JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة يوفر فرص رائعة لاشتقاق زرع ذاتي. ومع ذلك، تقدم من خلال دولة المحفزة وشاقة إعادة التمايز لا يزال يعيق ترجمة السريرية. نحن هنا وصف اشتقاق الخلايا الليفية الإنسان الكبار وتحويلها مباشرة إلى الخلايا الاصلية العصبية التي يسببها والتفريق لاحق في الأنساب العصبية.

Abstract

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من الخلايا الليفية الجلد للبالغين والتمايز لاحقا إلى خلايا جسدية يوفر فرص رائعة لاشتقاق زرع ذاتي التي تتحايل الحواجز التوافق النسيجي. ومع ذلك، تقدم من خلال دولة المحفزة والتمايز الكامل لاحق في الأنساب المطلوب يبقى حاجز لترجمة السريرية للتكنولوجيا التوجيهية بسبب يرتبط بها من الأورام عدم الاستقرار المحتمل والجيني. في الآونة الأخيرة، نحن وغيرنا أظهرت أن الخلايا الجسمية ولا يمكن تحويلها فقط إلى iPSCs ولكن أيضا إلى أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الجسدية باستخدام عوامل محددة، وبالتالي الالتفاف على التقدم من خلال الدولة المحفزة. على وجه الخصوص، والتحويل المباشر من الخلايا الليفية الإنسان في الخلايا الاصلية العصبية التي يسببها (iNPCs) يبشر بإمكانية مصدر خلية ذاتي رواية لمختلف التطبيقات مثل استبدال الخلايا، والنمذجة المرضوفحص المخدرات. هنا، نحن تصف عزل الخلايا الليفية الأولية الإنسان الكبار خزعة الجلد وكفاءة التحويل المباشر من داخل iNPCs التي كتبها التعبير مقيدة في الوقت المناسب من Oct4، Sox2، Klf4، فضلا عن ج. Myc على. ويبدو-Sox2 إيجابي مستعمرات الظهارية العصبية بعد 17 يوما من تحريض وخطوط iNPC يمكن أن تنشأ كفاءة من خلال العزلة وحيدة النسيلة والتوسع. التعديل الدقيق لتعدد الفيروسي العدوى ومكملات عامل مثبط سرطان الدم في مرحلة الحث تمثل العوامل الحاسمة لتحقيق كفاءة تحويل تصل إلى 0.2٪. حتى الآن، يمكن توسيع خطوط iNPC المريض محددة لأكثر من 12 الممرات وموحد عرض الميزات المورفولوجية والجزيئية للخلايا الجذعية / السلف العصبية، مثل التعبير عن Nestin وSox2. خطوط iNPC يمكن التفريق إلى الخلايا العصبية والخلايا النجمية كما تقرره تلطيخ ضد TUJ1 وGFAP، على التوالي. في الختام، نفيدكم بروتوكول قوي لاشتقاق وخيمةتحويل ط م من الخلايا الليفية الإنسان في الخلايا الاصلية العصبية قابلة للتوسيع مستقر يمكن أن توفر مصدرا الخلوية للتطبيقات الطبية الحيوية مثل ذاتي استبدال الخلايا العصبية والنمذجة المرض.

