آخر في 200-300 ملغ / L حل الجليد الباردة من تريكين في E3 المتوسطة.
2. الماصة الموت الرحيم اليرقات إلى 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي. إزالة الحل تريكين واستبدالها مع 100 ميكرولتر من 0.2٪تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (PBSTx).
3. التجانس اليرقات عن طريق تمرير صعودا وهبوطا 10 مرات من خلال إبرة 27 G.
4. إعداد التخفيفات المسلسل من الخليط في برنامج تلفزيوني العقيمة. على سبيل المثال، إذا كانت الجرعة المعدية هي 100 CFU، الماصة 100 ميكرولتر من جناسة إلى 900 ميكرولتر PBS العقيمة. باستخدام الماصة معلومات جديدة، ونقل 100 ميكرولتر من جناسة المخفف إلى 900 ميكرولتر PBS العقيمة.
5. لوحة 100 ميكرولتر من التخفيفات في كولومبيا CNA أجار لعزل انتقائية من البكتيريا إيجابية الجرام، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. وهذه الوسيلة توفير قدر أكبر من الاختيار من لوحات أجار THY + P، والتي سوف تدعم نمو كل من البكتيريا سالبة الجرام وإيجابية الجرام.
6. على لوحات مع أقل من 500 المستعمرات الفردية، حساب عدد المستعمرات ومضاعفة من قبل عامل تخفيف لتحديد عدد من CFU.

9. التثبيت من اليرقات للتصوير

1. إصلاح اليرقات في 4٪ بارافورمالدهيد الجليد الباردة في حل PBS كما ديمكتوب في قسم 7.
2. في درجة حرارة الغرفة، ويغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني قبل التصوير.

إعداد 10. من اليرقات للتصوير لايف

1. إعداد منخفضة ذوبان نقطة الحل الاغاروز 1.5٪ في E3 عن طريق التسخين في فرن الميكروويف حتى الحل هو واضح.
2. وضع الحل الاغاروز في 55 ° C حمام الماء لندعه يبرد ولكن لا تتصلب.
3. إضافة تريكين إلى الاغاروز إلى تركيز النهائي من 0.016٪.
4. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ضع 4-5 يرقات تخدير في طبق أسفل الزجاج على مرحلة من مراحل stereomicroscope.
5. إزالة تريكين والحل الاغاروز من حمام الماء 55 ° C وندعه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة. في حين أن الاغاروز والتبريد، وإزالة أكبر قدر من السائل من اليرقات تخدير وقت ممكن.
6. صب تبريد الاغاروز في طبق حتى يتم تغطية ما يقرب من نصف السطح. دوامة الطبق لنشر الاغاروز. لاحظ أنه إذا كان الاغاروزهو حار جدا، وسوف تقتل اليرقات. أيضا، إذا تم إضافة الكثير من الاغاروز إلى الطبق، وعدسة الهدف من المجهر قد ضرب قاع الطبق عند التركيز من خلال الاغاروز.
7. باستخدام ماصة نقل، والتقاط اليرقات التي طفت على جانبي الطبق والماصة لهم مرة أخرى في المركز.
8. تحت stereomicroscope، ضع بلطف اليرقات على النحو المرغوب فيه مع حلقة الشعر، وهي غيض ماصة طويلة أو قضيب الزجاج. للتصوير من الحويصلة الأذنية، ضع اليرقات بحيث الحويصلة الأذنية ترك مسطحة ضد الجزء السفلي من الطبق.
9. السماح للالاغاروز بارد لمدة 10 دقيقة قبل أن ينتقل الطبق. اليرقات قد تحول المواقف إذا كان الاغاروز ليست صلبة. الماصة بلطف بعض تريكين وحل E3 إلى الجزء العلوي من طبقة الاغاروز لإبقائها رطبة.

