성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

요약

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

초록

체세포에 성인 피부 섬유 아세포에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) 이후 분화의 세대는 조직 적합성 장벽을 우회자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 원하는 계보로 이어지는 완벽한 차별화를 통해 진행하기 때문에 관련 종양 잠재력과 게놈 불안정성의 IPSC 기술의 임상 번역 장애물 남아있다. 최근에, 우리와 다른 체세포만을시켜 만능 상태를 통해 진행을 우회 정의 요소를 이용하여 iPSCs으로뿐만 아니라 다 능성 줄기 세포의 체세포의 다른 유형으로 변환 할 수 없다는 것을 보여 주었다. 특히, 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)에 인간의 섬유 아세포의 직접 변환은 셀 교체, 질병 모델링과 같은 다양한 애플리케이션을위한 새로운자가 셀 소스의 가능성을 알린다및 약물 검사. 여기, 우리는 적시에 제한 인 Oct4, Sox2이, Klf4의 표현뿐만 아니라, C-Myc와에 의해 iNPCs에 피부 생검과 효율적인 직접 변환하여 성인의 주요 섬유 아 세포의 분리에 대해 설명합니다. SOX2 양성 neuroepithelial 식민지 유도 17 일 후에 나타나며 INPC 라인은 단일 클론 분리 및 확장에 의해 효율적으로 설정할 수 있습니다. 유도 단계에서 감염과 백혈병 억제 인자의 보충의 바이러스 성 다양성의 정확한 조정은 최대 0.2 %의 변환 효율을 달성하기 위해 중요한 요소를 나타냅니다. 지금까지, 환자 맞춤형 INPC 라인은 12 개 이상의 구절에 대한 확장 및 균일하게 네 스틴 및 Sox2이의 발현으로 신경 줄기 / 전구 세포의 형태 학적 및 분자 기능을 표시 할 수있다. 각각 TUJ1 및 GFAP,에 염색하여 판단으로 INPC 라인은 신경 세포와 성상 세포로 분화 할 수있다. 결론적으로 유도하고 디레위한 강력한 프로토콜 신고이러한자가 신경 세포 교체 및 질병 모델링으로 생물 의학 응용 프로그램에 대한 휴대 소스를 제공 할 수 있습니다 안정적으로 확장 신경 전구 세포로 인간 섬유 아세포의 CT 변환.

서문

2006 년 야마나카와 동료들은 처음 능성 상태 ^(1)로, 체세포의 프로그래밍 가능성을 보여줄 수있다. 이 탈분화는 인 Oct4, Sox2이, Klf4 및 c-Myc와는 쥐의 섬유 아세포에서 네 전사의 과발현에 의해 요인 달성되었다. 생성 된 소위 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)는 배아 줄기 세포 (는 ESC)에 동등한 기능을 보여 주며, 따라서 성인 유기체의 모든 유형의 세포로 분화 될 수있다. 나중에 iPSCs에 재 프로그래밍 한 해는 인간 섬유 ^아세포이 달성 될 수있다. 동물 모델에서 실험 IPSC 유래 세포는 일반적으로 파킨슨 병 (PD) 등의 세포 대체 요법, ^3-5에 사용될 수 있음을 입증한다. 그러나, iPSCs의 사용과 관련된 몇 가지 제한은 치료 가능성의 완전한 실현을위한 방책을 나타냅니다. 만능 상태 이후에 세포의 리 프로그래밍, 우선품질 관리는 일반적으로 시간이 많이 소요되고, 따라서 비용이 많이 드는 광범위한 세포 배양 과정에서 산출 비효율적 과정이다. 둘째, iPSCs 상당한 발암 가능성을 품고 생의학 도장 전에 관심 원하는 세포 유형과 차별화 인구 잔류 다 능성 세포의 확률로 다시 구분 될 필요가있어 세포 이식 ⁶ 후의 높은 위험을 표시한다. 셋째, 프로그래밍 프로세스는 일반적 렌티 또는 레트로 바이러스 감염에 의해 재 프로그램 인자를 유도함으로써 달성된다. 숙주 게놈에이 바이러스의 통합은 삽입 성 돌연변이 유발 및 / 또는 유전자 ^7,8의 제어되지 않은 활성화로 이어질 수 있습니다. 비 통합 시스템은 삽입 성 돌연변이 유발 및 트랜스 활성화의 위험을 최소화하는 표적 세포 리 프로그래밍 요소들을 제공하기 위해 개발되었다. 이러한 유전자가없는 방식의 예로는 비 - 적분을 이용한 세포의 리 프로그래밍 아르아데노 또는 센다이 바이러스 ^{9, 10,} DNA 기반 벡터 ⁽¹¹⁾ 또는 재조합 단백질 ^{(13, 14)의} 합성 mRNA의 ¹² 또는 전달의 형질 같은 DNA가없는 방법의 응용 프로그램. 트랜스 프리 IPSC의 유도를위한 또 다른 방법은 유망한에 loxP 변성 렌티 프로그래밍 구조와 Cre 호텔-DNA에 loxP 재조합 시스템 ^{(15, 16)를} 사용하여 유전자의 삭제 이후의 사용이다.