Introduction

في عام 2006 ياماناكا وزملاؤه يمكن أن تظهر لأول مرة إمكانية إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى دولة المحفزة 1. وقد تحقق هذا فقد التمايز التي كتبها overexpression من أربعة عوامل النسخ Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على الخلايا الليفية الفئران. ما يسمى الخلايا الجذعية المحفزة ولدت (iPSCs) تظهر التكافؤ الوظيفي للخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، ويمكن بالتالي أن تكون متباينة في جميع أنواع الخلايا الكائن الحي الكبار. سنة واحدة برمجة وقت لاحق لiPSCs ويمكن أيضا أن يتحقق عن الخلايا الليفية الإنسان 2. وتبين التجارب في النماذج الحيوانية أن الخلايا التوجيهية المستمدة عموما يمكن أن تستخدم لعلاج الخلايا الاستبدال، على سبيل المثال، في مرض باركنسون (PD) 3-5. ومع ذلك، العديد من القيود المرتبطة باستخدام iPSCs تمثل حواجز الطرق لتحقيق كامل إمكاناتهم العلاجية. أولا وقبل كل شيء، إعادة برمجة الخلايا في حالة المحفزة واللاحقةمراقبة الجودة عموما هو مضيعة للوقت وعملية غير فعالة العائد في إجراءات واسعة، وبالتالي تكلفة زراعة الخلايا. ثانيا، تحتاج iPSCs إلى إعادة متباينة، إلى نوع من الخلايا المطلوبة من الفائدة قبل تطبيق الطب الحيوي، واحتمال الخلايا المحفزة المتبقية في السكان متباينة تؤوي إمكانية مكون للأورام كبيرة، وبالتالي تعرض لمخاطر عالية بعد زرع الخلايا 6. الثالث، وعادة ما حققت عملية إعادة برمجة عن طريق حفز عوامل إعادة برمجة عن طريق العدوى lenti- أو فيروسات. دمج هذه الفيروسات في جينوم المضيف قد يؤدي إلى الطفرات إقحامي و / أو تنشيط غير المنضبط من الجينات المحورة 7،8. وقد وضعت الأنظمة غير متكاملة لتوفير عوامل إعادة برمجة لاستهداف الخلايا، التي تقلل من مخاطر الطفرات إقحامي والتحوير تنشيط. أمثلة لهذه النهج خالية من التحوير هي إعادة برمجة الخلايا باستخدام غير دمج-الغدة أو سينداي فيروس 9،10، ناقلات القائم على DNA 11 أو تطبيق طرق خالية من الحمض النووي، مثل ترنسفكأيشن مرنا الاصطناعية 12 أو تنبيغ من البروتينات المؤتلف 13،14. طريقة أخرى واعدة لاشتقاق خالية من التحوير التوجيهية هو استخدام بنيات برمجة lentiviral المعدلة loxP والحذف لاحق من الجينات المحورة باستخدام نظام إعادة التركيب جنة المساواة العرقية، loxP DNA 15،16.

A نهج أكثر وضوحا لتوليد الخلايا العصبية للعلاج استبدال الخلية يمثل التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا العصبية بعد الإنقسامية 17-20. Vierbuchen وآخرون. وذكرت أن overexpression من النسخ عوامل Ascl1، Brn2 وMyt1l النتائج في توليد 20٪ من الخلايا العصبية الليفية الفئران 17. في عام 2011 تم إظهار ذلك، وهذا نفس ثلاثة عوامل النسخ في تركيبة مع overexpression من NeuroD1 تمكن transdifferentiation من الخلايا الليفية الإنسان في الامتحانات الوطنيةعصبونات 19. ويمكن أيضا أن تتولد الخلايا العصبية البشرية الناجمة عن overexpression من Ascl1 وNgn2 تحت SMAD- المزدوج وGSK3β- تثبيط 20. والجدير بالذكر أن التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا عصبية يولد غير التكاثري، سكان الخلية بعد الإنقسامية التي لا تسمح مزيد من التوسع والبنوك الحيوية.

