Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

Résumé

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Résumé

L'agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l'industrie de l'aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l'imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d'un modèle d'infection larvaire permet l'étude de la contribution spécifique de l'immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae.

Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l'injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d'imagerie confocale de fluorescence de l'infection. Un site d'infection localisée permet l'observation de l'invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l'infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d'accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l'infection.

Introduction

Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains ^1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l'industrie de l'aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d'autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d'étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte d'un hôte naturel. Un modèle de poisson zèbre adulte de S. infection iniae a révélé l'infiltration robuste de leucocytes d'accueil sur le site de l'infection localisée ainsi comme un temps rapide d'accueillir la mort, un temps trop court pour impliquer le système immunitaire adaptatif ^7. Afin d'obtenir un regard en profondeur dans la réponse immunitaire innée à S. iniae infection in vivo, il est nécessaire d'utiliser un modèle qui est plus favorable à nsur-invasive imagerie en temps réel.

Le poisson zèbre larves a un certain nombre d'avantages qui en font un modèle vertébré plus en plus attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Poisson zèbre sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et à entretenir par rapport aux modèles de mammifères. L'immunité adaptative est pas fonctionnellement matures jusqu'à 4-6 semaines après la fécondation, mais les larves ont un système immunitaire inné des vertébrés hautement conservée avec le complément, Toll-like récepteurs, les cytokines et les neutrophiles et les macrophages avec des capacités antimicrobiennes y compris la phagocytose et la bouffée respiratoire ^{2-6, 8-11.} En outre, la traçabilité génétique et la transparence optique des stades embryonnaires et larvaires de développement pour permettre la génération de lignées transgéniques stables avec les cellules immunitaires marquées par fluorescence permettant d'étudier les interactions hôte-pathogène en temps réel in vivo. La génération de ces lignées transgéniques en utilisant une protéine photoconvertible tels que DenDRA2 permet le suivi de l'origine de la cellule hôte et le destin individuel au cours de l'infection ^12.

Lors de l'élaboration d'un modèle d'infection des larves de poisson zèbre, le site choisi de microinjection permettra de déterminer si une infection est initialement localisée ou systémique. Infections du sang systémique dans la veine caudale ou un conduit de Cuvier sont les plus couramment utilisées pour étudier les pathogènes microbiens chez le poisson zèbre et sont utiles pour étudier les interactions entre l'hôte et des cellules microbiennes, les réponses de cytokines, et les différences de virulence entre les souches pathogènes. Pour les micro-organismes à croissance plus lente, une injection précoce dans le sac vitellin d'un embryon au stade 16-1,000 cellulaire peut être utilisée pour générer une infection systémique ^13,14, avec le stade de développement optimal pour la micro-injection d'un micro-organisme à croissance lente jugée entre l'étape 16 à 128 de la cellule ^15. Toutefois, le jaune injections sac de nombreux microbes à des stades ultérieurs de développement hôte ont tendance à être mortelle à til accueillera en raison de l'environnement riche en nutriments pour le microbe et le manque de leucocytes infiltrants ^16-18.

Une infection localisée se traduit généralement par la migration dirigée des leucocytes vers le site de l'infection qui peut être facilement quantifiée par imagerie non invasive. Ce type d'infection peut permettre pour la dissection des mécanismes qui interviennent dans la migration des leucocytes ainsi que des enquêtes de différentes capacités migratoires et phagocytaires de diverses populations leucocytaires. Infections localisées sont également utiles lors de l'examen des différences de virulence entre les souches bactériennes ainsi que l'étude des mécanismes d'invasion de microbes depuis barrières de l'hôte physiques doivent être croisés pour une infection localisée à devenir systémique. Poisson zèbre sont généralement soulevé à des températures de 25-31 ° C ^19, mais ils peuvent aussi être maintenu à des températures aussi élevées que 34 à 35 ° C pour les études de l'envahissement de certains agents pathogènes humains avec les exigences de température strictespour la virulence ^{20, 21.}

