Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Zusammenfassung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus adulten Hautfibroblasten und nachfolgende Differenzierung in somatische Zellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten, die Histocompatibility Barrieren zu umgehen. , Die Progression durch einem pluripotenten Zustand und anschließende vollständige Differenzierung in die gewünschten Linien bleibt jedoch ein Hindernis für die klinische Umsetzung von iPS-Technologie wegen der damit verbundenen neoplastischen Potential und genomische Instabilität. Vor kurzem haben wir und andere zeigten, dass Körperzellen kann nicht nur in iPSCs sondern auch in verschiedene Arten von multi somatischen Stammzellen mit definierten Faktoren, wodurch Umgehung Progression durch den pluripotenten Zustand umgewandelt werden. Insbesondere die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten zu induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) kündigt die Möglichkeit eines neuen autologen Zellquelle für verschiedene Anwendungen, wie beispielsweise Zell-Ersatz, Krankheitsmodelleund Wirkstoff-Screening. Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten humanen primären Fibroblasten durch Hautbiopsie und deren effiziente direkte Umwandlung in iNPCs durch rechtzeitige beschränkte Expression von Oct4, Sox2, Klf4, sowie c-Myc. Sox2-positive neuroepithelialen Kolonien erscheinen nach 17 Tagen der Induktion und INPC Linien effizient durch monoklonale Isolation und Expansion geschaffen werden. Genaue Einstellung der virale Multiplizität der Infektion und Ergänzung Leukämiehemmfaktor während der Induktionsphase stellen kritische Faktoren Umwandlungswirkungsgrade von bis zu 0,2% zu erreichen. Bisher konnte patientenspezifischen INPC Linien für mehr als 12 Durchgänge expandiert werden und zeigen morphologische und molekulare Merkmale von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, wie die Expression von Nestin und Sox2 gleichmäßig. Die INPC Linien können in Neuronen und Astrozyten differenziert werden, wie durch Färbung gegen TuJ1 und GFAP bzw. beurteilt. Zusammenfassend haben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung und dire meldenct Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in stabiler Weise erweiterbar neuralen Vorläuferzellen, die eine Zellquelle für biomedizinische Anwendungen, wie beispielsweise autologe neuronalen Zell-Ersatz und Krankheitsmodelle liefern könnten.

Einleitung

Im Jahr 2006 Yamanaka und Kollegen zum ersten Mal zeigen, könnte die Möglichkeit der Reprogrammierung von somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand ^1. Diese Dedifferenzierung wurde durch Überexpression von vier Transkriptions Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc in murinen Fibroblasten erreicht Faktoren. Die erzeugten sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zeigen funktionale Äquivalenz zu embryonalen Stammzellen (ESC) und können so in alle Zelltypen des erwachsenen Organismus differenziert werden. Ein Jahr später Umprogrammierung zu iPSCs könnte auch für die menschliche Fibroblasten ² erreicht werden. Experimente in Tiermodellen zeigen, dass iPSC abgeleiteten Zellen können allgemein zur Zellersatztherapie, beispielsweise bei der Parkinson-Krankheit (PD) ^3-5 verwendet werden. Jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung von iPSCs assoziiert stellen Hindernisse für die volle Verwirklichung der ihr therapeutisches Potential. Zunächst Reprogrammierung von Zellen in einem pluripotenten Zustand und anschließendeQualitätskontrolle ist in der Regel ein zeitaufwendiger und ineffizienter Prozess was in umfangreichen und damit kostspielige Zellkulturverfahren. Zweitens müssen iPSCs in den gewünschten Zelltyp von Interesse, bevor die Biomedizin mit der Wahrscheinlichkeit des Rest pluripotenten Zellen in differenzierten Bevölkerung wieder unterscheiden birgt eine bedeutende tumorerzeugenden Potential und zeigt somit ein hohes Risiko nach Zelltransplantation ^6. Drittens wird die Umprogrammierung in der Regel durch die Induktion der Umprogrammierung Faktoren Lenti- oder retroviralen Infektion erzielt. Die Integration dieser Viren in das Wirtsgenom vielleicht Insertionsmutagenese und / oder unkontrollierte Reaktivierung der Transgene ^7,8 führen. Nicht-integrative Systeme entwickelt worden, um die Umprogrammierung Faktoren liefern an Zielzellen, die das Risiko einer Insertionsmutagenese und Transgen Reaktivierung zu minimieren. Beispiele für diese transgene freie Ansätze sind die Reprogrammierung von Zellen unter Verwendung von nicht-IntegrationAdeno oder Sendaivirus ^9,10, auf DNA basierende Vektoren ¹¹ oder die Anwendung von DNA-freien Verfahren, wie Transfektion von synthetischer mRNA ¹² oder Transduktion von rekombinanten Proteinen ^13,14. Ein weiteres vielversprechendes Verfahren für die Ableitung von Transgen freien iPSC ist die Verwendung von loxP-modifizierten lentiviralen Umprogrammierung Konstrukten und anschließendem Löschen von Transgenen unter Verwendung des Cre-loxP DNA Rekombinationssystem ^15,16.

