הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

הפתוגן המימי, Streptococcus iniae, אחראי ליותר מ -100 מיליון דולרים בהפסדים שנתי לתעשיית החקלאות הימית ומסוגל לגרום למחלה מערכתית בשני דגים ובני אדם. הבנה טובה יותר של ס ' היווצרות המחלה iniae דורשת מערכת מודל מתאימה. נְהִילוּת הגנטית והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות המוקדמים של דג הזברה מאפשרות ההדמיה הדור ולא פולשנית של קווים מהונדסים עם fluorescently מתויג תאי מערכת חיסון. המערכת החיסונית אדפטיבית אינה מתפקדת באופן מלא עד מספר שבועות לאחר הפריה, אבל יש לי זחלי דג הזברה מערכת חיסון מולדת חוליות נשמרים עם שני נויטרופילים ומקרופגים. כך, הדור של מודל זיהום זחל מאפשר הלימוד של התרומה הספציפית של מערכת חיסון מולדת בשליטה S. זיהום iniae.

האתר של microinjection יקבע אם זיהום הואמערכתי או מקומי בתחילה. כאן, אנו מציגים הפרוטוקולים שלנו להזרקת otic שלפוחית ​​של 2-3 ימים לאחר הפריה בגיל דג הזברה, כמו גם הטכניקות שלנו להדמית confocal ניאון של זיהום. אתר זיהום מקומי מאפשר תצפית של פלישת חיידק ראשונית, גיוס של תאי מארח והפצה של זיהום. הממצאים שלנו תוך שימוש במודל זחל דג הזברה של ס ' זיהום iniae מצביע על כך שדג זברה יכולה לשמש כדי לבחון את התרומות השונות של נויטרופילים ומקרופגים מארח בזיהומים חיידקיים מקומיים. בנוסף, אנו מתארים כיצד photolabeling של תאי מערכת חיסון יכול לשמש כדי לעקוב אחר גורל תא מארח בודד במהלך הזיהום.

Introduction

Streptococcus iniae הוא פתוגן המימי גדול, כי הוא מסוגל לגרום למחלות מערכתיות בשני דגים ובני אדם ^1. בעוד ש ' iniae אחראי להפסדים גדולים בתעשיית החקלאות הימית, הוא גם פתוגן zoonotic פוטנציאלי, מסוגל לגרום למחלה באדם מארחי מדוכאי חיסון עם פתולוגיות קליניות דומות לאלו הנגרמים על ידי פתוגנים אנושיים סטרפטוקוקלי אחרים. בהתחשב בדמיון שלה עם פתוגנים אנושיים, חשוב ללמוד S. היווצרות המחלה iniae בהקשר של מארח טבעי. מודל דג הזברה מבוגרת של ס ' זיהום iniae חשף חדירה חזקה של לויקוציטים מארח לאתר המקומי של זיהום, כמו גם זמן מהיר לארח מוות, זמן קצר מדי כדי לערב את המערכת החיסונית אדפטיבית ^7. כדי לזכות במבט מעמיק לתוך התגובה החיסונית המולדת S. iniae זיהום in vivo, יש צורך להשתמש במודל שהוא יותר נוח לnעל-פולשני הדמיה לחיות.

יש דג הזברה הזחל מספר היתרונות שהופכים אותו מודל חוליות אטרקטיבי יותר ויותר ללימוד אינטראקציות מארח הפתוגן. דג הזברה היא יחסית זולה וקלים לשימוש ולתחזוקה בהשוואה לדגמים של יונקים. החסינות מסתגלת היא לא פונקציונלי בוגרת עד 4-6 שבועות לאחר הפריה, אבל יש לי זחלי מערכת חיסון מולדת חוליות השמורות ביותר עם ​​השלמה, Toll-like receptors, ציטוקינים, ונויטרופילים ומקרופגים עם יכולות מיקרוביאלית כולל phagocytosis ופרץ הנשימה ^{2-6, 8-11.} בנוסף, נְהִילוּת הגנטית והשקיפות אופטית של השלבים העובריים וזחל של פיתוח לאפשר לדור של קווים מהונדסים יציבים עם תאים חיסוניים שכותרתו fluorescently כך שניתן לבחון אינטראקציות מארח הפתוגן בזמן אמת in vivo. הדור של קווים מהונדסים אלה באמצעות חלבון photoconvertible כגון Dendra2 מאפשר מעקב ממוצא תא מארח וגורל אדם במהלך הזיהום ^12.

