先天免疫反应中的斑马鱼幼体型号无创成像<em&gt;链球菌iniae</em&gt;感染

摘要

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

摘要

水生病原体， 链球菌iniae，负责超过100亿美元的损失每年用于水产养殖业和能够引起全身性疾病在鱼类和人类。更好地理解S. iniae疾病的发病机制，需要一个合适的模型系统。遗传易处理性和斑马鱼的早期发育阶段的光学透明度允许对转基因品系的产生和非侵入性的成像用荧光标记的免疫细胞。适应性免疫系统不完全功能，直到数周后受精，但斑马鱼幼体有一个保守的脊椎动物先天性免疫系统与两个中性粒细胞和巨噬细胞。因此，幼虫感染模型的生成允许的先天免疫控制S.的具体贡献的研究iniae感染。

注射的部位将决定感染是否全身或局部开始。在这里，我们提出我们的协议耳泡注射的斑马鱼时效2-3天受精后，以及我们的技术感染荧光共焦成像。本地化感染部位可观察初始微生物入侵，招募宿主细胞和传播感染。使用S的斑马鱼幼体模型我们的研究结果iniae感染表明斑马鱼可用于检查主机嗜中性粒细胞和巨噬细胞在局部细菌感染的不同的贡献。此外，我们将描述如何免疫细胞photolabeling可用于感染过程期间跟踪单个宿主细胞的命运。

引言

链球菌iniae是一个主要的水生病原体，其能够引起全身性疾病在两个鱼和人^1。而S. iniae负责的水产养殖业巨大损失，这也是一个潜在的人畜共患的病原体，能够与类似的其他引起链球菌人类病原体的临床病症引起的疾病免疫功能低下的人类宿主。鉴于其相似性与人类的病原体，它来研究S.是非常重要的在天然宿主的上下文iniae疾病的发病机制。 S的 ​​成年斑马鱼模型iniae感染揭示宿主白细胞向感染的局部部位，以及一个快速时间来承载死亡健壮浸润，时间太短，涉及适应性免疫系统^7。为了获得一个深入的研究，以S.先天性免疫应答iniae感染在体内 ，有必要使用一个模型，该模型是更适合为n对创实时成像。

幼虫斑马鱼具有许多优点，使得它越来越具有吸引力脊椎动物模型用于研究宿主 - 病原体相互作用。斑马鱼是相对便宜且易于使用和维护相比哺乳动物模型。适应性免疫并不功能成熟之前4-6周受精后，但幼虫具有高度保守的脊椎动物先天免疫系统与补体，Toll样受体，细胞因子，和嗜中性粒细胞和巨噬细胞具有抗微生物功能，包括吞噬作用和呼吸爆发^{2-6 8-11。}此外，遗传易处理性和发展的胚胎和幼虫阶段的光学透明性允许对稳定的转基因品系的产生与荧光标记的免疫细胞使得能够检查实时体内宿主-病原体相互作用。使用photoconvertible蛋白质，这些转基因品系，如书房的产生dra2允许单个宿主细胞的起源和命运的超过¹²感染的过程中的跟踪。

当开发一个斑马鱼幼体感染模型，显微注射的选址将确定是否感染最初是局部或全身。全身血液感染入尾静脉或居维叶的导管是最常用的研究微生物病原体在斑马鱼和可用于研究在病原体菌株之间的毒力的主机和微生物细胞，细胞因子应答，和差之间的相互作用是有用的。对于生长较慢的微生物，早期注入的胚胎在16-1,000细胞阶段的卵黄囊可用于产生全身感染^13,14，具有最佳的发育阶段对发现是间生长缓慢的微生物的显微注射在16到128细胞阶段^15。但是，蛋黄许多微生物囊注射，以后主机的发展阶段往往是致命的吨他主持由于对白细胞浸润^16-18的微生物和缺乏营养丰富的环境。

本地化感染通常会导致对感染的部位，可以很容易量化以非侵入性成像的白细胞的定向迁移。这种类型的感染可以允许介导白细胞迁移以及各种白细胞群体的不同迁移和吞噬能力调查机制的解剖。局部感染也是有用的研究中的细菌菌株的毒力之间的差异时，以及研究微生物入侵机制，因为物理主机的障碍必须越过为一个局部感染，成为全身。斑马鱼通常升高的温度下25-31℃的^19，但它们也可以被保持在温度高达34-35℃的某些人类病原体侵袭的严格的温度要求的研究毒力^20，21。