Ein einfacher Ansatz für die Nervenzellen zu erzeugen, für Zellersatztherapie stellt direkte Umwandlung von Fibroblasten in post-mitotischen Neuronen ^17-20. Vierbuchen et al. Berichteten, dass die Überexpression von Transkriptionsfaktoren ASCL1, BRN2 und Myt1l resultiert in der Erzeugung von 20% Neuronen aus Mäusefibroblasten ^17. Im Jahr 2011 konnte gezeigt werden, dass die gleichen drei Transkriptionsfaktoren in Kombination mit Überexpression von NeuroD1 ermöglichen Transdifferenzierung von menschlichen Fibroblasten in neurons ^19. Menschen verursachten Nervenzellen könnten auch durch Überexpression von ASCL1 und Ngn2 unter dual SMAD- und GSK3β- Hemmung ²⁰ erzeugt werden. Bemerkenswert ist, erzeugt direkte Umwandlung von Fibroblasten in Neuronen eine nicht-proliferative, post-mitotischen Zellpopulation, die keine weitere Expansion und Biobanken zulässt.

Vor kurzem wurde die direkte Umwandlung von Fibroblasten in einer proliferierenden neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulation ^21-26 berichtet. Aus Gründen der Klarheit werden alle diese Zelltypen als induzierte neurale Vorläuferzellen (iNPCs) die in diesem Bericht genannt werden. Han et al. Überexprimiert Brn4, Sox2, c-Myc und Klf4 zu iNPCs generieren. Wie ihre neuronalen Stammzellen Amtskollegen aus entweder primäre Gewebe oder pluripotenten Zellen abgeleitet sind diese iNPCs tripotential und könnte in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten ²¹ unterschieden werden. Unsere Gruppe berichtete eine etwas andere Umwandlung Protokoll mit Überexpression von Sox2, Klf4Und c-Myc und induzierte Oct4-Expression für nur 5 Tage. Mit diesem Ansatz konnten wir stabil wuchernden iNPCs aus murinen embryonalen und adulten Fibroblasten, die komplette Silencing Exponat des Reprogrammierungsfaktoren ²² zu erzeugen. Im Gegensatz zu iPSCs, weiß iNPCs keine tumorigene Potential zeigen nach der Transplantation ^27. Wir verwendeten erfolgreich in einem Tiermodell der Demyelinisierung, Myelin-defizienten Ratten Zellen umgewandelt, die belegen, dass iNPCs sind klinisch nützlich ^22. Bis dahin könnte NPCs nur aus pluripotenten Stammzellen oder primären Nervengewebe ^28-32 erzeugt werden. iNPCs stabil expandierbaren Zellen, kryokonserviert und sind in der Lage, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können. Große Anstrengungen wurden unternommen, um die direkte Umwandlung Protokoll von Maus, menschliche Zellen ^23,26,33,34 anzupassen. Im Jahr 2012 wurde veröffentlicht, dass die Überexpression des einzigen Faktor Sox2 in Fibroblasten ist ausreichend, um Maus und des Menschen iNPCs erzeugen ^{33. Die