בעת פיתוח מודל זיהום זחל דג הזברה, האתר הנבחר של microinjection יקבע אם זיהום הוא בתחילה מקומי או מערכתי. זיהומי דם מערכתיים לוריד הזנב או Duct של קיביה הם נפוצים ביותר ללמוד פתוגנים חיידקים בדג זברה ושימושיים לחקר אינטראקציות בין מארח ותאי חיידקים, תגובות ציטוקינים, והבדלים בארסיות בין זני הפתוגן. למיקרואורגניזמים צומחים לאט יותר, הזרקה מוקדם לצק החלמון של עובר בשלב 16-1,000 התא יכולה לשמש כדי ליצור זיהום מערכתי ^13,14, עם השלב ההתפתחותי האופטימלי עבור microinjection של מיקרואורגניזם גדל לאט מצא להיות בין שלב 16-128 תא ^15. עם זאת, חלמון זריקות שק של חיידקים רבים בשלבים מאוחר יותר של התפתחות מארח נוטה להיות קטלני לtהוא יארח בשל הסביבה עשירה בחומרים המזינים לחיידקים וחוסר חדירה לויקוציטים ^16-18.

זיהום מקומי גורם בדרך כלל להגירה בבימויו של לויקוציטים לאתר של זיהום שניתן לכמת בקלות עם הדמיה לא פולשנית. סוג זה של זיהום יכול לאפשר לנתיחה של המנגנונים אשר מתווכים הגירה לויקוציטים, כמו גם חקירה של יכולות נדידה וphagocytic שונות של אוכלוסיות שונות לויקוציטים. זיהומים מקומיים שימושיים גם כאשר בוחנים הבדלים בארסיות בין זני חיידקים, כמו גם לימוד מנגנוני פלישת חיידק מאז מחסומי מארח פיזיים צריכים לעבור לזיהום מקומי להפוך מערכתי. דג הזברה גדלות בדרך כלל בטמפרטורות של C ° 25-31 ^19, אבל הם גם יכולים להישמר בטמפרטורות גבוהות ככל C ° 34-35 ללימודים של הפולשנות של פתוגנים אנושיים מסוימים עם דרישות קפדניות טמפרטורהלארסיות ^{20, 21.}

אתרים רבים ושונים המשמשים ליצירת זיהום חיידקים בתחילה מקומי כוללים החדר למוח האחורי ^22, שרירים גב זנב ^18, חלל קרום הלב ^23, ושלפוחית ​​otic (אוזן) ^{5, 16, 24.} עם זאת, זה כבר נמצא הזרקה של חיידקים לתוך שריר זנב יכול לגרום נזק לרקמות ועצמאי דלקת של החיידקים, שעלול להטות את תוצאות כאשר חוקרים תגובה לויקוציטים ^13. למרות שפחות נזק קשור להזרקה למוח האחורי ולמרות שזה בהתחלה נטול לויקוציטים בעוברים צעירים, החדר למוח האחורי בהתמדה זוכה תאים חיסוניים יותר לאורך זמן כמו מיקרוגליה להשתכן. החדר למוח האחורי הוא גם מיקום קשה יותר לתמונה. שלפוחית ​​otic היא חלל חלול סגור ללא גישה ישירה למערכת כלי הדם ^{25, 26.} זה בדרך כלל נטול Leukocytes, אבל leukocytes ניתן לגייס לשלפוחית ​​otic בתגובה לגירויים דלקתיים כגון דלקת. כמו כן, אתר מועדף של microinjection של חיידקים בתוך 2-3 ימים לאחר הפריה דג הזברה גיל (DPF) בגלל הקלות של הדמיה ויזואליזציה של ההזרקה. לכן, בחרנו שלפוחית ​​otic כאתר של זיהום חיידקים המקומי שלנו.