许多不同的位点已被用来产生一个初始局部细菌感染包括后脑心室^22，背侧尾肌^18，心包腔²³和耳泡（耳^{）5，16，24。}然而，已经发现，注射细菌进入尾肌可造成组织损伤的细菌中，当调查白细胞响应¹³可能扭曲的结果的和炎症独立。虽然少损伤与注入到相关的后脑，虽然它最初是在缺乏幼胚白细胞，后脑脑室稳步随着时间的推移获得更多的免疫细胞为小胶质细胞定居。后脑心室也是比较困难的位置到图像。耳囊是一个封闭的空腔，没有直接进入脉管^25,26。它通常是缺乏列伊kocytes，但白细胞可以响应于炎症刺激如感染被招募到耳泡。它也是细菌微量注射在斑马鱼老化2-3天受精后，因为成像的易用性和喷射的可视化（dpf）的一个优选的位点。因此，我们选择了耳泡作为我们本地化细菌感染的部位。

研究方案

成人和胚胎斑马鱼维持在按照威斯康星大学麦迪逊分校的研究动物资源中心的大学。

1.准备显微注射针

1. 在拉5，空气时开始的空气压力200，热量502，拉90，速度80，时间70，广播时间:准备使用微量牵引装置具有以下设置的薄壁玻璃毛细管注射针晶（1.0 OD / 0.75的ID）在拉5月底。
2. 使用细镊子，断绝拉到针的尖端，以使顶端开口的直径为大约10微米。

2.准备幼虫注射菜

1. 冲洗凝胶梳子约为4-5毫米的无菌水车道宽度并晾干。
2. 准备在E3的介质¹⁹和微波炉的1.5-2％的高熔体琼脂糖溶液，直至溶液澄清。一旦冷却，倒入一些琼脂糖到培养皿（100×15毫米）和漩涡，加入足够的琼脂糖完全覆盖培养皿底部。
3. 一旦琼脂糖层已经凝固，将漂洗并干燥凝胶梳子上顶，以使非精梳端只是搁置在培养皿的顶部和梳理端正在触摸琼脂糖。确保梳子是尽可能的水平，创造了30°角相对于所述底部琼脂糖层。
4. 倾额外少量琼脂糖在梳子和底部琼脂糖层之间的界面，以使新鲜的琼脂糖层覆盖所述梳状的孔中。允许取出梳子之前完全冷却。用枪头，从水井中删除任何悬垂件琼脂糖。
5. 倒在4℃下在注塑模具及商店的顶部E3介质。
6. 每次使用前，更换新鲜培养基和温暖注入坡道在28.5°C，至少注射前一小时。
7. 立即注射之前，取代E3上的注射用斜含有200微克/ ml的3-氨基苯甲酸甲酯（三卡因）的E3介质。

3.准备S. iniae接种

1. 准备并高压灭菌补充有0.2％酵母提取物和2％蛋白胨（THY + P）托德Hewitt肉汤培养基:30g / L的托德休伊特，2克/升酵母提取物，将20g / L的蛋白胨。对琼脂平板，加14克/ L琼脂。
2. 夜感染吹打冷冻细菌库存100微升等分试样到10ml，THY + P肉汤在密封的15ml试管之前准备的细菌培养物。孵育过夜不用搅拌，在37℃。经过14-16小时的增长，使用过夜培养既可以使冷冻股票或在注射使用做准备。
3. 通过将1毫升在500μl80％的甘油的过夜培养物在1.7毫升离心管使冷冻储存。为了避免反复冻融，从该混合并储存在-80℃下使100μl的一次性使用的等分试样。
4. 对于S. iniae用于infecti通过加入0.1过夜培养毫升100 10毫升培养的总体积为9.9，TH​​Y + P肉汤毫升:项，稀释过夜培养1。成长在37°C时不搅拌约4-5小时。监测使用NanoDrop分光光度计的光密度（OD）在600nm和收获细菌在中期对数生长期时，OD 600 nm的到达0.250-0.500。为0.250的OD 600毫微米相当于约10 ⁸个菌落形成单位（CFU）/毫升。
5. 沉淀将1ml细菌培养物在1.7毫升离心管中，在1500×g离心5分钟。重悬在1ml新鲜的PBS并重复。测量细菌在PBS的OD 600纳米，沉淀，重悬在PBS中以达到所需的浓度。
6. 为了帮助在显微注射的可视化，事先添加酚红对细菌悬浮液以注射为0.1％的最终浓度。
7. 对于涉及在注射热灭活细菌的实验中，加热该细菌在PBS中在95℃下进行30分钟。确认热杀死过程由固体，T​​HY + P琼脂板上电镀的注射体积（大约1 NL）中并在37℃温育过夜减压活菌到检测不到的水平的数目。