Autoren berichteten Generation der Menschen iNPCs aus fötalen Vorhautfibroblasten und charakterisiert sie durch Färbung gegen Sox2 und Nestin. Jedoch sind die Zielzellen für die Umprogrammierung verwendet einen sehr speziellen Zelltyp, der nicht zur Verfügung stehen wird in der klinischen Praxis, und es gab keine funktionelle Charakterisierung von umgerechnet Zellen durch Transplantation in einem Tiermodell durchgeführt. Eine neuere Publikation beschreibt die Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen beschränkt aus humanen fötalen Fibroblasten durch Überexpression von Sox2, c-Myc und entweder BRN2 oder Brn4 34. Die erzeugten Zellinien zeigten Selbsterneuerungskapazität und könnte in verschiedene Arten von Anschluß Neuronen differenzieren. Jedoch ist die Verwendung von fötalen Fibroblasten ungünstig, da diese Zellen aus heterogenen Ursprungs und man kann die Anwesenheit von restlichem zB Neuralleiste Stammzellen in den Zubereitungen nicht ausschließen. Im Jahr 2014, Zhu et al. Berichteten über die direkte Umwandlung von erwachsenen Menschen und neoNatal Fibroblasten in tripotential neuralen Vorläuferzellen durch die Überexpression von Sox2 mit Oct4 oder Oct4 allein und Zugabe kleiner Moleküle an die Zellkulturmedien. Bemerkenswert ist, auf der Grundlage ihrer Studien Sox2 allein war nicht ausreichend, um direkte Umwandlung 26 induzieren. In jüngerer Zeit, Lu et al. Berichteten, dass die Überexpression des Yamanaka Faktoren Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc durch Sendai-Virus für 24 h und anschließende Inaktivierung des Virus durch die erhöhte Temperatur resultiert in der Erzeugung von expandierbaren tripotential neuronalen Vorläuferzellen 23. Hieraus folgt, dass die für den menschlichen Zellen veröffentlichten Umrechnungs Protokolle bisher gemeinsam haben, die Überexpression von mindestens einem oder mehreren der Yamanaka Faktoren, oft in einer fristgerechten Art und Weise beschränkt, gibt es keine klare Angabe der minimal molekularen Faktoren notwendig, um zu fahren Direkt Umwandlung in iNPCs. Die rechtzeitige beschränkt die Überexpression von Oct4 entweder durch genetische Mittel, Transfektion mit synthetischer mRNA, oder cell-permeierenden Protein zusammen mit konstitutive Expression Sox2, Klf-4 und c-Myc nicht in stabilen humanen INPC Leitungen führen vor. Somit ist die Anwendung von Sendai-Virus, um alle Yamanaka Faktoren überexprimiert und rechtzeitig zu beschränken ihre Tätigkeit durch Hitze-Inaktivierung des Virus 23 zusammen mit optimierten neuronalen Medien Induktionsbedingungen 22,31 stellt die bevorzugte Strategie so weit.}