مؤخرا، تم الإبلاغ عن التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى السكان الخلية العصبية الجذعية / السلف المتكاثرة 21-26. من أجل الوضوح، وسيتم تسمية كل هذه الأنواع من الخلايا إلى خلايا العصبية التي يسببها السلف (iNPCs) في هذا التقرير. هان وآخرون. overexpressed Brn4، Sox2، ج. Myc على وKlf4 لتوليد iNPCs. مثل نظرائهم الخلايا الجذعية العصبية المستمدة من الخلايا إما الأنسجة الابتدائية أو المحفزة هذه iNPCs هي tripotential ويمكن أن تكون متباينة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes 21. ذكرت مجموعتنا بروتوكول تحويل مختلف قليلا تنطوي على overexpression من Sox2، Klf4وج. Myc على والناجم عن Oct4-التعبير لمدة 5 أيام فقط. مع هذا النهج الذي يمكن أن تولد المتكاثرة مستقر iNPCs من الفئران الجنينية والخلايا الليفية الكبار الذي يحمل إسكات كاملة من عوامل إعادة برمجة 22. وعلى النقيض من iPSCs، لا iNPCs لا يحمل إمكانات مكون للأورام بعد زرع 27. استخدمنا تحويل خلايا بنجاح في نموذج حيواني من إزالة الميالين، الفئران التي تعاني من نقص المايلين، مما يدل على أن iNPCs هي سريريا مفيدة 22. حتى ذلك الحين، الشخصيات يمكن أن تتولد فقط من الخلايا الجذعية المحفزة أو الأنسجة العصبية الأولية 28-32. iNPCs هي خلايا قابلة للتوسيع ثابت التي يمكن cryopreserved وتكون قادرة على التمايز إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes. أحرز بذل الكثير من الجهد للتكيف بروتوكول التحويل المباشر من الفأر إلى الخلايا البشرية 23،26،33،34. في عام 2012 نشرت أن overexpression من عامل Sox2 واحد في الخلايا الليفية غير كافية لتوليد الفئران وiNPCs الإنسان 33. ذكرت والكتاب جيل من iNPCs الإنسان من الخلايا الليفية القلفة الجنين وتتميز لهم من قبل تلطيخ ضد Sox2 وNestin. ومع ذلك، فإن الخلايا المستهدفة تستخدم لإعادة برمجة تمثل نوع من الخلايا خاص جدا التي لن تكون متاحة في الممارسة السريرية وليس هناك توصيف وظيفي للخلايا تحويلها عن طريق زرع في نموذج حيواني تنفيذها. ويصف نشر أحدث جيل من الأسلاف يقتصر العصبية من الخلايا الليفية الجنين البشري من قبل overexpression من Sox2، ج. Myc على وإما Brn2 أو Brn4 34. أظهرت خطوط الخلايا المولدة قدرة التجديد الذاتي، ويمكن أن تكون متباينة إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية الطرفية. ومع ذلك، فإن استخدام الخلايا الليفية الجنين غير موات، وهذه الخلايا هي من أصل غير متجانسة واحدة لا يمكن استبعاد وجود مثل المتبقية، والخلايا الجذعية قمة العصبية في التحضيرات. في عام 2014، وقال تشو وآخرون. وذكرت التحويل المباشر من الكبار البشري والجددالليفية الولادة في الخلايا العصبية السلف tripotential التي كتبها overexpression من Sox2 جنبا إلى جنب مع Oct4 أو Oct4 وحده، وبالإضافة إلى ذلك من الجزيئات الصغيرة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية. والجدير بالذكر، بناء على دراساتهم Sox2 وحده لم يكن كافيا للحث على التحويل المباشر 26. وفي الآونة الأخيرة، لو وآخرون. وذكرت أن overexpression من أن ياماناكا عوامل Oct4-، Sox2-، Klf4-، ج. Myc على فيروس سينداي لمدة 24 ساعة وتعطيل لاحق من الفيروس عن طريق زيادة النتائج درجة الحرارة في توليد العصبية tripotential قابلة للتوسيع خلايا السلائف 23. في الختام، على الرغم من أن بروتوكولات التحويل نشرت للخلايا البشرية لديها حتى الآن في المشترك وoverexpression من واحد على الأقل أو أكثر من العوامل ياماناكا، في كثير من الأحيان بطريقة مقيدة في الوقت المناسب، لا يوجد مؤشر واضح على العوامل الجزيئية الحد الأدنى اللازم لدفع مباشرة تحويل إلى iNPCs. وoverexpression يقتصر في الوقت المناسب من Oct4 إما عن طريق وسائل الوراثية، ترنسفكأيشن مع مرنا الاصطناعية، أو جلم الذراع-نفيذ البروتين جنبا إلى جنب مع التعبير التأسيسي للSox2، KLF-4، ج. Myc على لم تسفر عن خطوط iNPC الإنسان مستقرة حتى الان. وهكذا، فإن تطبيق فيروس سينداي الى بإفراط عن جميع العوامل ياماناكا وتقييد النشاط في الوقت المناسب من خلال تثبيط الحرارة من الفيروس 23 جنبا إلى جنب مع تحسين ظروف تحريض وسائل الإعلام العصبي 22،31 يمثل الاستراتيجية المفضلة حتى الآن.