4.标签S. ËINIA用CellTracker红色荧光染料

1. 标记活细菌细胞，制备CellTracker荧光染料或等效的储液。作为所使用的染料来在20×50微克等份粉末，需要在DMSO中进行重新悬浮，微升DMSO中添加7.3到管以得到10mM的储备浓度。
2. 测试一系列浓度的染料（ 例如，0.5-25μM）上的细菌，以确定污渍的细胞的最低最佳浓度。快速分裂的细胞和更长的实验可能需要染料的浓度较高。
   1. 上述（第3节）所描述的颗粒1.0毫升细菌培养在1.7毫升管离心。悬浮在1球毫升新鲜的PBS，并添加染料的适当体积的细菌培养物。
   2. 孵育不搅拌，在37℃下进行30分钟。降速的细菌重悬在1ml预热THY + P肉汤孵育不搅拌另外30分钟，在37℃。
   3. 降速的细菌和测量OD600纳米及以上的（第3节）详见稀释细菌注射前，在PBS洗两次。我们通常注入约100 CFU 1 NL注射量为白细胞招聘和吞噬的研究。

5.准备斑马鱼幼虫的感染

1. 之前设置了繁殖对夜间和所描述的罗森等²⁷孵育胚胎在E3中在28.5°C，直到准备感染收集胚胎。
2. 对于斑马鱼，将被成像，防止颜料（黑化）的开发中加入N-二苯基硫脲（PTU）的E3的培养基中于24小时受精后（HPF）为0.2纳米的最终浓度。
3. 对于涉及胚胎感染2岁旦，dechorionate胚胎一双细镊子手动。可替代地，dechorionate胚胎通过去除E3和用链霉蛋白酶（2毫克/毫升）约5分钟，或直至轻柔吹打替换破坏的胚胎从绒毛膜。大部分幼虫自然应该由3 DPF孵化。
4. 通过将dechorionated幼虫到含有200微克/毫升三卡因E3介质麻醉斑马鱼几分钟之前感染。

6.耳泡注射液S. iniae进入第三天高龄幼虫

1. 打开微量，并设定​​时间范围为"毫秒"。打开对二氧化碳罐阀让气体进入线。该微量的压力应为大约20 PSI。由黑色圆形旋钮为增量的顺时针转动调节在微量单元中的压力缓解压力或逆时针旋转的下降压力。
2. 涡准备S.在酚红和PBS，并使用微加载提示iniae文化装载2-3微升培养成一把拉住毛细管注射针头。
3. 安装在连接到立体显微镜下一个磁性支架并将其定位显微加载针，使针是在约一45-65°的角度相对于所述显微镜的基极。
4. 按微量的脚踏上以分配一滴接种到针的尖端。测量使用在显微镜的目镜比例尺下降的直径。
   1. 可替代地，通过注射体积为矿物油对带有标尺条的玻璃显微镜载玻片一滴估算滴的直径。液滴的直径应为约0.10mm，大约是一个1 NL体积。
   2. 通过调整时间设定在调整墨滴大小的微量或通过剪切掉更多针尖细镊子。需要注意的是喷射时间应在20 - 35毫秒，以避免造成过多的组织损伤。
5. 使用塑料移液管，移12麻醉幼虫放入注射模具的每个孔中。
6. 使用玻璃棒，毛发循环，或塑料尖端轻轻地定位幼虫，使磁头指向朝向显微镜和卵黄囊的背面是对井的左侧。点朝天花板幼虫了左耳。
7. 期待通过立体显微镜的目镜中，使用在显微旋钮排队装入针与耳泡，使得两者都在同一视场。皮尔斯的耳泡与针尖的外皮层，以使针尖仅仅是囊泡内部。
8. 按下脚踏上注入1 NL S的所需剂量的iniae。请务必使用足够低的压力，以便不破裂空腔。如果注射是成功的，耳泡，但不是周围组织，应填写与酚红接种（ 图1艾 ）。立即从注射板删除任何错误注入鱼。
9. 仔细缩回针从幼虫和用手移动喷射板，以使下一个幼虫是图。这样做在放大5倍。
   注意:在针的回缩可能导致耳泡的外一些细菌，其可以歪斜存活和白细胞募集的结果的沉积。为了避免这种情况，建议注入荧光色素标记的细菌和视觉扫描荧光显微镜下注射的幼虫以除去其中这已发生的任何幼虫。一个正确的注射幼虫所示（ 图1碧 ）。
10. 为了确保注射体积/接种物保持不变在实验的过程中，注入一滴细菌的Suspension到含有100微升无菌PBS的每48 ^个胚胎后1.7毫升离心管中。板中的100μl的上，THY + P琼脂平板在37℃下过夜，以确定在注射体积的CFU。
11. 当12幼虫在注射坡道的整个集团已经注入，小心使用塑料移液管从井中取出幼虫，并放置到一个新的培养皿（35×10 ^平方毫米）。取下三卡因溶液，并用约新鲜E3媒体2毫升取代，让幼虫恢复。
12. 吸管注入幼虫成单个孔96孔板的孵育在28.5℃。监测幼虫随着时间的推移生存在这些板块或更高版本的成像或CFU计数删除。