Mehrere Studien zeigen, die zelluläre Funktion von NSCs oder deren Gegenstücken unterschieden in verschiedenen Tierkrankheitsmodellen. Neuralen Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen wurden in Maus-Modellen der neuroinflammatorischen Erkrankung Multiple Sklerose ^35,36 verpflanzt worden. Die Anwendbarkeit hES-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen in EAE (experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis) -mice wurde zuerst im Jahr 2008 ³⁵ gezeigt. Multipotenten neuralen Vorläuferzellen wurden in den Ventrikeln des Gehirns der Maus injiziert, und die Transplantationsergebnisbei der Verringerung der klinischen Anzeichen von EAE ed. Kim et al. Erzeugten oligodendroglial Vorstufen von HES-Zellen und in EAE-Mäuse transplantiert diejenigen intracerebroventricularly. Obwohl Transplantate nicht für mehr als 10 Tage überleben, Mäuse zeigten eine signifikante Verbesserung der neurologischen Funktion und Reduktion proinflammatorischer Immunzellen in der weißen Substanz ^36. Stammzelltherapie wurde auch für vorklinische Targeting der Parkinson-Krankheit als NSC erfolgreich für die jeweiligen Tiermodellen eingesetzt werden angewendet. Hierzu wurden Vorläuferzellen entweder aus fötalem Hirngewebe ³⁷ aus pluripotenten Stammzellen ^38-40 oder mesenchymalen Stammzellen ⁴¹ verwendet wurden, unterschieden, abgeleitet. Im Jahr 2012 haben wir gezeigt, dass der Maus iNPCs können Proteolipidprotein, das Hauptmyelinprotein-Komponente, nach der Transplantation in das Gehirn von Myelin-defizienten (md) Ratten ²² zu produzieren. Zu dieser Proof-of-principle experiment das therapeutische applicabilkeit von iNPCs wurde zunächst bewährte und bald von einer anderen Studie ³² bestätigt. , Das volle Potential der Verwendung menschlicher iNPCs bleibt, erkundet zu werden.

Hier zeigen wir eine robuste und integrierten Verfahren (i) Gewinnung menschlicher Primärzellen von erwachsenen Patienten mittels Hautbiopsie, (ii) die direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in einer neuralen Vorläuferzustand und (iii) die Fähigkeit der iNPCs in neuronalen unterschieden und Glia-Linien. Die Verwendung dieses Protokoll wird dazu beitragen, für therapeutische Anwendungen beschleunigen Generation von autologen menschlichen Zellen.

Protokoll

Die menschlichen Fibroblasten in dieser Studie verwendet wurden aus einer Haut Stanzbiopsie nach dem Aufstehen von der Ethikkommission der Universität Würzburg, Deutschland informierte Zustimmung und ethischen Freiraum erhalten (ethische Bericht Nr: 96/11 vom 10.06.2011).

1. Stanzbiopsie

1. Desinfizieren Sie die Haut des Patienten. Betäuben Haut Teil davon Biopsie aus (vorzugsweise weniger sonnenexponierten Bereich) entnommen werden mit 0,5 bis 1 ml Mepivacainhydrochlorid intrakutan und bereiten Hautbiopsie mit einer sterilen 3mm Biopsie Punsch, spülen Biopsie mit DPBS + 1 ul / 1 ml Gentamicin und entfernen Fett. Zweimal spülen Biopsie mit DPBS + Gentamicin, absaugen DPBS vollständig und Abdeckung Biopsie mit Dispase II (2,4 U / ml) und Inkubation von 16 bis 18 Stunden bei 4 ° C.
2. Saugen Sie Dispase vollständig, waschen zweimal mit DPBS und Epidermis mit einer Pinzette entfernen. Zweimal waschen Biopsie mit DPBS, 2 ml Collagenase Typ 2 (500 U / ml CDU), Transfer in 15-ml-Röhrchen und fügen Collagenase bis zu 5 ml Gesamtvolumen. Inkubieren für 45 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
3. Zentrifuge 5 min bei 180 xg und Überstand verwerfen danach. Pellet in 10 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medium (10% FCS, 1 ul / ml Gentamicin) und zentrifugiert erneut 5 min bei 180 x g. Überstand verwerfen und Pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien. Transfer zum adhärenten Zellkulturflasche T25 und bei 37 ° C, 5% CO _2.
4. Ändern Medien alle 3 Tage.
5. Nach etwa 2 Wochen, wenn die Zellen um Hautteile, Split-Zellen unter Verwendung von Trypsin / EDTA (0,05%) konfluent: Wasch Zellen einmal mit DPBS, inkubieren 5 min bei 37 ° C, 5% CO ₂ nach Zugabe von 2 ml Trypsin / EDTA (0,05%), 2 ml DMEM-FCS-Gentamicin-Medien, Transfer zum 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min; Überstand verwerfen und Pellet in entsprechende Menge an DMEM-FCS-Gentamicin-Medien.
6. Weiter ausbauen, die Zellen, indem das Medium alle 3 ^rd Tag und Spaltung wie oben, wenn die Zellen konfluent beschrieben; Zugabe von Gentamycin können nach dem Durchgang 2 angehalten werden.
7. Vor der Verwendung der Zellen zur direkten Umwandlung Experimente, stellen Sie sicher, Mycoplasmenkontamination von Standardtests auszuschließen.
8. Wenn Zellen wurden erweitert, können Sie direkt die Konvertierung zu starten oder Gefrierzellen nach unten mit 10% DMSO und 90% FCS. Zellen sollten in -80 ° C für 2 Tage gelagert und dann in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung überführt.
9. Für die Herstellung der Umwandlung, waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, absaugen DPBS und fügen Sie 2,5 ml Trypsin / EDTA (0,05%). Halten für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO _2. Tap Kolben sanft zu Zellen in 2,5 ml Fibroblastenmedium (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% Natriumpyruvat) abzunehmen, resuspendieren und Transfer auf 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 180 × g für 5 min und saugt den Überstand. Die Zellen in 1 ml Fibroblasten Medien und Pipette auf und ab, um Einzelzellsuspension zu erzeugen.
10. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Fuchs-Rosenthal- oder Neubauer-Zellzählung Kammer und Platte 3 x 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO _2.

2. Infektion von menschlichen Fibroblasten mit Sendai-Virus und Transdifferenzierung

HINWEIS: Um die Sicherheit zu gewährleisten, werden die folgenden Schritte Umgang mit Virus in einer biologischen Sicherheitswerkbank und einer Steril und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, insbesondere einem OP-Maske, um Schleimhaut-Exposition zu verhindern durchgeführt werden.

1. Schaltzellen zu 100 ul Medium Fibroblasten (Schritt 1.9). Auftauen Aliquots von Oct4-, Klf4-, Sox2- und c-myc-Sendai-Virus und Resuspendieren jedes Virus in 1 ml Fibroblastenmedium. Fügen Sie jede Virus mit einer MOI von 3 bis Zellen (Virustiter variiert von Charge zu Charge, aber man Aliquot jeder Virus kann in der Regel für die Infektion von 10 Wells einer 24-Well-Platten verwendet werden) und vorsichtig mischen. Inkubieren O / N bei 37 ° C, 5% CO ₂ .
2. Nach 24 Stunden absaugen das Medium und fügen Sie 500 ul neuroinduction Medien (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) und Kultur bei 39 ° C, 5% CO ₂ von nun an. Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien.
3. Am Tag 6 nach der Infektion vorbereiten Laminin beschichteten 6-Well-Platten: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, 1 ml der Lösung auf 6 Well-Platten und halten bei 4 ° C für 24 Stunden.
4. Am Tag 7 nach der Infektion der Zellen unter Verwendung aufgeteilt DPBS / EDTA: absaugen Medien und wasche die Zellen einmal mit DPBS, dann fügen 500 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO _2.
5. Fügen Sie 500 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15-ml-Tube und Zentrifuge bei 180 xg für 5 min.
6. Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 1,5 ml neuroinduction Medien, Teller auf Laminin beschichteten 6 Well-Platten und fügen ROCK-Inhibitor Y27632 in einem letzten concentration von 10 & mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 39 ° C, 5% CO _2.
7. Ändern Sie jeden zweiten Tag die Medien.
8. Von Tag 14 nach der Infektion Kultur werden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO _2. Neuroepithelialen Kolonien werden nach der Infektion durch Phasenkontrastmikroskopie offensichtlich um Tag 17. Sie sollte groß genug sein, um 20 Tage nach der Infektion aufgenommen werden können.

3. Isolierung von mutmaßlichen INPC Kolonien

1. Einen Tag vor Kommissionierung überfällt eine 48 Well-Platte mit Laminin: Laminin verdünnt, um 1 ug / ml in DPBS, fügen Sie 300 ul Lösung auf Teller und halten bei 4 ° C für 24 Stunden. Einen Tag später absaugen Laminin aus Platten und fügen Sie 200 ul neuroinduction Medien in die Vertiefungen.
2. Waschen Sie die 6-Loch-Platten, die die Kolonien auf einmal mit DPBS abgeholt und 2 ml DPBS pro Vertiefung 6 Well-Platte. Wählen Sie die Kolonien mechanisch: kratzen Sie an Kolonien mit einer dünnen Nadel in der umgebenden Zellen loszuwerden; stellen Sie die 2001; l Pipetman auf 50 & mgr; und wählen Sie die Kolonien unter Verwendung der jeweiligen Pipettenspitzen.
3. Übertragen Sie jede eine Kolonie in eine Vertiefung einer Laminin beschichteten 48-Well-Platte und erzeugen eine Einzelzellsuspension mechanisch durch Auf- und Abpipettieren 10 mal. Hinzuzufügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 & mgr; M zu den Zellen.
4. Wachsen die Zellen auf 48-Well-Platte bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 2 Tage. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, bis die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz (ca. 3 -. 4 Tage).

4. Ausbau und Kryokonservierung von iNPCs

1. Passagieren und Ausbau der iNPCs
   1. Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie das DPBS und fügen Sie 200 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO _2, fügen Sie 200 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min .
   2. Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml Neuroinduction Medien (Schritt 2.2), Platte auf Laminin-beschichtete 12-Well-Platten und fügen ROCK Inhibitor Y27632 in einer Endkonzentration von 10 & mgr; M zu den Zellen, der Kultur bei 37 ° C, 5% CO _2. Nachdem die Zellen 80 zu erreichen - 90% Konfluenz sie entweder weiter ausgebaut oder gefroren sich wie folgt sein.
2. Einfrieren von iNPCs
   1. Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. Saugen Sie die DPBS und fügen Sie 300 ul DPBS / EDTA und Inkubation für 10 min bei 37 ° C, 5% CO _2, fügen Sie 300 ul DMEM / F12 und Suspension zu entfernen von der Platte in einer 15 ml Tube, Zentrifuge bei 180 xg für 5 min.
   2. Saugt den Überstand und das Pellet in 0,5 ml handelsüblicher NSC Einfriermedium. Transfer Suspension auf das Einfrieren Fläschchen und in Zell-Gefrierbehälter setzen. Bei -80 ° C für 2 Tage, dann in flüssigen Stickstoff über für langfristige Lagerung.

5. Differenzierung iNPCs

1. Differenzierung gegenüber Neuronal-Linie
   1. Kultur Zellen auf Laminin-beschichteten Platten, wie oben beschrieben. Verändern Medien neuro diff-Medium (DMEM / F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 uM Vitamin C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF), wenn die Zellen bei etwa 70% konfluent. Ändern Medien jeden zweiten Tag für drei Wochen. Nicht spalten Zellen während der Differenzierung.
   2. Nach drei Wochen sollte die Zellen neuronalen Marker TuJ1 auszudrücken. Um reifer Neuronen gewinnen und neuronale Subtypen weiter Differenzierung bis zu 3 Monaten.
2. Differenzierung gegenüber Gliazellen Abstammung
   1. Verändern Medien glial Induktionsmedium (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 100 & mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren, 1,5 mM L-Glutamin, 5 ug / ml Insulin, 40 ng / ml T3) mit 20 ng / ml EGF, um die Differenzierung in glialen Vorläuferzellen zu induzieren. Entfernen Sie die Hälfte der Medien und ersetzen durch frisches Medium jeden zweiten Tag für ca. 2 Wochen. Während dieser Zeit sollten die Zellen aufgeteilt werden1: 3 in Gegenwart von 10 uM ROCK Inhibitor Y27632 bei 100% Konfluenz erreicht wird.
   2. Nach 2 Wochen differenzieren Zellen weiter in Astrozyten: Wenn Zellen nahezu konfluenten Wechselmedien zu kommerziellen verfügbar Astrozyten Medien, ändern Medien jeden zweiten Tag. Nach ca. 7 Tagen Zellen beginnen, Astrozyten Marker (zB GFAP) zum Ausdruck bringen. Wenn Zellen 100% konfluent während der Differenzierung Protokoll, teilen Sie sie in einem Verhältnis 1: 2 in Gegenwart von 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor Y27632.

Ergebnisse

Hier stellen wir Beschreibung eines integrierten Verfahrens, das die Erzeugung von induzierten neuronalen Progenitorzellen (iNPCs) aus humanen Fibroblasten, die durch eine Stanzbiopsie von der Haut innerhalb von weniger als 8 Wochen (Figur 1) erhalten worden sind, ermöglicht. Patient-specifc iNPCs kann weiter in neuronalen und glialen Linien unterschieden werden und bergen ein enormes Potenzial für Zellersatztherapie und Krankheit Modellierung.

Infektion der Fibroblasten m...

Diskussion

Hier zeigen wir die Isolierung und direkte Umwandlung von menschlichen Fibroblasten in erweiterbaren Transfreien neuralen Vorläuferzellen und deren differenzierte Nachkommen als vermeintlichen Grundlage für Zell-Ersatz-Therapie oder eine Anwendung in Arzneimittel-Screening-Analysen. Direkte Linie Umwandlung von Körperzellen in NPCs wurde von Zwangs Ausdruck der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren ^26,33,34 erreicht. Dennoch wird in vielen Fällen fötalen Fibroblasten wurden zur Trans Experimente

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Astrocyte media	ScienCell	1801
B27	LifeTechnologies	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
Biopsy Punch	pfm medical	48301
cAMP	Sigma	A6885
CHIR99021	Axon medchem	1386
Collagenase Type2	Worthington Biochemical	LS004177
Dispase	PAN	P10-032100
DMEM	LifeTechnologies	41966-029
DMEM F12	LifeTechnologies	11320-033
DMSO	Roth	4720
DPBS	LifeTechnologies	14190-094
EGF	Life Technologies	PHG0313
FCS	Biochrom AG	50115
GDNF	Peprotech	450-10
Gentamicin	Sigma	G1397
GFAP-antibody	Dako	Z0334
GlutaMAX	LifeTechnologies	35050-038
hLIF	Peprotech	300-05
Insulin	Seralab	GEM-700-112-P
Ki67-antibody	NeoMarkers	RM-9106-S
L-Glutamine	LifeTechnologies	25030-024
Laminin	Sigma	L2020
N2	LifeTechnologies	17502-048
Nestin-antibody	R&D Systems	MAB1259
Neurobasal	LifeTechnologies	21103-049
Non-essential amino acids	LifeTechnologies	11140-050
NSC freezing media	Sigma	C6295
Oct4-antibody	Santa Cruz	sc9081
Pax6-antibody	Covance	PRB-278P
SB431542	Invivogen	inh-sb43
Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit	LifeTechnologies	A1378001
Sodiumpyruvate	Life Technologies	11360-039
Sox1-antibody	R&D Systems	AF3369
Sox2-antibody	R&D Systems	MAB2018
T3	Santa Cruz	sc-205725
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
TUJ1-antibody	Covance	MMS-435P-250
Vitamin C	Sigma	A4544
Y27632	Calbiochem	CAS 146986-50-7
β-Mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985023