세포 대체 요법은 포스트 - 유사 분열 뉴런 ^17-20으로 섬유 아세포의 직접 변환을 나타낸다위한보다 간단한 방법은 신경 세포를 생성한다. Vierbuchen 등은. 전사의 과발현은 쥐의 섬유 아세포를 ^17에서 20 %의 신경 세포의 생성에 Ascl1, Brn2 및 Myt1l 결과를 요인 보도했다. 그것은 2011 년 NeuroD1 과발현과 조합 같은 세 가지 전사 인자가 NEU로 인간 섬유 아세포의 분화를 사용하는 것이 도시되었다rons ^19. 인간 유도 된 신경 세포는 또한 듀얼 SMAD-과 GSK3β- 억제 ⁽²⁰⁾ 아래 Ascl1과 Ngn2의 과발현에 의해 생성 될 수있다. 특히, 신경 세포에 섬유 아 세포의 직접 변환은 추가 확장 및 biobanking을 허용하지 않는 비 증식, 후 유사 분열 세포 인구를 생성합니다.

최근, 신경 줄기 증식 / 전구 세포 집단으로 섬유 아세포의 직접 변환은 ^{21-26을보고} 하였다. 명확성을 위해, 모든 세포 유형은이 보고서에서 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)로 지정됩니다. 한 등은. iNPCs를 생성하는 Brn4, Sox2이, C-Myc와 Klf4과를 과발현. 기본 조직 또는 만능 중 세포에서 파생 된 자신의 신경 줄기 세포의 대응과 마찬가지로이 iNPCs는 tripotential하고 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포 ^(21)로 분화 될 수있다. 우리 그룹은 Sox2이, Klf4의 과발현을 포함하는 약간 다른 변환 프로토콜을보고, C-Myc와와 5 일 동안 유도 인 Oct4 표현합니다. 이 방법을 우리는 재 프로그래밍 ^{(22) 요인의} 완전한 침묵을 나타내는 쥐의 배아와 성인 섬유 아세포에서 안정적으로 증식 iNPCs을 생성 할 수 있습니다. iPSCs는 대조적으로, iNPCs 이식 ^{27 일} 후 종양 가능성을 나타내지 않는다. 우리는 iNPCs 임상 ⁽²²⁾ 유용한 것으로 보여, 동물 탈수 초화의 모델, 수초 결핍 쥐에서 성공적으로 세포를 변환 할 때 사용합니다. 그때까지의 NPC은 다 능성 줄기 세포 또는 기본 신경 조직 ^28-32에서 생성 될 수있다. iNPCs는 동결 보존 및 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 할 수있는 수를 안정적으로 확장 세포이다. 많은 노력이 인간의 세포 ^23,26,33,34 마우스에서 직접 변환 프로토콜을 적응하기 위해 만들어졌다. 2012 년은 섬유 아세포의 단일 요인 Sox2이의 과발현은 쥐와 인간의 iNPCs를 생성하는 데 충분하다고 출판 되었음 33까지. 저자는 태아 포피의 섬유 아 세포에서 인간의 iNPCs의 생성을보고 Sox2이와 네 스틴에 염색하여 그들을 특징. 그러나, 리 프로그래밍에 사용되는 표적 세포는 임상에서 사용할 수 있으며 수행 동물 모델에 이식에 의해 변환 된 세포의 기능적 특성은 없었다되지 매우 특정 세포 유형을 나타낸다. 최근 출판물은 Sox2이, C-Myc와 및 Brn2 또는 Brn4 ⁽³⁴⁾ 중 하나의 과발현에 의해 인간의 태아 섬유 아세포에서의 연결을 제한 전구 세포의 생성을 설명합니다. 생성 된 세포주는 자기 갱신 능력을 보였고, 단말기의 여러 유형의 신경 세포로 분화 될 수있다. 이들 세포는 이종 기원이며 하나 잔류 예 제제에서 신경 능선 줄기 세포의 존재를 배제 할 수 없다 그러나, 태아 섬유 아세포의 사용은 바람직하지 않다. 2014 년, 주홍 등은. 인간의 성인과 네오의 직접 변환을보고단독으로 또는 인 Oct4 인 Oct4와 함께 Sox2이 과발현 및 세포 배양 배지에 작은 분자의 첨가에 의해 tripotential 신경 전구 세포로 탈 섬유 아세포. 특히, Sox2이 그들의 연구에 기초하여 단독으로 직접 변환 ^(26)을 유도하기에 충분 하였다. 최근 루 외는. 야마나카의 과발현은 팽창성 tripotential 신경의 세대에서 증가 된 온도의 결과에 의해 바이러스의 24 시간 이후의 불 활성화 센다이 바이러스에 Oct4-, Sox2-, Klf4-, C-Myc와 인자보고 전구 세포 ^(23). 인간 세포 출판 변환 프로토콜까지 적시 제한된 방식으로 흔히 야마나카 인자 중 적어도 하나 이상의 공통 과발현에했지만 결론적으로, 직접 구동하기 위해 필요한 최소한의 분자 계수의 명확한 지시가 없다 iNPCs로 변환. 어느 유전자에 의해 인 Oct4의 적절한 제한 과발현, 합성의 mRNA와 형질 전환, 또는 C함께 Sox2이, KLF-4, C-Myc와의 구성 적 표현과 ELL-투과 단백질은 아직 안정 인간 INPC 라인을 초래하지 않았다. 따라서, 센다이 바이러스의 적용은 모든 야마나카 인자를 과발현 적시 ^{22,31 지금까지} 바람직한 방법을 나타낸다 함께 최적화 신경 미디어 유도 조건 ²³ 바이러스의 열 불 활성화하여 활성을 제한한다.