Protocol

דג הזברה מבוגר והעוברי נשמרה בהתאם לאוניברסיטה ויסקונסין-מדיסון מחקר משאבי בעלי החיים המרכז.

1. הכנת Microinjection מחטים

1. הכן מחטים דק קיר הזרקת נימי זכוכית (OD 1.0 / 0.75 ID) באמצעות מכשיר חולץ micropipette עם ההגדרות הבאות: לחץ אוויר 200, חום 502, משוך 90, מהירות 80, 70 פעם, זמן אוויר בתחילת משיכה 5, זמן אוויר בסופו של משיכה 5.
2. באמצעות פינצטה בסדר, לנתק את קצה המחט משכה כך שפתיחת טיפ יש קוטר של כ -10 מיקרומטר.

2. מנות הזרקת הכנת הזחל

1. יש לשטוף מסרק ג'ל עם רוחב נתיב של כ 4-5 מ"מ במים סטריליים ולאפשר לו להתייבש.
2. הכן פתרון agarose גבוה להמיס 1.5-2% במדיום E3 ¹⁹ ומיקרוגל עד הפתרון הוא ברור. , ברגע שהתקרר לשפוך חלק מagarose לתוך צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) ומערבולת,להוספה מספיק agarose לכסות לחלוטין את תחתית הצלחת.
3. ברגע ששכבת agarose יש הקרושה, למקם את מסרק ג'ל השטוף ומיובש על גבי כך שהסוף-מסורק שאינו רק מונח על גבי צלחת פטרי וסופו של הדבר מסורק נוגע agarose. ודא שהמסרק הוא אופקי ככל האפשר, יצירת זווית של 30 מעלות ביחס לשכבת agarose התחתונה.
4. יוצקים כמות קטנה נוספת של agarose בממשק שבין מסרק ושכבת agarose תחתון, כך ששכבת agarose הטרי מכסה את הבארות של המסרק. אפשר להתקרר לחלוטין לפני הסרת מסרק. באמצעות קצה pipet, להסיר כל חתיכות תלויה של agarose מהבארות.
5. יוצקים בינוני E3 על גבי עובש ההזרקה ולאחסן ב 4 ° C.
6. לפני כל שימוש, להחליף עם רמפות בינוניות והזרקה חמה טריות על 28.5 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות לפני ההזרקה.
7. מייד לפני זריקות, להחליף את E3 על רמפת ההזרקה עםבינוני E3 המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר אתיל 3-aminobenzoate (tricaine).

3. הכנת S. iniae הבידוד

1. הכן וחיטוי בינוני מרק טוד יואיט בתוספת 0.2% תמצית שמרים ו -2% peptone proteose (THY + P): 30 g / L טוד יואיט, 2 גרם תמצית שמרי L /, peptone proteose 20 g / L. לצלחות אגר, להוסיף אגר / L 14 גרם.
2. הכן תרבויות חיידקים בלילה שלפני זיהומים על ידי pipetting aliquot 100 μl של מניית חיידקים קפואה לתוך 10 מיליליטר של מרק THY + P בצינור מיליליטר 15 אטומים. דגירה הלילה ללא תסיסה על 37 מעלות צלזיוס. לאחר 14-16 שעות של צמיחה, להשתמש בתרבות הלילה או לעשות מניות מקפיא או להכין לשימוש בזריקות.
3. הפוך מניות מקפיא על ידי הצבת 1 מיליליטר של תרבות הלילה ב 500 μl של גליצרול 80% בצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות. כדי להימנע להקפיא להפשיר מחזורים, לעשות aliquots אחד-שימוש 100 μl מזה תערובת ולאחסן ב -80 ° C.
4. לS. iniae משמש בinfectiתוספות, לדלל את תרבות הלילה 1: 100 להיקף כולל של תרבות 10 מיליליטר על ידי הוספת 0.1 מיליליטר של תרבות לילה 9.9 מיליליטר של מרק THY + P. לגדול ב 37 ° C, ללא תסיסה במשך כ 4-5 שעות. לפקח על הצפיפות האופטית (OD) ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop ולאסוף את החיידקים בשלב אמצע לוגריתמים כאשר OD600 ננומטר מגיע .250-.500. ננומטר OD600 של 0.250 מתאים לכ 10 ⁸ יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מיליליטר.
5. גלולה 1 מיליליטר של תרבית החיידקים בצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 1 מיליליטר של PBS וחזור טריים. מדוד את ננומטר OD600 של החיידקים בPBS, גלולה, וגלול בPBS כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
6. כדי לסייע בהדמיה של microinjection, להוסיף פנול האדום להשעיות חיידקים לפני זריקה לריכוז סופי של 0.1%.
7. לניסויים הכוללים הזרקה של חיידקים-נהרג חום, לחמם את החיידקים בPBS על 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.ודא שתהליך הרג-החום הפחית את מספר חיידקי קיימא לרמות בלתי ניתנות לגילוי על ידי ציפוי נפח הזרקה (nl כ 1) על THY המוצק + צלחות אגר P ודוגר לילה בשעה 37 ° C.