De nombreux sites différents ont été utilisés pour générer une infection bactérienne localisée initialement compris le ventricule du cerveau postérieur ^22, queue muscle dorsal ^18, la cavité péricardique ^23, et la vésicule otique (oreille) ^{5, 16, 24.} Cependant, il a été trouvé que l'injection des bactéries en queue muscle peut causer des dommages aux tissus et l'inflammation indépendante des bactéries, ce qui peut fausser les résultats lorsque l'enquête réponse des leucocytes ^13. Bien que moins de dommages est associé à l'injection dans le cerveau postérieur et bien que ce est d'abord dépourvu de leucocytes chez les jeunes embryons, le ventricule rhombencéphale gagne progressivement les cellules immunitaires dans le temps que les microglies se installent. Le ventricule rhombencéphale est également un endroit plus difficile à l'image. La vésicule otique est une cavité creuse fermée sans accès direct à la vascularisation ^{25, 26.} Il est normalement dépourvue de leukocytes leucocytes, mais peuvent être recrutés pour la vésicule otique en réponse à des stimuli inflammatoires telles que l'infection. Il est également un site privilégié de la micro-injection de bactéries chez le poisson zèbre ans après la fécondation (DPF) 2-3 jours en raison de la facilité d'imagerie et la visualisation de l'injection. Par conséquent, nous avons choisi la vésicule otique que notre site d'infection bactérienne localisée.

Protocole

Adultes et embryonnaires poisson zèbre ont été maintenus en conformité avec l'Université du Wisconsin-Madison recherche Ressources Animales Center.

1. Préparation de microinjection Aiguilles

1. Préparer aiguilles d'injection capillaire en verre de paroi mince (1,0 OD / 0,75 ID) en utilisant un dispositif micropipette extracteur avec les paramètres suivants: pression d'air 200, la chaleur 502, tirez 90, vitesse 80, heure 70, heure de l'air au début de la traction 5, temps d'antenne à la fin de la traction 5.
2. En utilisant des pinces fines, détacher la pointe de l'aiguille tiré sorte que l'ouverture de la pointe a un diamètre d'environ 10 um.

2. la préparation des plats d'injection larvaires

1. Rincer un peigne de gel avec la largeur des voies d'environ 4-5 mm dans de l'eau stérile et laisser sécher.
2. Préparer une solution d'agarose de fusion élevé de 1,5 à 2% en milieu E3 ¹⁹ et micro-ondes jusqu'à ce que la solution est claire. Une fois refroidi, verser une partie de l'agarose dans une boîte de Petri (100 x 15 mm) et tourbillon,ajoutant juste assez d'agarose pour couvrir complètement le fond de la boîte.
3. Une fois que la couche d'agarose est solidifiée, placer le peigne sur gel rincée et séchée au-dessus de sorte que l'extrémité non peigné est simplement posée sur la partie supérieure de la boîte de Pétri et l'extrémité est en contact avec la peigné agarose. Assurez-vous que le peigne est aussi horizontale que possible, créant un angle de 30 ° par rapport à la couche d'agarose bas.
4. Verser une petite quantité supplémentaire de agarose à l'interface entre le peigne et la couche d'agarose fond de sorte que la couche d'agarose frais couvre les puits du peigne. Laisser refroidir complètement avant de retirer le peigne. En utilisant une pointe de la pipette, retirez tous les morceaux en surplomb de agarose des puits.
5. Verser moyenne E3 sur le dessus du moule d'injection et conserver à 4 ° C.
6. Avant chaque utilisation, remplacer par injection chaude moyennes et des rampes frais à 28,5 ° C pendant au moins une heure avant l'injection.
7. Immédiatement avant les injections, remplacer l'E3 sur la rampe d'injection avecMoyenne E3 contenant 200 ug / ml d'éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne).