몇몇 연구 NSCs의 또는 다른 동물 질병 모델에서의 분화 세포의 대조 기능을 보여준다. 인간 다 능성 줄기 세포로부터 신경 전구 세포가 여러 ^35,36 경화증 신경 염증성 질환의 마우스 모델에 이식 하였다. EAE에 hESC의 유래 신경 전구 세포의 적용 (실험자가 면역 뇌척수염) 때문이야 먼저 2008 ^35에 도시 하였다. 능성 신경 전구 세포는 마우스 뇌의 심실에 주입하고, 이식 결과EAE의 임상 증상의 감소에 에드. Kim 등. 인간 배아 줄기 세포로부터 희 돌기 전구체를 생성 EAE-마우스로 뇌 실내 사람들을 이식. 이식이 10 일 이상 생존하지 않았지만, 마우스는 신경 학적 기능과 백질 ^(36)의 염증성 면역 세포의 감소의 상당한 개선을 보여 주었다. 줄기 세포 치료는 또한 NPC가 성공적으로 각각의 동물 모델에서 이용 될 수 있기 전임상 파킨슨 병 타겟팅 적용되었다. 이를 위해 전구 세포는 어느 능성 줄기 세포를 ^{38 ~ 40} 또는 ^41을 사용 ^하였다는 중간 엽 줄기 세포로부터 분화 태아 뇌 조직 ^{(37)로부터} 유래되었다. 2012에서는 마우스 iNPCs는 미엘린 결손 (MD) ⁽²²⁾ 쥐의 뇌에 이식 후 테오 단백질, 주요 미엘린 단백질 성분을 생산할 수 있음을 보여 주었다. 그 원리 증명 실험 치료 applicabil으로iNPCs의 성만이 먼저 입증 곧 또 다른 연구 ^(32)에 의해 확인되었다. 그러나, 인간의 iNPCs의 치료 적 사용의 잠재력을 탐구 일이다.

여기에 우리가 피부 조직 검사를 통해 성인 환자에서 인간의 일차 전지의 (I) 유도의 강력하고 통합 된 과정을 보여, (II) 신경 전구 상태와 iNPCs의 (ⅲ) 능력으로 인간의 섬유 아 세포의 직접 변환은 신경 세포로 분화 할 그리고 아교 계통. 이 프로토콜의 사용은 치료 응용 프로그램에 대한자가 인간 세포의 생성을 가속화하는 데 도움이 될 것입니다.

프로토콜

이 연구에 사용 된 인간의 섬유 아세포는 뷔르츠부르크, 독일 대학의 윤리위원회의 동의와 윤리 허가를 통보받은 후 피부 펀치 생검에서 얻었다 (윤리적 보고서 번호 : 11분의 96 2011년 10월 6일 일자).