4. התיוג S. דואר inia עם CellTracker האדום פלורסנט דיי

1. לתייג תאי חיים חיידקים, להכין פתרון מניות של צבע פלואורסצנטי CellTracker או שווה ערך. כצבע המשמש מגיע ב 20 x 50 מיקרוגרם aliquots של אבקה וצריך להיות resuspended ב DMSO, להוסיף 7.3 μl DMSO לצינור להשיג ריכוז מניית 10 מ"מ.
2. בחן את הטווח של ריכוזי צבע (למשל, מיקרומטר 0.5-25) בחיידקים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי הנמוך ביותר שמכתים את התאים. תאים המתחלקים במהירות וניסויים כבר עשויים לדרוש ריכוז גבוה יותר של צבע.
   1. גלולה 1.0 מיליליטר של תרבית חיידקים בצינור 1.7 מיליליטר על ידי צנטריפוגה כפי שתואר לעיל (סעיף 3). Resuspend גלולה ב 1מיליליטר PBS הטרי ולהוסיף הנפח המתאים של צבע לתרבות החיידקים.
   2. דגירה ללא תסיסה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ספין למטה החיידקים וגלולים ב 1 מיליליטר של מרק THY + P מחומם מראש דגירה ללא תסיסה ל-30 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס.
   3. ספין למטה החיידקים ולשטוף פעמיים בPBS לפני מדידת ננומטר OD600 ודילול החיידקים לmicroinjection כפי שפורט לעיל (סעיף 3). אנחנו בדרך כלל להזריק 1 NL נפח הזרקה כ 100 CFU ללימודים של גיוס לויקוציטים וphagocytosis שלנו.

5. הכנת דג הזברה זחלים לזיהומים

1. הגדרת זוגות רבייה בלילה שלפני ולאסוף עובר כפי שתואר על ידי רוזן et al. ²⁷ עוברי דגירה במדיום E3 על 28.5 מעלות צלזיוס עד מוכן להדביק.
2. לדג זברה שיהיה צילם, למנוע ההתפתחות של פיגמנט (melanization) על ידי הוספת N-Phenylthiourea (PTU) לבינוני E3 ב 24 שעות שלאחר הפריה (hpf) לריכוז סופי של 0.2 ננומטר.
3. לזיהומים מעורבים עוברים בגילי 2 DPF, עובר dechorionate ידני עם פינצטה בסדר. לחלופין, עובר dechorionate על ידי הסרת E3 והחלפה עם pronase (2 מ"ג / מיליליטר) במשך כ 5 דקות או עד pipetting העדין שובר עוברים מתוך סיסית. רוב הזחלים צריכים בקעו באופן טבעי על ידי 3 DPF.
4. הרדימי כמה דקות דג הזברה לפני הדבקה על ידי הצבת זחלי dechorionated לתוך מדיום E3 המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר tricaine.