تظهر العديد من الدراسات وظيفة الخلوية من NSCs أو نظرائهم متباينة في مختلف النماذج الأمراض الحيوانية. تم زرعها الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في نماذج الماوس من اضطراب neuroinflammatory التصلب المتعدد 35،36. انطباق الخلايا الاصلية العصبية المشتقة HESC في EAE (التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي) وقد أظهرت -mice لأول مرة في عام 2008 35. تم حقن الخلايا العصبية السلائف متعددة القدرات في بطينات الدماغ الماوس، ونتيجة زرعإد في الحد من علامات سريرية للEAE. كيم وآخرون. ولدت السلائف oligodendroglial من hESCs وزرع تلك intracerebroventricularly إلى EAE الفئران. على الرغم من أن زرع لم البقاء على قيد الحياة لأكثر من 10 يوما، وأظهرت الفئران تحسنا كبيرا في وظيفة الجهاز العصبي والحد من الخلايا المناعية proinflammatory في المادة البيضاء 36. كما تم تطبيق العلاج بالخلايا الجذعية لpreclinically استهداف مرض باركنسون كما الشخصيات يمكن أن تستخدم بنجاح في النماذج الحيوانية منها. لهذا، كانت الخلايا الاصلية المستمدة إما من أنسجة دماغ الجنين 37 متباينة من الخلايا الجذعية المحفزة 38-40 أو الخلايا الجذعية الوسيطة استخدمت 41. في عام 2012 أظهرنا أن iNPCs الماوس هي قادرة على انتاج بروتين شحم بروتيني، وعنصرا رئيسيا البروتين المايلين، بعد زرع في أدمغة-المايلين ناقصة (MD) الفئران 22. من خلال تلك التجربة إثبات صحة المبدأ applicabil العلاجيةوقد ثبت إيتي من iNPCs أولا، وأكدت قريبا دراسة أخرى 32. ومع ذلك، لا تزال هناك امكانات الاستخدام العلاجي للiNPCs الإنسان من يكتشفها.

نحن هنا تظهر عملية قوية ومتكاملة من (ط) اشتقاق الخلايا الأولية الإنسان من المرضى البالغين عن طريق خزعة الجلد، (ب) التحويل المباشر من الخلايا الليفية الإنسان في دولة السلف العصبية و (ج) قدرة iNPCs لتكون متباينة في الخلايا العصبية والأنساب الدبقية. واستخدام هذا البروتوكول يساعد على تسريع جيل من الخلايا البشرية ذاتي للتطبيقات العلاجية.

Protocol

تم الحصول على الخلايا الليفية الإنسان المستخدمة في هذه الدراسة من خزعة الجلد لكمة بعد الحصول على الموافقة المستنيرة وإزالة الأخلاقي من قبل لجنة الأخلاق في جامعة فورتسبورغ، ألمانيا (تقرير الأخلاقي رقم: 96/11 بتاريخ 2011/6/10).

1. لكمة خزعة

  1. تطهير الجلد من المريض. تخدير جزء من الجلد التي سيتم اتخاذها خزعة من (تفضيلي منطقة المعرضة للشمس أقل) باستخدام 0،5-1 مل ميبيفاكايين هيدروكلوريد intracutaneously وإعداد خزعة الجلد باستخدام معقم 3mm وخزعة لكمة، وشطف خزعة مع DPBS + 1 ميكرولتر / 1ML جنتاميسين وإزالة الدهون. شطف خزعة مرتين مع DPBS + جنتاميسين، نضح DPBS تماما والغطاء خزعة مع Dispase II (2.4 U / مل)، واحتضان 16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  2. نضح Dispase تماما، ويغسل مرتين مع DPBS وإزالة البشرة مع ملاقط. غسل خزعة مرتين مع DPBS، إضافة 2 مل كولاجيناز نوع 2 (500 U / مل حزب الاتحاد الديمقراطي المسيحي)، ونقل في أنبوب 15 مل وإضافة CollagenaSE تصل إلى 5 مل الحجم الكلي. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  3. الطرد المركزي 5 دقائق في 180 x ج وتجاهل طاف بعد ذلك. بيليه resuspend في 10 مل DMEM-FCS-جنتاميسين وسائل الإعلام (10٪ FCS، 1 ميكرولتر / مل جنتاميسين) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 180 ز س. تجاهل وطاف بيليه resuspend في 1.5 مل DMEM-FCS-جنتاميسين وسائل الإعلام. نقل إلى T25 ملتصقة زراعة الأنسجة قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  4. تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام.
  5. بعد ما يقرب من 2 أسابيع، عندما متموجة الخلايا حول أجزاء الجلد، وتقسيم الخلايا باستخدام التربسين / EDTA (0.05٪): خلايا يغسل مرة واحدة مع DPBS، احتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 بعد إضافة 2 مل التربسين / EDTA (0.05٪)، إضافة 2 مل من DMEM-FCS-جنتاميسين وسائل الإعلام، ونقل إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 180 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل بيليه طاف و resuspend في كمية مناسبة من DMEM-FCS-جنتاميسين وسائل الإعلام.
  6. توسيع الخلايا عن طريق تغيير المتوسط ​​كل 3 صد يوم وتقسيم كما هو موضح أعلاه عند الخلايا هي متكدسة. إضافة جنتاميسين يمكن وقفها بعد مرور 2.
  7. قبل استخدام الخلايا للتجارب التحويل المباشر، للتأكد من استبعاد تلوث الميكوبلازما بواسطة فحوصات القياسية.
  8. عندما تم توسيع الخلايا، يمكنك البدء مباشرة التحويل أو تجميد الخلايا أسفل باستخدام 10٪ DMSO و 90٪ FCS. يجب أن يتم تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 2 أيام، ثم نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
  9. لإعداد التحويل، وغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS، نضح DPBS وإضافة 2.5 مل التربسين / EDTA (0.05٪). الاحتفاظ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. الصنبور القارورة بلطف لفصل الخلايا، resuspend في 2.5 مل من وسائل الاعلام الخلايا الليفية (DMEM مدفوع. L-حمض الغلوتاميك + 10٪ + 1٪ FCS NEAA + 1٪ البيروفات الصوديوم) ونقل إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 180 x ج لمدة 5 دقائق ونضح طاف. Resuspend الخلايا في 1 مل سائل الإعلام الليفية وماصة صعودا وهبوطا لتوليد تعليق خلية واحدة.
  10. حساب عدد الخلايا باستخدام فوكس-Rosenthal- أو نويباور خلايا العد غرفة وصفيحة 3 × 10 4 خلايا لكل بئر من 24 لوحة جيدا. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.