1. 펀치 생검

1. 환자의 피부를 소독. 피내 0.5 ml의 1에 mepivacaine 염산염을 사용하여 조직 검사가 (우선적으로 덜 태양에 노출 된 지역)에서 촬영 될의 피부 부분을 마취 및 멸균 3mm 생검 펀치를 사용하여 피부 조직 검사를 준비, DPBS와 조직 검사 + 1 μL / 1ml를 젠타 마이신을 씻어 제거 지방. DPBS + 겐타 마이신, 스파 아제 (Dispase) II를 흡인 DPBS 완전히 커버 생검 (2.4 U / ml)로 두 번 생검을 씻어 16 품어 - 4 ℃에서 18 시간을.
2. 대기음 스파 아제 (Dispase) 완전히 DPBS로 두 번 씻어 핀셋으로 표피를 제거합니다. 15 ML 튜브에서, 전송 2 ml의 콜라게나 제 2 형 (500 U / ㎖ CDU)을 추가, DPBS로 두 번 생검을 씻고 Collagena 추가SE 최대 5 ml의 총 부피. 37 ° C, 5 % CO _2에서 45 분 동안 인큐베이션.
3. 원심 분리기 (5) 180 XG에 분, 그 후 상층 액을 버린다. 180 x g에서 5 분 다시 10 ml의 DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어 (10 % FCS, 1 μL / ㎖ 젠타 마이신)과 원심 분리기를 Resuspend 펠렛. 1.5 ml의 DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기하십시오. 자기편 조직 배양 플라스크 T25, 37 ° C, 5 % CO _2에서 부화 전송합니다.
4. 3 일마다 미디어를 변경합니다.
5. 후 약 2 주, 세포가 피부 부품, 트립신 / EDTA (0.05 %)를 사용하여 분할 세포 주위에 컨 플루 언트 때 : 세척 세포를 한 번 DPBS로, 37 ℃에서 5 분을 품어, 5 % CO ₂ 2 ㎖의 트립신 / EDTA를 첨가 한 후 (0.05 %), DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어 2 ㎖를 추가 5 분 동안 180 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 전송; DMEM-FCS-겐타 마이신 미디어의 적절한 양 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다.
6. 또한 매체마다 3 ^R을 변화시킴으로써 세포를 확장세포가 합류 할 때 전술 한 바와 같이 D의 하루 분할; 겐타 마이신이 첨가 경과 후 정지 될 수있다.
7. 직접 변환 실험에 대한 세포를 사용하기 전에, 표준 분석에서 마이코 플라스마 오염을 제외해야합니다.
8. 세포가 확장되었을 때, 당신은 직접 변환을 시작하거나 10 % DMSO 90 % FCS를 사용하여 세포를 정지 할 수 있습니다. 세포를 2 일 동안 -80 ° C에 저장하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 전송되어야한다.