הזרקת 6. otic שלפוחיות של ס ' iniae לשלושה ימים ישן זחלים

1. הפעל את microinjector ולהגדיר את טווח הזמן ל" אלפית שנייה ". פתח את השסתום על טנק פחמן דו חמצני לתת גז לתוך הקו. הלחץ של microinjector צריך לקרוא כ 20 PSI. התאם את הלחץ ביחידת microinjector ידי מפנה בכיוון השעון של הידית המחורצים השחורה לאינקרהוקל לחץ או נגד הפיכה ללחץ ירד.
2. מערבולת S. מוכן תרבות iniae בפנול האדום וPBS ולהשתמש קצה microloader לטעון 2-3 μl של התרבות לתוך מחט זריקת נימים משכה.
3. הר המחט נטענת על micromanipulator המחובר למעמד מגנטי ומקם אותה תחת סטראו כך המחט היא בזווית של כ 45-65 מעלות ביחס לבסיס של המיקרוסקופ.
4. לחץ על דוושת הרגל של microinjector לוותר ירידה של הבידוד על קצה המחט. מדוד את הקוטר של הירידה באמצעות סרגל קנה המידה בעדשת העין של המיקרוסקופ.
   1. לחלופין, להעריך את הקוטר של הירידה על ידי הזרקת נפח לטיפה של שמן מינרלים בשקופית מיקרוסקופ זכוכית עם סרגל קנה מידה. הקוטר של הטיפה צריך להיות כ 0.10 מ"מ, שזה בערך נפח nl 1.
   2. להתאים את גודל הטיפה על ידי התאמת משך הגדרה בmicroinjector או על-ידי הצמדה את יותר של קצה המחט עם פינצטה בסדר. שים לב שזמן ההזרקה צריך להיות בין 20 - 35 אלפיות שני, כדי למנוע גרימת נזק רב מדי רקמה.
5. באמצעות pipet העברת פלסטיק, העברת 12 הרדימו זחלים לבאר כל עובש ההזרקה.
6. השתמש במוט זכוכית, שיער לולאה, או קצה פלסטיק למצב בעדינות את הזחלים, כך שראשיהם הצביעו לכיוון החלק האחורי של מיקרוסקופ וצקי החלמון הם נגד הצד השמאלי של הבאר. כוון את האוזן השמאלית של הזחל לכיוון התקרה.
7. במבט דרך עדשת העין של סטראו, להשתמש בידיות micromanipulator בשורת המחט הטעונה עם שלפוחית ​​otic כך ששניהם נמצאים באותו שדה הראייה. פירס שכבת האפיתל החיצונית של שלפוחית ​​otic עם קצה המחט, כך שקצה המחט הוא רק בתוך השלפוחית.
8. לחץ על דוושת הרגל להזריק nl 1 למינון הרצוי של ס ' iniae. הקפד להשתמשמספיק לחץ נמוך כדי לא לקרוע את החלל. אם הזריקה היא מוצלחת, שלפוחית ​​otic, אך לא את הרקמה שמסביב, צריכה למלא עם הבידוד פנול האדום (איור 1 Ai). מייד להסיר כל דגים מוזרקים mis מצלחת ההזרקה.
9. לחזור בו בזהירות את המחט מתוך הזחל ולהזיז את צלחת ההזרקה ביד, כך שהזחל הבא הוא בתצוגה. לעשות את זה בהגדלה 5X.
   הערה: ביטול תביעה של המחט עלולה לגרום לתצהיר של כמה חיידקים מחוץ לשלפוחית ​​otic, אשר עשוי להטות תוצאות הישרדות וגיוס לויקוציטים. כדי להימנע מכך, מומלץ להזריק חיידקים שכותרתו צבע ניאון וחזותי לסרוק זחלים מוזרקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להסיר כל זחלים שבו זה קרה. זחל מוזרק בצורה נכונה מוצג ב( איור 1 Bi).
10. כדי להבטיח את עוצמת זריקה / הבידוד נשאר זהה במהלך הניסוי, להזריק טיפה של החיידקיםuspension לתוך צינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגה המכיל של PBS סטרילי 100 μl אחרי כל עובר 48 ^th. צלחת על צלחות THY + אגר P 100 μl על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקבוע את CFU בנפח ההזרקה.
11. כאשר כל הקבוצה של 12 זחלים על רמפת ההזרקה כבר הזריק, להשתמש בזהירות פיפטה העברה פלסטיק כדי להסיר את הזחלים מהבארות ולמקם אותם לתוך צלחת פטרי חדשה (35 x 10 מ"מ ^2). הסר את פתרון tricaine ולהחליף עם כ 2 מיליליטר של מדיום E3 הטרי כדי לאפשר את הזחלים להתאושש.
12. Pipet הזריק זחלים לתוך בארות בודדות של צלחת 96-היטב ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס. צג זחלים לאורך זמן להישרדות בצלחות אלה או להסיר מאוחר יותר להדמיה או CFU ספירה.