2. العدوى من الخلايا الليفية الإنسان مع سينداي الفيروسات وTransdifferentiation

ملاحظة: لضمان السلامة، والخطوات التالية التعامل مع الفيروس يجب أن تؤديها في خزانة السلامة البيولوجية وغطاء تدفق الصفحي، ومع المعدات المناسبة الشخصية السلامة، خصوصا قناع جراحي، لمنع التعرض المخاطية.

  1. تبديل الخلايا إلى 100 ميكرولتر وسائل الاعلام الخلايا الليفية (الخطوة 1.9). ذوبان الجليد aliquots من Oct4-، Klf4-، Sox2- وفيروس C-MYC-سينداي وresuspend كل الفيروس في 1 مل سائل الإعلام الليفية. إضافة كل الفيروسات مع وزارة الداخلية من 3 إلى خلايا (عيار الفيروس يختلف من الكثير الكثير، ولكن عموما يمكن قسامة واحدة من كل فيروس أن تستخدم لإصابة 10 بئرا من 24 جيدا لوحة) وتخلط بلطف. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 .
  2. بعد 24 ساعة نضح المتوسطة وإضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام neuroinduction (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal، 1X N2، 1X B27، 1٪ GlutaMAX، 10 نانوغرام / مل hLIF، 3 ميكرومتر CHIR99021، 2 ميكرومتر SB431542) و الثقافة في 39 ° C، 5٪ CO 2 من الآن فصاعدا. تغيير وسائل الاعلام كل يوم.
  3. في يوم 6 بعد الإصابة إعداد المغلفة laminin 6-جيدا لوحات: تمييع laminin إلى 1 ميكروغرام / مل في DPBS، إضافة 1 مل من محلول على 6 جيدا لوحات والحفاظ على 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. في يوم 7 بعد الإصابة تقسيم الخلايا باستخدام DPBS / EDTA: نضح وسائل الإعلام وغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS، ثم يضاف 500 ميكرولتر من DPBS / EDTA واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من DMEM / F12 وإزالة تعليق من لوحة في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 180 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نضح طاف و resuspend بيليه في 1.5 مل من وسائل الإعلام neuroinduction، لوحة على المغلفة laminin 6 جيدا لوحات وإضافة ROCK المانع Y27632 في بغية دراسته واقراره النهائيةntration من 10 ميكرومتر إلى الخلايا والثقافة في 39 ° C، 5٪ CO 2.
  7. تغيير وسائل الاعلام كل يوم.
  8. من يوم 14 بعد ثقافة عدوى الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. أصبحت مستعمرات الظهارية العصبية واضحة حول يوم 17 بعد العدوى عن طريق النقيض من المرحلة المجهري. ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي ويمكن الحصول عليها اليوم حوالي 20 بعد الإصابة.