9. 변환의 준비를위한, DPBS, 흡인 DPBS 한 번 세포를 씻으 2.5 ml의 트립신 / EDTA (0.05 %)를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO _2에서 5 분 동안 유지합니다. 탭 플라스크 부드럽게 섬유 아세포 배지 2.5 ㎖ (DMEM 포함. L-Glu가 + 10 % FCS + 1 % NEAA + 1 % 나트륨 피루 베이트)에 재현 탁을 세포를 분리하고 15 ㎖의 튜브로 전송. 5 분 180 XG에 원심 분리기와 뜨는을 대기음. 1 ml의 아래로 섬유 아세포 미디어와 피펫 위로에 재현 탁 세포는 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
10. Fuchs의-Rosenthal- 또는 노이 바 우어 - 셀 카운팅 챔버와 플레이트 24 웰 플레이트의 웰 당 3 × ¹⁰⁴ 세포를 이용하여 세포의 수를 계산. 37 ℃, 5 % CO _2에서 O / N을 품어.

센다이 바이러스와 분화 인간의 섬유 아세포 2. 감염

주 : 바이러스 운반 다음 단계 생물학적 안전 캐비넷과 층류 후드에서 점막 노출을 방지하기 위해 적절한 보호 장비, 특히 외과 마스크로 수행 될 필요가, 안전성을 보장한다.

1. 100 μL 섬유 아세포 미디어 (단계 1.9)에 세포를 전환합니다. Oct4-, Klf4-, Sox2-의 분취 및 C-myc의 - 센다이 바이러스를 해동하고 1 ml의 섬유 아세포 미디어에 각각의 바이러스를 재현 탁. 셀 3의 관성 모멘트 (바이러스 역가가 많은에 많이 다릅니다 만, 각각의 바이러스 중 하나 나누어지는 일반적으로 24 잘 플레이트의 10 우물의 감염에 사용할 수 있습니다) 각 바이러스를 추가하고 부드럽게 섞는다. 37 ℃, 5 % CO _2에서 O / N을 품어 .
2. 24 시간의 흡인 후 매체와 neuroinduction 미디어 (: 1 DMEM / F-12로 Neurobasal, 1X N2, 1X B27, 1 % 루타, 10 NG / ㎖ hLIF, 3 μm의 CHIR99021, 2 μm의 SB431542 1)의 500 μl를 추가 지금부터 39 ° C, 5 % CO _2에서 문화. 매일 미디어를 변경합니다.
3. , DPBS에 1 μg의 / ml의 라​​미닌을 희석 6 잘 판에 액 1ml를 추가하고 24 시간 동안 4 ° C에서 유지 : 1 일 6 일 감염 후 라미닌 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
4. 미디어를 기음과 DPBS 한 번 세포를 세척 한 후 DPBS / EDTA의 500 μl를 추가하고 37 ℃, 5 % CO _2에서 10 분 동안 품어 : 7 일에 감염 후 DPBS / EDTA를 사용하여 세포를 분리.
5. DMEM / F12 500 μl를 추가하고 5 분 동안 180 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 판에서 정지를 제거합니다.
6. 뜨는을 기음과 neuroinduction 미디어, 라미닌 코팅 6 잘 접시에 플레이트의 1.5 ml의 펠렛을 재현 탁하고 최종 conce 락 억제제 Y27632 추가39 ° C에서 세포 배양에 10 μM의 ntration, 5 % CO _2.
7. 매일 미디어를 변경합니다.
8. 감염 배양 후 14 일째부터 37 ° C에서 세포, 5 % CO _2. Neuroepithelial 식민지는 위상차 현미경에 의한 감염 후 하루 (17)의 주위에 명확하게. 그들은 감염 후 20 일 주위에 뽑힐 정도로 커야한다.