7. סודאן שחורה מכתים של נויטרופילים

הערה: ניתן לעשות הצעדים הבאים בטמפרטורת חדר בצלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ"מ ²⁾ על שייקר מסלולית, אלא אם כן otherwise האמור. לכל שלב, את הסכום של מגיב משמש הוא כ 2 מ"ל לכל צלחת, באמצעות מספיק נוזלי כדי לכסות את הזחלים לחלוטין.

1. לקיבוע של זחלים נגועים, להשתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר בינוני E3 ולהחליף עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח בפתרון PBS. מייד למקם את הדגים על 4 מעלות צלזיוס להרדים. תקן את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
2. לשטוף 3 פעמים בPBS במשך 5 דקות כל אחד.
3. כתם עם סודאן השחורה (מניית 0.18% בדילול 1: 5 ב -70% אתנול, פנול 0.1%) למשך 30 דקות עד 5 שעות. השתמש סטראו כדי לבדוק אם גרגרי נויטרופילים לקחו את הכתם.
4. מבצע סדרה של 5 שטיפות דקות מתחילה עם שטיפה אחת באתנול 70% ואחריו שטיפה אחת של יחס של 1: 1 של 70% אתנול ו PBS, ואחריו לשטוף סופי בPBS.
5. רעננות לPBS בתוספת 0.1% tween (PBT).
6. כדי לנקות פיגמנט מהזחלים, לשטוף ב1% / 1% מי חמצן אשלגן הידרוקסיד כ 6-10 דקות. צג closel המדגםy ולאחר כ -5 דקות, לבדוק את הזחלים תחת סטראו כדי לראות כמה של פיגמנט יש פינה. אם הפתרון שנשאר זמן רב מדי, שקי החלמון יתפחו ויתפוצצו.
7. לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד בPBS.
8. אחסן את הדגימות באו PBS או PBT ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 1 עד מוכן לתמונה ולספור.
9. לזחלי תמונה הצבעונית שחור סודאן, להעביר את הדגים לPBT ולאחר מכן לגליצרול 80% ומקום לשקופית דיכאון חלל אחד. מיקום קבוע זחלים תחת סטראו באמצעות קצה פיפטה. תמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית צבע על סטראו (איור 1 "איי-ד ').

8. ספירת חיידקים קיימא מזחלי מאשרום

1. להרדים זחלים בזמנים הרצויים לאחר הזיהום בפתרון קר כקרח 200-300 מ"ג / L של tricaine במדיום E3.
2. Pipet מורדמים זחלים לתוך 1.7 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. הסר את פתרון tricaine ולהחליף עם של 0.2% 100 μlTriton X-100 ב PBS (PBSTx).
3. Homogenize זחלים על ידי עובר למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות מחט 27 G.
4. הכן דילולים סידוריים של homogenates בPBS סטרילי. לדוגמא, אם המינון זיהומיות הוא 100 CFU, pipet של homogenate לתוך 900 μl PBS סטרילי 100 μl. באמצעות קצה pipet חדש, העברת homogenate המדולל 100 μl לμl 900 PBS סטרילי.
5. צלחת של דילולים על אגר קולומביה CNA לבידוד סלקטיבי של חיידקי גרם חיובי 100 μl, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. מדיום זה יספק מבחר גדול יותר מאשר הצלחות אגר THY + P, אשר תתמוך בצמיחה של שני חיידקי גרם שלילי וגרם-חיובי.
6. על צלחות עם פחות מ -500 מושבות בודדות, לספור את מספר המושבות ולהתרבות על ידי גורם הדילול כדי לקבוע את מספר CFU.