3. عزل المستعمرات المزعومين iNPC

  1. قبل اختيار يوم واحد، ومعطف واحد 48 لوحة جيدا مع laminin: تمييع laminin إلى 1 ميكروغرام / مل في DPBS، إضافة 300 ميكرولتر من حل على لوحات والحفاظ على 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في وقت لاحق يوم واحد نضح laminin من لوحات وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام neuroinduction إلى الآبار.
  2. يغسل 6 جيدا لوحات تحتوي على المستعمرات ويمكن الحصول عليها مرة واحدة مع DPBS وإضافة 2 مل DPBS لكل بئر من 6 جيدا لوحة. اختيار المستعمرات ميكانيكيا: كشط حول المستعمرات باستخدام إبرة رقيقة للتخلص من الخلايا المحيطة بها؛ تعيين 2001؛ ل pipetman على 50 ميكرولتر واختيار المستعمرات باستخدام نصائح ماصة منها.
  3. نقل مستعمرة واحدة كل في بئر واحدة من 48 جيدا لوحة المغلفة laminin وتوليد تعليق خلية واحدة ميكانيكيا بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات. إضافة ROCK المانع Y27632 في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى الخلايا.
  4. تنمو الخلايا على 48 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ل 2 أيام. تغيير وسائل الاعلام كل يوم الثاني على التوالي حتى خلايا تصل 80-90٪ confluency (حوالي 3 - 4 أيام).

4. التوسع والبرد الحفاظ على iNPCs

  1. الركض والتوسع في iNPCs
    1. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع DPBS. نضح DPBS وإضافة 200 ميكرولتر DPBS / EDTA واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، إضافة 200 ميكرولتر من DMEM / F12 وإزالة تعليق من لوحة في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 180 x ج لمدة 5 دقائق .
    2. نضح طاف و resuspend بيليه في 0.5 مل من neuroinduction وسائل الإعلام (الخطوة 2.2)، لوحة على المغلفة laminin 12 جيدا لوحات وإضافة ROCK المانع Y27632 في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى الخلايا والثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. بعد الخلايا تصل إلى 80-90٪ confluency أنها يمكن أن تكون إما مزيد من التوسع أو المجمدة على النحو التالي.
  2. تجميد iNPCs
    1. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع DPBS. نضح في DPBS وإضافة DPBS 300μl / EDTA واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، إضافة 300 ميكرولتر من DMEM / F12 وإزالة تعليق من لوحة في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي في 180 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. نضح طاف و resuspend بيليه في 0.5 مل من التجاري NSC المتوسطة تجميد. نقل تعليق على قارورة تجميد وضعت في حاوية تجميد الخلية. مخزن في -80 درجة مئوية لمدة 2 أيام، ثم نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

5. تمايز iNPCs

  1. التمايز نحو الخلايا العصبيةآل النسب
    1. خلايا الثقافة على لوحات المغلفة laminin كما هو موضح أعلاه. تغيير وسائل الإعلام إلى العصبية فرق وسائل الإعلام (DMEM / F-12، 1X N2، 1X B27، 300 نانوغرام / مل المخيم، و 200 ميكرومتر فيتامين C، 10 نانوغرام / مل BDNF، 10 نانوغرام / مل GDNF) عندما خلايا ما يقرب من 70٪ متموجة. تغيير وسائل الاعلام كل يوم لمدة ثلاثة أسابيع. هل خلايا مشطورة خلال التمايز.
    2. بعد ثلاثة أسابيع خلايا ينبغي أن يعبر عن علامة TUJ1 الخلايا العصبية. للحصول على الخلايا العصبية أكثر نضجا وتستمر فرعية العصبية التمايز تصل إلى 3 أشهر.
  2. التمايز نحو النسب الدبقية
    1. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام تحريض الدبقية (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal، 1X N2، 1X B27 و 10 ميكرومتر β المركابتويثانول، و 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1.5 ملي L-الجلوتامين، والانسولين 5 ميكروغرام / مل، 40 نانوغرام / مل T3) بما في ذلك 20 نانوغرام / مل EGF للحث على التمايز إلى خلايا الدبقية السلائف. إزالة نصف وسائل الإعلام واستبدالها من قبل وسائل الإعلام الجديدة كل يوم لمدة حوالي 2 أسابيع. خلال هذه الفترة يجب تقسيم الخلايا1: 3 في وجود 10 ميكرومتر ROCK المانع Y27632 عندما يتم التوصل إلى 100٪ confluency.
    2. بعد 2 أسابيع تمييز الخلايا إلى مزيد من الخلايا النجمية: عندما الخلايا هي وسائل الاعلام التغيير متكدسة تقريبا التجاري وسائل الاعلام نجمية المتاحة، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم الثاني على التوالي. بعد حوالي 7 أيام تبدأ الخلايا في التعبير عن علامات نجمية (على سبيل المثال، GFAP). إذا خلايا الحصول على 100٪ متموجة خلال بروتوكول التمايز، وتقسيمها في نسبة 1: 2 في حضور 10 ميكرومتر ROCK المانع Y27632.