中性粒细胞7.苏丹黑染色

注意:下面的步骤可以在室温下在定轨振荡器，除非OT进行在小培养皿（35×10mm的^2）herwise说明。对于每个步骤，试剂的使用量是约每皿2毫升，使用刚好足够的液体，以完全覆盖幼虫。

1. 对受感染的幼虫的​​固定，使用玻璃巴斯德吸管除去E3介质，并替换为在PBS溶液中的冰冷却的4％多聚甲醛。立即将鱼在4℃安乐死。修复一夜之间在4℃。
2. 在PBS，每次5分钟洗涤3次。
3. 染色用苏丹黑（0.18％库存1:5稀释在70％的乙醇，0.1％苯酚）处理30分钟至5小时。使用立体显微镜来检查，如果中性粒细胞颗粒扛起了污点。
4. 执行一系列的5分钟洗涤开始在70％乙醇中的单次洗涤之后的1的单一洗涤:1的比例70％乙醇和PBS，随后在PBS中进行最后的清洗。
5. 再水合到PBS加0.1％吐温（PBT）。
6. 以清除颜料从幼虫，洗净，以1％的氢氧化钾/ 1％的过氧化氢为约6-10分钟。监测样本closely和大约5分钟后，检查在立体显微镜下的幼虫，看看颜料多已被清除。如果溶液被留在过长，卵黄囊会膨胀和爆裂。
7. 在PBS中洗涤3次，每次5分钟。
8. 储存在PBS或PBT样品在4℃下长达1周，直到准备图像和计数。
9. 图像苏丹黑染色幼虫，鱼转移到PBT，然后到80％的甘油，并放置到一个单腔抑郁症的幻灯片。位置固定下使用移液管尖端的立体显微镜幼虫。图像使用彩色数码相机立体显微镜（ 图1 AII-IV）。

8.枚举从受感染的幼虫活菌

1. 安乐死幼虫在所需时间感染后在E3的介质冰冷200-300毫克/升三卡因溶液。
2. 吸管安乐死幼虫进入1.7毫升离心管。除去三卡因溶液和替换用100μl的0.2％TRITON X-100的PBS（PBSTx）。
3. 通过一个27G的针头上下传球10次均质幼虫。
4. 准备在无菌PBS匀浆的系列稀释。例如，如果感染剂量为100 CFU，吸管100微升匀浆入900微升无菌PBS中。使用新的枪头，转移100微升稀释的匀浆到900微升无菌PBS。
5. 板100微升哥伦比亚CNA琼脂为革兰氏阳性菌的选择性分离的稀释液，孵育在37℃下48小时。此介质将提供更大的选择比，THY + P琼脂板上，这将同时支持革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长。
6. 在平板上少于500单个菌落，计数菌落数并乘以稀释因子相乘以确定CFU数量。