3. Préparation S. iniae inoculum

1. Préparer et autoclaver milieu de bouillon de Todd Hewitt complémenté avec 0,2% d'extrait de levure et 2% de peptone de proteose (THY + P): 30 g / L de Todd Hewitt, 2 g / l d'extrait de levure, 20 g / L proteose peptone. Pour des plaques de gélose, ajouter 14 g / l d'agar.
2. Préparer cultures bactériennes la veille infections par pipetage une aliquote de 100 pi de stock bactérienne congelé dans 10 ml de bouillon P + THY dans un tube scellé 15 ml. Incuber une nuit sans agitation à 37 ° C. Après 14-16 heures de la croissance, utiliser la culture du jour au lendemain de faire des stocks de congélateur ou préparer pour une utilisation dans les injections.
3. Faire stocks de congélateur en plaçant 1 ml de la culture d'une nuit dans 500 pi de 80% de glycerol dans un tube de 1,7 ml de la centrifugeuse. Pour éviter les cycles de gel-dégel, faire 100 pi à usage unique aliquotes de ce mélange et conserver à -80 ° C.
4. Pour S. iniae utilisé dans infections, diluer la culture de la nuit 1: 100 pour un volume total de la culture de 10 ml par addition de 0,1 ml de culture de la nuit à 9,9 ml de THY + P bouillon. Croître à 37 ° C sans agitation pendant environ 4-5 heures. Surveiller la densité optique (DO) à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre à Nanodrop et récolter les bactéries en phase logarithmique de la mi-lorsque la DO600 de 0,250 à 0,500 nm atteint. Une DO600 nm de 0,250 correspond à environ 10 ⁸ unités formant des colonies (UFC) / ml.
5. Pastille 1 ml de la culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml à 1 500 xg pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS frais et recommencer. Mesurer la DO 600 nm de la bactérie dans du PBS, d'une pastille, et remettre en suspension dans du PBS pour obtenir la concentration désirée.
6. Pour faciliter la visualisation de micro-injection, le rouge de phénol à ajouter les suspensions bactériennes avant l'injection pour une concentration finale de 0,1%.
7. Pour les expériences impliquant l'injection des bactéries tuées par la chaleur, le chauffage des bactéries dans du PBS à 95 ° C pendant 30 min.Assurez-vous que le processus de la chaleur tuant réduit le nombre de bactéries viables à des niveaux indétectables par placage un volume d'injection (environ 1 nl) le THY solide + plaques d'agar P et une nuit d'incubation à 37 ° C.

4. Étiquetage S. inia e avec un CellTracker rouge fluorescent Dye

1. Pour étiqueter cellules bactériennes vivantes, préparer une solution de réserve d'un colorant fluorescent ou équivalent CellTracker. Comme le colorant utilisé est en 20 x 50 ug aliquotes de poudre et doit être remis en suspension dans du DMSO, ajouter 7,3 ul de DMSO dans le tube pour obtenir une concentration de 10 mM stock.
2. Testez une gamme de concentrations de colorants (par exemple, 0,5 à 25 uM) sur les bactéries pour déterminer la plus faible concentration optimale qui colore les cellules. Cellules à division rapide et des expériences plus longues peuvent nécessiter une plus forte concentration de colorant.
   1. Pellet 1,0 ml de culture bactérienne dans un tube de 1,7 ml par centrifugation comme décrit ci-dessus (article 3). Reprendre le culot dans 1ml en PBS frais et ajouter le volume approprié de colorant pour la culture bactérienne.
   2. Incuber sans agitation à 37 ° C pendant 30 min. Isoler les bactéries et les remettre en suspension dans 1 ml de bouillon préchauffé THY P + et incuber sans agitation pendant encore 30 minutes à 37 ° C.
   3. Isoler les bactéries et laver deux fois dans du PBS avant de mesurer la DO600 nm et diluer les bactéries pour microinjection comme indiqué ci-dessus (article 3). Nous injectons habituellement environ 100 CFU en 1 volume d'injection nl pour nos études sur le recrutement des leucocytes et la phagocytose.

5. Préparation de poisson zèbre larves pour les infections

1. Mettre en place couples reproducteurs la nuit avant et recueillir des embryons comme décrit par Rosen et al. ²⁷ embryons Incuber en milieu E3 à 28,5 ° C avant d'être prêt à infecter.
2. Pour le poisson zèbre qui sera imagé, empêcher le développement de pigment (mélanisation) par l'addition de N-phénylthiourée (PTU) à laE3 moyenne à 24 heures après la fécondation (HPF) pour une concentration finale de 0,2 nM.
3. Pour les infections impliquant des embryons âgés de 2 dpf, embryons dechorionate manuellement avec une paire de pinces fines. Alternativement, les embryons dechorionate en supprimant E3 et les remplacer par la pronase (2 mg / ml) pendant environ 5 min ou jusqu'à ce que le pipetage douce brise embryons sur le chorion. La plupart des larves ont éclos devraient naturellement par 3 dpf.
4. Anesthésier poisson zèbre plusieurs minutes avant l'infection en plaçant larves dechorionated dans le milieu E3 contenant 200 ug / ml tricaïne.