11. متحد البؤر التصوير من العدوى

1. وضع الطبق السفلي من الزجاج مع اليرقات على خشبة المسرح من مجهر مقلوب مع المسح الضوئي ليزر confoca-FV 1000نظام لتر.
2. تعيين الثقب إلى 200-300 ميكرون واستخدام الفتحة رقمية 0.75 / 20X عدسة الهدف، تعيين مداخن Z-مع 3-6 ميكرون شرائح.
3. استخدام المسح الضوئي خط متواصل لضبط قوة الليزر وكشف تحقيق مكاسب لكل قناة.
4. عن طريق المسح الضوئي خط متسلسل لكل قناة مضان (على سبيل المثال، 488 و 543 نانومتر) وتدخل الفرق النقيض (DIC)، وإجراء فيلم الفاصل الزمني من الحويصلة الأذنية ترك كل 3 دقائق ل2-6 ساعة لمراقبة التوظيف الأولي والبلعمة من قبل العدلات والضامة. لدورات زمنية أطول، ووضع غطاء على طبق بيتري لمنع التبخر والتجفيف من الاغاروز.
5. الحصول على الصور الثابتة الثابتة (الشكل 1B) أو العيش (الشكل 2) اليرقات في 20X 40X أو التكبير.

12. Photoconversion من Dendra2 المسمى الكريات البيضاء في أذني الحويصلة

ملاحظة: Dendra2 يمكن photoconverted من الأخضر إلى الأحمر مضانمن خلال التركيز على 405 نانومتر ليزر (50-70٪ قوة الليزر يجب أن تكون كافية) على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لمدة 1 دقيقة. وفيما يلي بروتوكول خطوة بخطوة المستخدمة لنظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر FV-1000:

1. تصور العينة باستخدام الاشعة ض المكدس مع نانومتر 488 و 543 نانومتر الليزر. استخدام المسح الضوئي خط متواصل لضبط مكاسب قوة الليزر وكاشف. تحقق للتأكد من عدم وجود مضان أحمر photoconverted عن طريق الخطأ.
2. على "صورة تحكم اقتناء" نافذة، تحت عنوان "إعداد التحفيز" تحديد "استخدام الماسح الضوئي" أداة واختر "الرئيسية". حدد الليزر 405 نانومتر وضعه في السلطة 70٪. باستخدام الخيار الدائرة، وتحديد العائد على الاستثمار في الحويصلة الأذنية.
3. تحت عنوان "وضع الحوافز بدء" حدد "تنشيط في مسلسل" مع preactivation من 1 الإطار ووقت تفعيل 60،000 مللي ثانية. على "إعداد اقتناء" نافذة تحت "وقت المسح عنوان"، اختر 2 فيtervals من 00:01:00 (واحد قبل واحد لphotoconversion ما بعد).
   ملاحظة: بعد وقت المسح سلسلة انقضاء كاملة، كان ينبغي photoconverted في Dendra2 إلى حالته الحمراء الفلورسنت.
4. تفحص عينة من كومة ض باستخدام نانومتر 488 و 543 نانومتر ليزر لتصور مضان أحمر photoconverted فضلا عن أي مخضر المتبقية (الشكل 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

Microinjection من S. iniae في الحويصلة الأذنية (الشكل 1) والشكل (2) النتائج في رد المضيف محلية في البداية. عندما تم حقنها بشكل صحيح، يجب أن ينظر إلى البكتيريا فقط في الحويصلة الأذنية وليس في الأنسجة المحيطة أو الدم. هذا يمكن تصور خلال حقن مكروي باستخدام الفينول صبغة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

طريقة العدوى المستخدم هنا هو مفيد لدراسة الاستجابة المناعية لعدوى موضعية في البداية في 2-3 أجنة DPF واليرقات. محور حافز التهابات، مثل العدوى، في تجويف مغلق مثل الحويصلة الأذنية يسمح لدراسة العدلات والبلاعم الكيميائي والبلعمة. التحذير واحدة من حقن البكتيريا في الحويصل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 ml Eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml Falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x ½ in. needle	BD Biosciences	305109
96-well Plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser scanning confocal microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144