Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Zusammenfassung

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Zusammenfassung

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N₂ gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 µm because too high a flow rate of N₂ gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl₂ causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

Einleitung

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient¹. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 × 10⁵ cells/cm², thus requiring 1 m² of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier² and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells³. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage³ or differentiation⁴.

Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose⁵, PEG⁶, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg−Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl₂ solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents.

Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N₂ gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N₂ and concentration of both CaCl₂ and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

Protokoll

1. Vorbereitung Materialien

1. Herstellung von 10 mM HEPES-Puffer. Den pH-Wert auf 7,0 bei RT und fügen NaCl auf 0,9%.
2. Bereiten Sie 5% Alginat-Lösung und 10 mM EDTA-Lösung durch Mischen von HEPES-gepufferte Kochsalzlösung in 1.1 vorbereitet. Man stellt den pH auf 7,0 bei RT.
3. Autoklaven werden die Reagenzien (1.1, 1.2) für 20 Minuten bei 121 ° C.
4. Vorbereitung Gelatine beschichteten 60 mm-Schalen mit 1,2 geschichtet - 2,0 × 10 ⁶ embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Zellen, die als Feeder-Zellen durch Inkubation in DMEM, das 10% ES-qualifizierte FBS und 10 ug / ml Mitomycin C für 90 behandelt werden, - 120 min.
5. Aufrechterhaltung der Maus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Zellen auf der Schale mit der Feeder-Zellen in Gegenwart von 5 ml DMEM mit hohem Glucose mit 20% ES-qualifizierte FBS, 50 uM 2-Mercaptoethanol, nicht-essentielle Aminosäure und Antibiotika ( 100 Einheiten / ml Penicillin G Natrium, 100 & mgr; g / ml Streptomycinsulfat, und 250 ng / ml amphotericin B).
6. Seed 4 x 10 ⁵ Zellen auf einer iPS Gelatine beschichteten 60 mm-Schale und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2. Ändern Sie das Kulturmedium täglich während der Inkubation. Nach 3-4 Tagen Kultur trypsinize Zellen für 1 min mit 500 ul 0,05% Trypsin, enthaltend 0,02% EDTA bei 37 ° C und 5% CO _2. Danach lösen Zellen durch Antippen der Kulturschale zehnmal.
7. In 2,5 ml DMEM mit 10% der ES-qualifizierte FBS und Antibiotika (nach Dissoziation Maus iPS-Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren mit 1000 ul Mikropipette dreimal) Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 3 min und entfernen Überstand und zählen Sie die Zellen . Nach Zellzählung, ein erneutes Seeding der gesammelten Zellen auf einem mit Gelatine beschichtete Schale und Inkubation für 30 min, um die iPS-Zellen aus den MEF-Zellen zu isolieren. Nach dem Zählen der Zellen (in der Regel 1 bis 3 x 10 ⁶ Zellen / Schale gesammelt werden kann), reseed 4 × 10 ⁵ Zellen auf iPSder Teller.

2. Zell Encapsulation in Alginat-Hydrogel-Kapseln

1. Sammeln Sie die Zellen, die durch in 1.5 und 1.6 beschrieben das gleiche Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 160 × g für 3 Minuten, waschen Sie die iPS-Zellpellet mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung dreimal. Nach Resuspendieren der Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, Filtern der Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m Zellsieb um große Aggregate, die andernfalls die Düse verstopfen können.
2. Mix 2 ml der Zellsuspension in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung und 3 ml 5% Alg-Na-Lösung. Schließlich 5 ml Zellsuspension innerhalb von 3% Alg-Na-Lösung erhalten wird. Zelldichte ist wünschenswerterweise mehr als 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Nach dem Sammeln der Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze, installieren Sie eine koaxiale Düse (1A, B) auf der Spritze und setzen Sie sie auf Spritzenpumpe. Emit N _{2 -Gasstrom} (niedriger als 1 l / min) durch die äußere Nadel des koaxialen Düse undvertreiben die Zellsuspension durch die innere Düse.
4. Sammeln Tröpfchen in 250 ml einer 0,5% CaCl ₂ -Lösung und warten 10-20 min zur Gelbildung unter Rühren bei 60-90 Umdrehungen pro Minute.

3. Behandlung von Alginat-Kapseln (optional)

1. Alg-Ca Kapseln Inkubieren in 0,05% (w / v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung für 5 min bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Nach dem Waschen der Kapseln mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, inkubieren in DMEM enthaltend 10% FBS, um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren. Nutzen sie als überzogene Kapseln (Abbildung 1c).
3. Inkubieren der Kapseln in HEPES-gepufferter Salzlösung, enthaltend 10 mM EDTA für 5 min. Die EDTA-behandelten Kapseln sind als Hohlkapseln (1C) eingesetzt.

4. Kultur und sammeln Zellen in Alginat-Kapseln

1. Die eingekapselten Zellen mit 75 UpM mit inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ Schüttelnfür 10 Tage.
2. Sammeln und inkubieren der Kapseln in 10 mM EDTA bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 10 min. Sammeln Zellen aus den Alginatkapseln ohne PLL-Behandlung durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min.
3. Wenn Alginat Kapseln mit PLL behandelt, brechen die Alg-PLL Membran durch Auf- und Abpipettieren rund zehnmal mit einer Nadel an einer Spritze und Zentrifuge es bei 1000 angebracht - 5.000 × g für 5 min. Nadeldurchmesser sollte niedriger sein als Kapselgröße und 25 g (260 & mgr; m) Nadeln werden in diesem Experiment verwendet werden (600 um)
4. Nach dem Zentrifugieren sammeln Zellpellet strikt von gebrochenen Alg-PLL-Membranen, wenn Sie mRNA Proben von Zellen zu sammeln möchten. Verbleibende Alg-PLL Membranen möglicherweise verhindern, dass mRNA Reinigung.

Ergebnisse

Bei Protokoll 2.5, die vertrieben Alginat-Lösung bildet sofort eine Kugelform nach Vertreibung (2A - H). Wenn die Suspension mit einer N ₂ Durchflussrate von weniger als 1 l / min ausgestoßen, der Größe der Tröpfchen einheitlicher (2I). Wenn die N _{2 -Strom} größer ist als 1 l / min, unterbricht jedoch die Tröpfchen unten (Figur 2G, weiße Pfeile) und die Größe der Tröpfchen heterogen (2J). Angesichts dieser Tatsache ist e...

Diskussion

Encapsulation Kultur kann mit direktem Suspensionskulturen verglichen werden. Suspensionskultur ist eine einfachere Methode, um große Mengen von pluripotenten Stammzellen als Einkapselungsverfahren erhalten. , Steuerung der Aggregation von Zellen in Suspensionskultur ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Im Verkapselungsverfahren wird Zellaggregation in Kapseln beschränkt und kann daher gut kontrolliert werden. In einer früheren Publikation zeigte, dass eingekapselten Zellen gebildeten Aggregate von einhe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse embryo fibroblast	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES qualified  FBS	GIBCO	16141079
Antibacterial Antibiotics	GIBCO	15240
Nonessential Amino Acid	GIBCO	11140
2-mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G needle	Hoshiseido
10 ml Syringe	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Chloride	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Sodium Alginate	Wako	194-09955
Calcium Chloride	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge pump	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3