9. קיבוע של זחלים להדמיה

1. תקן את הזחלים בparaformaldehyde 4% קרים כקרח בפתרון PBS כdeתואר בסעיף 7.
2. בטמפרטורת חדר, לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד בPBS לפני ההדמיה.

10. הכנת הזחלים להדמית חיה

1. הכן פתרון 1.5% נמוכות היתוך נקודות agarose ב- E3 על ידי חימום במיקרוגל עד הפתרון הוא ברור.
2. הנח פתרון agarose באמבט המים C ° 55 לתת לו מגניב, אבל לא להקשות.
3. להוסיף tricaine לagarose לריכוז סופי של 0.016%.
4. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, למקם 4-5 זחלים הרדימו בצלחת תחתית זכוכית על הבמה של סטראו.
5. הסר את tricaine ופתרון agarose מאמבט המים 55 ° C ולתת לו מגניב בטמפרטורת חדר למשך 1-2 דקות. בעוד agarose מתקרר, להסיר כמה שיותר נוזלים מהזחלים הרדים ככל האפשר.
6. יוצקים את מקורר agarose לתוך הצלחת עד כמחצית מהשטח מכוסה. לערבל את הצלחת על מנת להפיץ את agarose. שים לב שאם agaroseחם מדי, זה יהרוג את הזחלים. כמו כן, אם יותר מדי agarose מתווסף לצלחת, העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ עלולה לפגוע תחתית הצלחת כאשר ההתמקדות באמצעות agarose.
7. בעזרת פיפטה העברה, להרים את הזחלים שרחפו לצדדים של המנה וpipet בחזרה למרכזם.
8. תחת סטראו, בעדינות למקם את הזחלים כרצויים עם לולאת שיער, פיפטה קצה ארוך או מוט זכוכית. להדמיה של שלפוחית ​​otic, מקם את הזחלים כך ששלפוחית ​​otic נותרת היא שטוחה נגד תחתית הצלחת.
9. בואו מגניב agarose במשך כ -10 דקות לפני שעבר את הצלחת. הזחלים עשויים להשתנות עמדות אם agarose הוא לא מוצק. בעדינות pipet כמה tricaine ופתרון E3 לחלק העליון של שכבת agarose כדי לשמור אותו לח.

11. Confocal הדמיה של זיהום

1. מניחים את צלחת הזכוכית תחתונה עם זחלים על הבמה של מיקרוסקופ הפוך עם confoca סריקת לייזר FV-1000מערכת l.
2. הגדר את חריר ל200-300 מיקרומטר ושימוש בצמצם מספרי 0.75 / 20X עדשה אובייקטיבית, להגדיר Z- ערימות עם 3-6 מיקרומטר פרוסות.
3. השתמש בסריקת קו רציפה כדי להתאים את רווח כוח הלייזר וגלאים לכל ערוץ.
4. באמצעות סריקת קו רציפה עבור כל ערוץ הקרינה (למשל, 488 ו543 ננומטר) והתערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), לנהל סרט הזמן לשגות של שלפוחית ​​otic עזב כל 3 דקות במשך 2-6 שעות להתבונן גיוס ראשוני וphagocytosis על ידי נויטרופילים ומקרופאגים. לקורסי זמן ארוכים יותר, למקם את מיכסה על צלחת פטרי כדי למנוע אידוי וייבוש מתוך agarose.
5. לרכוש תמונות סטילס קבוע (איור 1) או לחיות (איור 2) זחלים ב20X או 40X הגדלה.