6. otique vésicules injection de S. iniae en trois jours larves âgées

1. Allumez le micro-injecteur et définir la plage de temps de "milliseconde". Ouvrir la valve sur le réservoir de dioxyde de carbone de laisser du gaz dans la ligne. La pression de la microinjecteur doit indiquer environ 20 psi. Régler la pression dans l'unité de micro-injecteur par rotation vers la droite de la molette noire pour incratténué la pression ou antihoraire tourner la baisse de pression.
2. Vortex préparé S. culture iniae en rouge de phénol et PBS et utiliser une pointe de microloader charger 2-3 ul de la culture dans une aiguille d'injection capillaire tiré.
3. Monter l'aiguille chargée sur un micromanipulateur connecté à un support magnétique et le positionner sous un stéréomicroscope de sorte que l'aiguille se trouve à un angle d'environ 45-65 ° par rapport à la base du microscope.
4. Appuyez sur la pédale de commande de la micro-injecteur pour distribuer une goutte de l'inoculum sur la pointe de l'aiguille. Mesurer le diamètre de la goutte en utilisant la barre d'échelle dans la lentille oculaire du microscope.
   1. En variante, estimer le diamètre de la goutte par injection d'un volume dans une goutte d'huile minérale sur une lame de microscope en verre avec une barre d'échelle. Le diamètre de la goutte doit être d'environ 0,10 mm, qui est d'environ un volume de 1 nl.
   2. Ajuster la taille des gouttes en ajustant le réglage de la duréele micro-injecteur ou en coupant les plus de la pointe de l'aiguille avec des pincettes fines. A noter que le temps d'injection doit être comprise entre 20 à 35 msec pour éviter de causer des dommages aux tissus trop.
5. En utilisant une pipette de transfert en plastique, le transfert 12 anesthésiés larves dans chaque puits du moule d'injection.
6. Utilisez une tige de verre, boucle de cheveux, ou la pointe en plastique pour positionner délicatement les larves de telle sorte que les têtes sont pointés vers l'arrière du microscope et les sacs vitellins sont contre le côté gauche du puits. Pointez l'oreille gauche de la larve vers le plafond.
7. En regardant à travers la lentille oculaire du microscope stéréoscopique, utiliser les boutons sur le micromanipulateur pour aligner l'aiguille chargée avec la vésicule otique de sorte que les deux sont dans le même champ de vision. Pierce la couche épithéliale externe de la vésicule otique avec la pointe d'aiguille de sorte que la pointe de l'aiguille est juste à l'intérieur de la vésicule.
8. Appuyez sur la pédale d'injecter 1 nl de la dose souhaitée de S. iniae. Veillez à utiliser unpression suffisamment faible pour ne pas rompre la cavité. Si l'injection est réussie, la vésicule otique, mais pas le tissu environnant, doivent remplir avec le phénol inoculum rouge (Figure 1 Ai). Enlever immédiatement les poissons mal injecté à partir de la plaque d'injection.
9. Rétracter délicatement l'aiguille de la larve et déplacer la plaque d'injection à la main afin que la prochaine larve est en vue. Pour ce faire, en vertu de grossissement 5X.
   Remarque: retrait de l'aiguille peut entraîner le dépôt de certaines bactéries à l'extérieur de la vésicule otique, ce qui peut fausser la survie et le recrutement des leucocytes résultats. Pour éviter cela, il est recommandé d'injecter des bactéries marquées par un colorant fluorescent et balayer visuellement larves injecté sous un microscope à fluorescence pour enlever les larves où cela se est produit. Une larve correctement injecté est montré dans (Figure 1 Bi).
10. Pour assurer le volume d'injection / inoculum reste le même au cours de l'expérience, injecter une goutte du s bactériennesUSPENSION dans un tube de 1,7 ml de centrifugeuse contenant 100 pi de PBS stérile après chaque 48 ^e embryon. Plaque sur les 100 pi de gélose THY P + plaques à 37 ° C pendant une nuit pour déterminer le CFU dans le volume d'injection.
11. Lorsque l'ensemble du groupe des 12 larves sur la rampe d'injection a été injecté, à utiliser avec précaution une pipette de transfert en plastique pour enlever les larves des puits et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri (35 x 10 mm ^2). Retirer la solution de tricaïne et le remplacer par environ 2 ml de milieu de E3 frais pour permettre aux larves de récupérer.
12. Pipet injecté larves dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits et incuber à 28,5 ° C. Surveiller les larves au fil du temps pour la survie dans ces plaques ou supprimer plus tard pour imagerie ou UFC compte.