추정 적 INPC의 식민지 3. 분리

1. 따기 전에 어느 날, 코트 한 48 라미닌 잘 플레이트 : DPBS에 1 μg의 / ml의 라​​미닌을 희석 판에 솔루션 300 μl를 추가하고 24 시간 동안 4 ℃에서 보관하십시오. 어느 날 후에 흡인 라미닌 판에서와 우물에 neuroinduction 매체의 200 μl를 추가합니다.
2. 6 잘 플레이트 잘 당 6 잘 플레이트 식민지를 포함하는이 DPBS 한 번 포착하고 추가 할 2 ML의 DPBS을 씻으십시오. 기계적으로 식민지를 선택 : 세포를 둘러싼 제거하는 얇은 바늘을 사용하여 식민지 주위 긁어; (200)를 설정1, L 50 μL에 pipetman과 각각의 피펫 팁을 사용하여 식민지를 선택합니다.
3. 라미닌 코팅 48 잘 플레이트 잘 하나에 하나의 식민지 각 이동 및 아래로 10 회를 피펫 팅에 의해 기계적으로 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 세포에 10 μm의 최종 농도 락 억제제 Y27632를 추가합니다.
4. 2 일 동안 37 ℃, 5 % CO _2에서 48 잘 접시에 세포를 성장. 90 % 컨 플루 (약 3 - -. 4 일) 세포가 80에 도달 할 때까지의 모든 둘째 날 미디어를 변경합니다.

4. 확장 및 iNPCs의 곳을 알아내는 보존

1. 계대 및 iNPCs 확대
   1. 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. DPBS를 대기음 200 μL의 DPBS / EDTA를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO _2에서 10 분 동안 품어, 추가 DMEM / F12 200 μl를 5 분 동안 180 XG에, 15 ML 튜브에 판에서 원심 분리기를 정지 제거 .
   2. 뜨는을 기음과 neuroi 0.5 ml의 펠렛을 재현 탁nduction 미디어 (2.2 단계), 라미닌 코팅 12 잘 접시에 플레이트와 세포에 10 μm의 최종 농도 락 억제제 Y27632를 추가, 37 ° C에서 문화, 5 % CO _2. 세포가 80에 도달 한 후 - 90 % 포화 상태 그들 중 하나를 추가로 확장 할 수 있습니다 또는 다음과 같이 아래로 고정.
2. iNPCs의 동결
   1. 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. 기음 DPBS와 300μl DPBS / EDTA를 추가하고, 37 ℃, 5 % CO _2에서 10 분 동안 품어, DMEM / F12 300 μl를 추가하고 5 분 동안 180 XG에, 15 ML 튜브에 판에서 원심 분리기를 정지를 제거합니다.
   2. 뜨는을 대기음 및 상업 NSC 동결 매체의 0.5 ml의 펠렛을 재현 탁. 냉동 유리 병에 전송 중단 및 세포 냉동 컨테이너에 넣어. 2 일간 -80 ° C에서 보관 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮긴다.