12. photoconversion של לויקוציטים כותרת Dendra2 בשלפוחית ​​otic

הערה: ניתן photoconverted Dendra2 מירוק לאדום פלואורסצנטיעל ידי התמקדות 405 ננומטר לייזר (כוח 50-70% לייזר צריך להיות מספיק) באזור של העניין (ROI) 1 דקות. להלן פרוטוקול צעד-אחר-צעד המשמש למערכת confocal סריקת לייזר FV-1000:

1. דמיין את המדגם באמצעות סריקת Z- מחסנית עם nm 488 ולייזרי 543 ננומטר. השתמש בסריקת קו רציפה כדי להתאים את רווח כוח הלייזר וגלאים. בדוק כדי לוודא שאין הקרינה אדומה photoconverted בטעות.
2. על חלון "תמונת רכישת השליטה", תחת "הגדרת Stimulus" בחר באפשרות "השתמש בסורק" ולבחור "ראשי". בחר את לייזר 405 ננומטר ולהגדיר אותו על 70% כוח. שימוש באפשרות המעגל, מגדיר את ההחזר על ההשקעה בשלפוחית ​​otic.
3. תחת "Stimulus התחל הגדרה" בחר "הפעלה בסדרה" עם preactivation של 1 מסגרת וזמן הפעלה של 60,000 msec. על החלון "Setting הרכישה" תחת "Scan זמן הכותרת", לבחור 2 בtervals של 0:01:00 (אחד לאחד לפני ולphotoconversion פוסט).
   הערה: לאחר סריקת סדרת הזמן לשגות היא מלאה, Dendra2 היה צריך photoconverted למדינת הניאון האדום שלה.
4. סרוק את המדגם על ידי z-ערימה באמצעות nm 488 ולייזרים 543 ננומטר לדמיין את הקרינה האדומה photoconverted וכן כל שנותרה הקרינה ירוקה (איור 3).

תוצאות

Microinjection של ס ' תוצאות iniae לתוך שלפוחית ​​otic (איור 1 ואיור 2) בתגובת מארח תחילה מקומית. כאשר הוא מוזרק בצורה נכונה, יש לראות את החיידקים רק בשלפוחית ​​otic ולא ברקמה או דם שמסביב. זה יכול להיות דמיין במהלך microinjection באמצעות צבע אדום פנול (איור 1 א).

Discussion

שיטת ההדבקה משמשת כאן היא שימושית עבור המחקר של התגובה החיסונית המארח לזיהום בתחילה מקומי ב2-3 עוברים וזחלי DPF. מוקד גירוי דלקתי, כגון זיהום, בחלל סגור כגון שלפוחית ​​otic מאפשר לחקר chemotaxis נויטרופילים ומקרופאג וphagocytosis. אזהרה אחת של הזרקת חיידקים לתוך שלפוחית ​​otic היא ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 ml Eppendorfs	MidSci	AVSS1700
14 ml Falcon tube	BD Falcon	352059
27 G x ½ in. needle	BD Biosciences	305109
96-well Plate	Corning Incorporated	3596
Agar	BD Biosciences	214030
CellTracker Red	Molecular Probes, Invitrogen	C34552
CNA agar	Dot Scientific, Inc	7126A
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-7m
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ethanol 200 proof	MDS	2292
Fine tweezers	Fine Science Tools	11251-20
Gel comb	VWR	27372-482	4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes			Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
High melt agarose	Denville Scientific, Inc.	CA3510-6
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325
Laser scanning confocal microscope	Olympus	with FV-1000 system
Low melt agarose	Fisher	BP165-25
Magnetic stand	Tritech (Narishige)	GJ-1
Microinjection system	Parker	Picospritzer III
Microloader pipet tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Tritech (Narishige)	M-152
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter	Thermo Scientific	ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
Paraformaldheyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	100 x 15 mm
Phenol	Sigma Aldrich	P-4557
Phenol Red	Ricca Chemoical Company	572516
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP665-1
Potassium hydroxide	Sigma Aldrich	P-6310
Pronase	Roche	165921
Protease peptone	Fluka Biochemika	29185
Small cell culture dish	Corning Incorporated	430165	35 x 10 mm
Sudan Black	Sigma Aldrich	S2380
Thin wall glass capillary injection needles	World Precision Instruments, Inc.	TW100-3
Todd Hewitt	Sigma Aldrich/Fluka Analytical	T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)	Argent Chemical Laboratory/Finquel	C-FINQ-UE-100G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Yeast extract	Fluka Biochemika	92144