7. Noir Soudan Coloration des neutrophiles

Remarque: Les étapes suivantes peuvent être effectuées à la température ambiante dans une petite boîte de Petri (35 x 10 mm ²⁾ sur un agitateur orbital à moins otherwise contraire. Pour chaque étape, la quantité de réactif utilisé est d'environ 2 ml par boîte, en utilisant juste assez de liquide pour couvrir complètement les larves.

1. Pour la fixation des larves infectées, utiliser une pipette Pasteur en verre pour éliminer le milieu E3 et le remplacer par un 4% de paraformaldéhyde glacée dans une solution PBS. Immédiatement placer le poisson à 4 ° C pour euthanasier. Fixer une nuit à 4 ° C.
2. Lavez 3 fois en PBS pendant 5 min chacun.
3. Stain avec le Soudan noir (0,18% stocks dilué 1: 5 à 70% d'éthanol, 0,1% de phénol) pendant 30 min à 5 h. Utilisez un stéréomicroscope pour vérifier si des granules des neutrophiles ont pris la tache.
4. Effectuer une série de lavages de 5 min en commençant par un seul lavage à l'éthanol 70% suivi d'un lavage d'un rapport 1: 1 d'éthanol à 70% et du PBS, suivi par un lavage final dans du PBS.
5. Réhydrater dans PBS plus 0,1% entre (PBT).
6. Pour effacer les larves de pigment, laver à 1% d'hydroxyde de potassium / 1% de peroxyde d'hydrogène pendant environ 6-10 min. Surveiller l'échantillon Closely et après environ 5 minutes, vérifiez les larves sous un stéréomicroscope de voir combien du pigment a autorisé. Si la solution est laissée trop longtemps, les sacs vitellins se gonflent et éclatent.
7. Lavez 3 fois pendant 5 min chacune dans du PBS.
8. Conserver les échantillons dans PBS ou PBT à 4 ° C jusqu'à 1 semaine avant d'être prêt à l'image et à compter.
9. À l'image du Soudan teinté noir larves, transférer le poisson dans PBT et puis dans 80% de glycérol et placez sur une seule diapositive de la dépression de la cavité. Position fixé larves sous un stéréomicroscope en utilisant une pointe de pipette. Image en utilisant un appareil photo numérique de couleur sur un stéréomicroscope (Figure 1 Aii-iv).

8. dénombrement des bactéries viables de larves infectées

1. Euthanasier larves au moment souhaité après l'infection dans un 200-300 mg / L solution glacée de tricaïne en milieu E3.
2. Pipet euthanasié larves dans 1,7 ml tubes de centrifugation. Retirer la solution de tricaïne et les remplacer par 100 pi de 0,2%Triton X-100 dans du PBS (PBSTx).
3. Homogénéiser larves en faisant passer de haut en bas 10 fois à travers une aiguille G 27.
4. Préparer des dilutions en série de broyats dans PBS stérile. Par exemple, si la dose infectieuse est de 100 CFU, la pipette 100 ul de l'homogénat dans 900 ul de PBS stérile. Utiliser un nouvel embout de pipette, transférer 100 pi de l'homogénat dilué dans 900 pi de PBS stérile.
5. Planche 100 ul de dilutions sur gélose Columbia CNA pour l'isolement sélectif des bactéries à Gram positif et les incuber à 37 ° C pendant 48 heures. Ce milieu offrira une plus grande sélection de plaques de gélose THY P +, qui charge la croissance de bactéries gram-négatives et gram-positives.
6. Sur des plaques de moins de 500 colonies individuelles, compter le nombre de colonies et multiplier par le facteur de dilution pour déterminer le nombre d'UFC.

9. Fixation des larves for Imaging

1. Fixer les larves dans un paraformaldehyde à 4% glacé dans une solution de PBS comme ledécrit dans l'article 7.
2. A température ambiante, laver 3 fois pendant 5 min chacune dans du PBS avant l'imagerie.