iNPCs 5. 차별화

1. 뉴런으로 차별화알 계보
   1. 라미닌 - 코팅 된 플레이트에서 배양 된 세포를 전술 한 바와 같이. 세포는 약 70 %이다 신경 DIFF 미디어 (DMEM / F-12, 1X N2, 1X B27, 300 NG / ㎖ 캠프, 200 μm의 비타민 C, 10 NG / ㎖ BDNF, 10 NG / ㎖ GDNF) 미디어를 변경 합류. 3 주 동안 매일 미디어를 변경합니다. 분화 동안하지 분할 세포를 수행합니다.
   2. 삼주 후 세포는 신경 세포 마커 TUJ1을 표현한다. 더 성숙한 신경 세포를 얻고 신경 하위 유형 3 개월 차별화까지 계속합니다.
2. 아교 혈통으로 차별화
   1. 아교 유도 매체 (1 미디어를 변경 : 1 DMEM / F-12로 Neurobasal, 1X N2, 1X B27, 10 μM의 β - 머 캅토 에탄올, 100 μm의 비 필수 아미노산, 1.5 mM의 L 글루타민, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 각 40ng / ㎖의 T3) 20 NG / ㎖ EGF는 신경교 전구 세포로의 분화를 유도하는 방법 등. 미디어의 절반을 제거하고 약 2 주 동안 매일 신선한 매체로 대체합니다. 이 기간 동안 세포는 분리되어야한다1 : 100 % 컨 플루 언시가 10 μM ROCK Y27632 억제제의 존재하에 3에 도달 할 때.
   2. 세포가 상업 사용할 수 성상 세포 미디어에 거의 합류 변경 미디어 때마다 둘째 날 미디어를 변경 : 2 주 후 더 성상 세포에 세포를 분화. 약 7 일 후 세포 성상 세포 마커 (예를 들어, GFAP)을 표현하기 시작합니다. 10 μm의 ROCK 억제제 Y27632의 존재 2 비율 : 세포 분화 프로토콜 동안 100 % 합류를 얻을 경우, 1을 분할합니다.

결과

여기에서는 이하 8주 (도 1) 내에서 피부 생검 펀치에 의해 수득 된 인간 섬유 아세포에서 유도 된 신경 전구 세포 (iNPCs)의 생성을 허용하는 통합 공정에 대한 설명을 제시한다. 환자로, 특정 iNPCs 더 신경 세포와 교세포 계보로 분화 및 세포 대체 요법과 질병 모델링을위한 거대한 잠재력을 정박 할 수있다.

Oct4-, Klf4-, Sox2- 및 C-myc- 센다이와 섬유 아 세포의 감염은 ?...

토론

여기에서 우리는 고립과 확장 형질 전환 유전자가없는 신경 전구 세포로 인간의 섬유 아 세포의 직접 변환 및 세포 대체 요법 또는 약물 검사 분석의 응용 프로그램에 대한 추정 근거로 그들의 차별화 된 자손을 보여줍니다. NPC들에 체세포의 직접 혈통 변환은 혈통 특정 전사의 강제 식 ^{26,33,34 요인에} 의해 달성되었다. 그럼에도 불구하고, 많은 경우에 태아 섬유 아세포는 분화 실험 ^33,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Astrocyte media	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
Biopsy Punch	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
Collagenase Type2	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
Gentamicin	Sigma	G1397
GFAP-antibody	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
Insulin	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67-antibody	NeoMarkers	RM-9106-S
L-Glutamine	LifeTechnologies	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin-antibody	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
Non-essential amino acids	LifeTechnologies	11140-050
NSC freezing media	Sigma	C6295
Oct4-antibody	Santa Cruz	sc9081
Pax6-antibody	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit	LifeTechnologies	A1378001
Sodiumpyruvate	Life Technologies	11360-039
Sox1-antibody	R&D Systems	AF3369
Sox2-antibody	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1-antibody	Covance	MMS-435P-250
Vitamin C	Sigma	A4544
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