النتائج

نحن هنا تقديم وصف عملية متكاملة تسمح توليد الناجم عن الخلايا الاصلية العصبية (iNPCs) من الخلايا الليفية الإنسان التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعة لكمة من الجلد في أقل من 8 أسابيع (الشكل 1). iNPCs المريض specifc يمكن التفريق الى مزيد من الأنساب العصبية والدبقية والمين...

Discussion

نحن هنا تظهر العزلة والتحويل المباشر من الخلايا الليفية الإنسان في الخلايا الاصلية العصبية خالية من التحوير للتوسيع وآله المتمايزة كأساس المفترضة لعلاج الخلايا استبدال أو تطبيق في تحليل فحص المخدرات. وقد تحقق نسب التحويل المباشر للخلايا الجسمية في الشخصيات التي ا?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

نود أن نشكر جميع أعضاء الخلايا الجذعية والطب التجديدي المجموعة من جامعة فورتسبورغ للحصول على اقتراحات مفيدة ومارتينا جيبهاردت وكذلك هايكه Arthen للحصول على الدعم الفني الممتاز. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث DFG (ED79 / 1-2)، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحث BMBF (01 GN 0813)، والبحوث البافارية شبكة المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية "forIPS" و "ستيفتونغ سيبيل Assmus ". وقد أنتج الشكل 1 باستخدام سرفييه الفن الطبية، التي تتوفر من www.servier.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Astrocyte mediaScienCell1801
B27LifeTechnologies17504-044
BDNFPeprotech450-02
Biopsy Punchpfm medical48301
cAMPSigmaA6885
CHIR99021Axon medchem1386
Collagenase Type2Worthington BiochemicalLS004177
DispasePAN P10-032100
DMEMLifeTechnologies41966-029
DMEM F12LifeTechnologies11320-033
DMSORoth4720
DPBSLifeTechnologies14190-094
EGFLife TechnologiesPHG0313
FCSBiochrom AG50115
GDNFPeprotech450-10
GentamicinSigmaG1397
GFAP-antibodyDakoZ0334
GlutaMAXLifeTechnologies35050-038
hLIFPeprotech300-05
InsulinSeralabGEM-700-112-P
Ki67-antibodyNeoMarkersRM-9106-S
L-GlutamineLifeTechnologies25030-024
LamininSigmaL2020
N2LifeTechnologies17502-048
Nestin-antibodyR&D SystemsMAB1259
NeurobasalLifeTechnologies21103-049
Non-essential amino acidsLifeTechnologies11140-050
NSC freezing mediaSigmaC6295
Oct4-antibodySanta Cruzsc9081
Pax6-antibodyCovancePRB-278P
SB431542Invivogeninh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit LifeTechnologiesA1378001
SodiumpyruvateLife Technologies11360-039
Sox1-antibodyR&D SystemsAF3369
Sox2-antibodyR&D SystemsMAB2018
T3Santa Cruzsc-205725
Trypsin/EDTALife Technologies15400-054
TUJ1-antibodyCovanceMMS-435P-250
Vitamin CSigmaA4544
Y27632CalbiochemCAS 146986-50-7
β-MercaptoethanolLifeTechnologies21985023

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
  4. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  5. Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
  6. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  7. Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
  8. Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
  9. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  10. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  11. Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
  12. Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657 (2012).
  13. Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible factors. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
  14. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  15. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87 (2013).
  16. Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47 (2014).
  17. Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  18. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
  19. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  20. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
  21. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
  22. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  23. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  24. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
  25. Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
  26. Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
  27. Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
  28. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283 (2005).
  29. Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, ., Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
  30. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
  31. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  32. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252 (2013).
  33. Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
  34. Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
  35. Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145 (2008).
  36. Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
  37. Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
  38. Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
  39. Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
  40. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
  41. Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
  42. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
  43. Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
  44. Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
  45. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

101 transdifferentiation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved