تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

Summary

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Abstract

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N₂ gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 µm because too high a flow rate of N₂ gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl₂ causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

Introduction

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient¹. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 × 10⁵ cells/cm², thus requiring 1 m² of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier² and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells³. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage³ or differentiation⁴.

Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose⁵, PEG⁶, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg−Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl₂ solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents.

Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N₂ gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N₂ and concentration of both CaCl₂ and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

Protocol

1. المواد إعداد

1. إعداد 10 ملي HEPES العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT وإضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.9٪.
2. تحضير 5٪ محلول الجينات وحل 10 ملي EDTA عن طريق خلط المياه المالحة HEPES مخزنة أعد في 1.1. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT.
3. الأوتوكلاف الكواشف (1.1، 1.2) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
4. إعداد 60 ملم أطباق الجيلاتين المغلفة الطبقات مع 1،2-2،0 × 10 ⁶ الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) الخلايا، والتي يتم التعامل معها على أنها الخلايا المغذية التي كتبها حضانة داخل DMEM تحتوي على 10٪ FBS ES-المؤهلة و 10 ميكروغرام / مل من ميتوميسين مئوية لمدة 90 - 120 دقيقة.
5. الحفاظ على الماوس الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا على الطبق مع الخلايا المغذية في وجود 5 مل DMEM الجلوكوز المرتفعة تحتوي على 20٪ من ES-مؤهل FBS، 50 ميكرومتر من 2 المركابتويثانول، الأحماض الأمينية غير الأساسية، والمضادات الحيوية ( 100 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم، و 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين، و 250 نانوغرام / مل من amphoteriCIN B).
6. البذور 4 × 10 ⁵ خلايا الجذع على 60 مم طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم أثناء الحضانة. بعد 3-4 أيام من الثقافة، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 1 دقيقة مع 500 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين التي تحتوي على 0.02٪ EDTA عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪. بعد ذلك، فصل الخلايا عن طريق التنصت على طبق ثقافة عشر مرات.
7. إضافة 2.5 مل من DMEM مع 10٪ من FBS والمضادات الحيوية ES-مؤهل (بعد تفكك خلايا الجذع الماوس إلى الخلايا واحد من قبل pipetting مع 1000 ميكرولتر micropipette ثلاث مرات) تعليق خلية الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة طاف وعدد الخلايا . بعد عد الخلايا، RESEED الخلايا التي جمعت على طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لمدة 30 دقيقة لعزل خلايا الجذع من الخلايا MEF. بعد فرز الخلايا (عادة 1-3 × 10 ⁶ خلية / طبق يمكن جمعها)، RESEED 4 × 10 ⁵ الجذع الخلايا علىالصحن.

2. تغليف الخلية إلى الجيني هيدروجيل كبسولات

1. جمع الخلايا عن طريق نفس الإجراء الموضح في 1.5 و 1.6. بعد الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق، ويغسل بيليه خلية الجذع مع المياه المالحة HEPES مخزنة ثلاث مرات. بعد إعادة تعليق-الخلايا في المياه المالحة HEPES مخزنة، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر من أجل إزالة الركام الكبيرة، التي يمكن أن تسد إلا فوهة.
2. خلط 2 مل من تعليق خلية داخل المالحة HEPES مخزنة و3 مل من 5٪ ALG-نا الحل. أخيرا 5 مل من تعليق خلية داخل 3٪ ALG-نا الحل يتم الحصول. كثافة الخلية يستحسن أكثر من 10 ⁶ خلية / مل.
3. بعد جمع تعليق خلية في حقنة 5 مل، تثبيت المشارك المحوري فوهة (الشكل 1A، B) على حقنة وتضعها على ضخ حقنة. تنبعث N ₂ تدفق الغاز (أقل من 1L / دقيقة) من خلال إبرة الخارجية للفوهة المشارك المحوري وطرد تعليق الخلية من خلال فوهة الداخلية.
4. جمع قطرات إلى 250 مل من 0.5٪ CaCl ₂ الحل والانتظار 10-20 دقيقة للدبق مع التحريك في 60-90 دورة في الدقيقة.

3. علاج الجيني كبسولات (اختياري)

1. احتضان كبسولات ALG-كا في 0.05٪ (وزن / حجم) بولي-L-ليسين (PLL) حل لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
2. بعد غسل كبسولات مع المياه المالحة HEPES مخزنة، احتضان لهم في DMEM تحتوي على 10٪ FBS من أجل تحييد الشحنات الكهربائية على سطحها. الاستفادة منها في كبسولات مغلفة (الشكل 1C).
3. احتضان الكبسولات في المياه المالحة HEPES مخزنة التي تحتوي على 10 ملي EDTA لمدة 5 دقائق. وتستخدم الكبسولات المعالجة EDTA في كبسولات جوفاء (الشكل 1C).

4. الثقافة وجمع الخلايا في الجينات كبسولات

1. احتضان خلايا مغلفة في 75 دورة في الدقيقة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂لمدة 10 يوما.
2. جمع واحتضان الكبسولات في 10 ملي EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 10 دقيقة. جمع الخلايا من كبسولات الجينات من دون علاج PLL بواسطة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3 دقائق.
3. إذا تعامل كبسولات الجينات مع PLL، وكسر الغشاء ALG-PLL من قبل pipetting صعودا وهبوطا نحو عشرة مرات مع إبرة تعلق على حقنة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1000 - 5000 × ز لمدة 5 دقائق. يجب أن تكون إبرة قطرها أقل من حجم كبسولة و 25 G تستخدم (260 ميكرون) الإبر في هذه التجربة (600 ميكرون)
4. بعد الطرد المركزي، وجمع بيليه الخلية بدقة من كسر الأغشية ALG-PLL إذا كنت ترغب في جمع عينات مرنا من الخلايا. تبقى الأغشية ALG-PLL ربما يمنع تنقية مرنا.

النتائج

في بروتوكول 2.5، حل الجينات طرد يشكل كروية الشكل على الفور بعد طرد (الشكل 2A - H). إذا تم طرد تعليق مع معدل تدفق N ₂ أقل من 1L / دقيقة، وحجم قطرات موحد (الشكل 2I). ومع ذلك، إذا كان تدفق N ₂ أعلى من 1L / دقيقة، الحبرية ينهار (الشكل 2G، arrowed الأبيض) ...

Discussion

ويمكن مقارنة الثقافة التغليف مع الثقافات تعليق المباشرة. ثقافة تعليق هو أبسط طريقة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا الجذعية المحفزة من أساليب التغليف. ومع ذلك، والسيطرة على تجميع الخلايا في الثقافة تعليق لا تزال صعبة. في طريقة التغليف، والتجميع الخلوية محدودة ف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse embryo fibroblast	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES qualified  FBS	GIBCO	16141079
Antibacterial Antibiotics	GIBCO	15240
Nonessential Amino Acid	GIBCO	11140
2-mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G needle	Hoshiseido
10 ml Syringe	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Chloride	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Sodium Alginate	Wako	194-09955
Calcium Chloride	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge pump	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3