10. Préparation de larves pour l'imagerie en direct

1. Préparer une solution d'agarose à bas point de fusion de 1,5% en E3 par chauffage au micro-ondes jusqu'à ce que la solution est claire.
2. Placez solution de gélose dans un bain-marie à 55 ° pour le laisser refroidir mais pas durcir.
3. Ajouter tricaïne de l'agarose à une concentration finale de 0,016%.
4. Aide d'une pipette de transfert en plastique, placez 4-5 larves anesthésiés dans un plat à fond de verre sur la scène d'un stéréomicroscope.
5. Retirez la tricaïne et solution d'agarose du bain d'eau à 55 ° C et le laisser refroidir à la température ambiante pendant 1 à 2 min. Alors que l'agarose se refroidit, retirer autant de liquide des larves anesthésié que possible.
6. Verser le agarose refroidi dans le moule jusqu'à ce que environ la moitié de la surface est couverte. Agiter le plat de répandre l'agarose. Notez que si l'agaroseest trop chaud, il va tuer les larves. En outre, si trop d'agarose est ajoutée à la boîte, la lentille d'objectif du microscope peut frapper le fond de la boîte lors de la focalisation à travers l'agarose.
7. Aide d'une pipette de transfert, ramasser les larves qui ont flotté sur les côtés du plat et pipeter les ramener vers le centre.
8. Sous la loupe binoculaire, placez doucement les larves comme vous le souhaitez avec une boucle de cheveux, une pointe de pipette long ou une tige de verre. Pour l'imagerie de la vésicule otique, positionner les larves de sorte que la vésicule otique est laissé à plat contre le fond de la boîte.
9. Laissez refroidir agarose pendant environ 10 minutes avant de passer le plat. Les larves peuvent passer positions si l'agarose ne est pas solide. Pipeter doucement certains tricaïne et la solution E3 au sommet de la couche d'agarose pour le garder humide.

11. imagerie confocale des maladies infectieuses

1. Placer le plat à fond de verre avec des larves sur la scène d'un microscope inversé avec un balayage laser confoca FV-1000Système de l.
2. Réglez le sténopé à 200-300 um et en utilisant une ouverture numérique 0,75 / 20X objectif, ensemble Z-piles avec 3-6 um tranches.
3. Utilisation balayage de ligne continu pour ajuster le gain de puissance du laser et du détecteur pour chaque canal.
4. Utilisant un balayage de ligne séquentiel pour chaque canal de fluorescence (par exemple, 488 et 543 nm) et contraste d'interférence différentiel (DIC), effectuer un film laps de temps de la vésicule otique laissé toutes les 3 min pour les 2-6 heures pour observer recrutement initial et la phagocytose par les neutrophiles et les macrophages. Pour de plus longues plages de temps, placer un couvercle sur la boîte de Pétri pour éviter l'évaporation et le dessèchement de la gélose.
5. Acquérir des images fixes de fixe (figure 1B) ou de vivre (Figure 2) larves à 20X ou 40X.

12. Photoconversion de Dendra2-leucocytes marqués à l'otique vésicules

Remarque: Dendra2 peut être photoconverted du vert au fluorescence rougeen focalisant un laser 405 nm (puissance du laser de 50 à 70% doit être suffisante) sur la région d'intérêt (ROI) pendant 1 min. Ci-dessous est le protocole étape par étape, utilisée pour le système à balayage laser confocal FV-1000:

1. Visualisez l'échantillon en utilisant un balayage z-stack avec le 488 nm et 543 nm lasers. Utilisation balayage de ligne continu pour ajuster le gain de puissance du laser et du détecteur. Assurez-vous qu'il n'y a pas fluorescence rouge accidentellement photoconverted.
2. Dans la fenêtre "Image Acquisition de contrôle", sous "Paramètres de stimulation" sélectionnez l'outil "Utiliser Scanner" et choisissez "principale". Sélectionnez le laser de 405 nm et le fixer à 70% de la puissance. Utilisation de l'option de cercle, définir le ROI dans la vésicule otique.
3. Sous la rubrique «Réglage de stimulation Démarrer", sélectionnez "Activation en série" avec un pré-activation de 1 cadre et un temps d'activation de 60 000 ms. Dans la fenêtre "Réglage acquisition» dans le cadre du "Temps de Scan rubrique«, choisissez 2intervalles de 00:01:00 (un pour avant et une pour photoconversion post).
   Remarque: Après le temps de balayage de la série de déchéance est complète, le Dendra2 aurait été photoconverted à son état rouge fluorescent.
4. Balayer l'échantillon par une z en utilisant la pile 488 nm et 543 nm lasers pour visualiser la fluorescence rouge photoconverted ainsi que toute fluorescence verte restante (figure 3).

Résultats

Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l'hôte initialement localisée. Lorsqu'elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées,...

Discussion

La méthode d'infection utilisé ici est utile pour l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d'un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l'étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l'injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 ml Eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml Falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x ½ in. needle	BD Biosciences	305109
96-well Plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser scanning confocal microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144