9.固定幼虫成像

1. 修正的幼虫在PBS溶液作为去冰 - 冷的4％多聚甲醛划在第7。
2. 在室温下，在成像前洗3次，每次5分钟的PBS。

10.准备幼虫的实时成像

1. 制备1.5％低融点琼脂糖中的E3通过加热溶液在微波中，直至溶液澄清。
2. 将在55℃水浴琼脂糖溶液，使其冷却，但不会变硬。
3. 添加三卡因到琼脂糖的0.016％的最终浓度。
4. 用塑料移液管，放置4-5麻醉幼虫在一个立体的舞台玻璃底菜。
5. 除去从55℃水浴中的三卡因和琼脂糖溶液，让它冷却，在室温下搅拌1-2分钟。而琼脂糖冷却，从被麻醉的幼虫尽可能除去尽可能多的液体。
6. 倒入冷却的琼脂糖放入盘中，直到大约一半的表面被水覆盖。摇动盘传播的琼脂糖。需要注意的是，如果琼脂糖太热，它会杀死幼虫。此外，如果过多琼脂糖加入到皿中，在显微镜的物镜可以通过琼脂糖聚焦时击中培养皿的底部。
7. 用移液管，拿起那些漂浮在盘子的两侧的幼虫和吸管它们放回中心。
8. 根据体视显微镜，根据需要用吹风环路，长枪头或玻璃棒轻轻放置幼虫。用于耳泡的成像，定位幼虫，使得左耳泡是平贴在培养皿的底部。
9. 让琼脂糖冷却约10分钟，移动盘之前。幼虫可移仓，如果琼脂糖并不牢固。轻轻吸管一些三卡因和E3溶液到琼脂糖层的顶部，以保持湿润。

感染11.共聚焦成像

1. 放置玻璃底皿幼虫到倒置显微镜具有FV-1000激光扫描confoca的阶段升系统。
2. 针孔设定为200-300微米，使用数值孔径0.75 / 20X物镜，设置Z轴堆叠具有3-6微米的切片。
3. 使用连续扫描线来调整激光功率和检测器的增益为每个通道。
4. 使用顺序逐行扫描每个荧光通道（ 例如，488和543纳米）和微分干涉对比（DIC），进行左侧耳泡的时间间隔电影每3分钟2-6小时，观察初始招聘和吞噬中性粒细胞和巨噬细胞。对于较长的时间进程，放置在培养皿的盖以防止蒸发和干燥从琼脂糖。
5. 收购仍是固定的（ 图1B）的图像或生活（ 图2），在幼虫或20X 40X的放大倍率。

12.光转化Dendra2标记的白细胞在耳泡

注:Dendra2可以从绿色将光转换为红色荧光通过聚焦405nm激光（50-70％的激光功率应足以）上的感兴趣区域（ROI）的区域，持续1分钟。下面是一步一步协议用于FV-1000激光扫描共聚焦系统:

1. 使用Z堆栈扫描与488 nm和543 nm激光可视化的样本。使用连续扫描线来调整激光功率和检测器的增益。检查以确保没有不小心光转换红色荧光。
2. 在"图像采集控制"窗口，"刺激设置"下，选中"使用扫描仪"工具，然后选择"主"。选择405 nm激光，并定于70％的电力。使用循环选项，定义投资回报率在耳泡。
3. 在"刺激开始设置"中选择1帧的预激活和60000毫秒的激活时间"激活串联"。就在"获取设置"窗口中的"时间扫描标题"，选择2的0时01分00秒（一个用于前和一个用于光转化后）tervals。
   注意:时间经过一系列扫描完成后，将Dendra2应已光转换到其红色荧光的状态。
4. 通过使用488纳米和543纳米激光器的可视化的光转换的红色荧光以及任何剩余的绿色荧光（ 图3）的Z堆叠扫描样品。

结果

S的 ​​显微注射iniae进入耳泡（ 图1和图2）的结果的初始局部宿主反应。当正确地注入，细菌只应被看作在耳泡而不是在周围组织或血液。这可显微注射过程中使用的酚红染料（ 图1A）被可视化。另外，如果标记的细菌注射，感染幼虫的快速扫描立即注射后可以确认菌仅在耳泡而不是周围的组织（ 图1B）。虽然低至10 CFU野生型S....

讨论

此处所用的感染的方法是用于在2-3旦胚胎和幼虫的初始局部感染宿主的免疫应答的研究是有用的。炎症刺激，如感染，在一个封闭的腔体的焦点，如耳泡允许对嗜中性粒细胞和巨噬细胞趋化及吞噬的研究。注入细菌进入耳泡的一个需要注意的是中性粒细胞的能力，以有效地吞噬细菌在填充流体的腔可以依赖于特定的微生物。尽管大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 ，不容易通过在耳泡²⁸

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 ml Eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml Falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x ½ in. needle	BD Biosciences	305109
96-well Plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser scanning confocal microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144