Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Summary

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Abstract

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N₂ gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 µm because too high a flow rate of N₂ gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl₂ causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

Introduction

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient¹. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 × 10⁵ cells/cm², thus requiring 1 m² of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier² and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells³. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage³ or differentiation⁴.

Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose⁵, PEG⁶, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg−Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl₂ solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents.

Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N₂ gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N₂ and concentration of both CaCl₂ and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

Protocol

1. חומרי הכנה

1. הכן 10 חיץ HEPES מ"מ. התאם את ה- pH 7.0 ב RT ולהוסיף NaCl 0.9%.
2. הכן 5% פתרון אלגינט ופתרון 10 מ"מ EDTA על ידי ערבוב מלח HEPES שנאגר ערוכים 1.1. התאם את ה- pH 7.0 ב RT.
3. החיטוי חומרים כימיים (1.1, 1.2) במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
4. להכין מאכלי 60 מ"מ מצופה ג'לטין שכבתי עם 1.2-2.0 פיברובלסטים עכבר עובריים × 10 ⁶ (MEF) תאים, אשר נחשבים כתאים מזינים על ידי דגירה בתוך DMEM המכיל 10% FBS ES-מוסמך ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר של C mitomycin 90 - 120 דקות.
5. לשמור על גזע pluripotent עכבר מושרה (iPS) תאים בצלחת עם התאים מזינים בנוכחות 5 מיליליטר הגבוה של גלוקוז DMEM המכיל 20% של ES-המוסמך FBS, 50 מיקרומטר של 2-mercaptoethanol, חומצת אמינו לא חיונית, ואנטיביוטיקה ( 100 / מיליליטר יחידות של פניצילין G נתרן, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של סולפט סטרפטומיצין, ו -250 / מיליליטר ng של amphoteriCIN B).
6. זרע 4 × ⁵ תאי iPS 10 על צלחת 60 מ"מ מצופה ג'לטין ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לשנות את מדיום התרבות בכל יום במהלך דגירה. לאחר 3-4 ימים של תרבות, trypsinize תאי דקות 1 עם 500 μl של 0.05% טריפסין המכיל EDTA 0.02% על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. אחרי זה, לנתק את התאים על ידי הקשה על צלחת התרבות עשר פעמים.
7. להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM עם 10% מהשעית תא צנטריפוגות ES-מוסמכת FBS ואנטיביוטיקה (להלן תאי iPS עכבר ניתוק לתוך תאים בודדים ידי pipetting עם micropipette 1000 μl שלוש פעמים) בשעה 160 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר supernatant ולספור את התאים . בעקבות ספירת תאים, לזרוע תאים שנאספו על צלחת ג'לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות לבודד את תאי iPS מתאי MEF. לאחר הספירה של התאים (בדרך כלל 1-3 × 10 ⁶ תאים / מנה יכולה להיות שנאספו), reseed 4 × 10 ⁵ תאים iPS עלהצלחת.

2. תא Encapsulation לאלגינט Hydrogel קפסולות

1. לאסוף את התאים על ידי אותו ההליך מתואר ב1.5 ו -1.6. בעקבות צנטריפוגה 160 × גרם במשך 3 דקות, לשטוף את התא גלולה iPS עם מי מלח HEPES שנאגר שלוש פעמים. לאחר מחדש השעיית התאים בתמיסת מלח HEPES שנאגר, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר תא כדי להסיר אגרגטים גדולים, שעלולים לסתום את החרירים.
2. מערבבים 2 מיליליטר של השעיה תא בתוך תמיסת מלח HEPES שנאגר ו 3 מיליליטר של 5% פתרון ALG-Na. לבסוף 5 מיליליטר של השעיה תא בתוך 3% פתרון ALG-Na מתקבל. צפיפות תאים היא desirably יותר מ 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
3. לאחר איסוף ההשעיה התא לתוך מזרק 5 מיליליטר, להתקין זרבובית שיתוף צירי (איור 1 א ', ב') על המזרק ולהגדיר אותם על משאבת מזרק. זרימת גז ₂ לפלוט N (נמוך מ1 ליטר / דקה) באמצעות המחט החיצונית של נחיר קואקס ולגרש את ההשעיה התא דרך הנחיר הפנימי.
4. לאסוף טיפות לתוך 250 מיליליטר של 0.5% פתרון CaCl ₂ ולהמתין 10 - 20 דקות לgelation תוך ערבוב ב60-90 סל"ד.

3. טיפול באלגינט קפסולות (אופציונאלי)

1. דגירה כמוסות ALG-Ca ב0.05% (w / v) פתרון פולי-L ליזין (PLL) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. לאחר שטיפת הכמוסות עם מי מלח HEPES שנאגר, דגירתם בDMEM המכיל 10% FBS כדי לנטרל את המטען החשמלי על פני השטח שלהם. לנצל אותם ככמוסות מצופים (איור 1 ג).
3. דגירה הכמוסות במלח HEPES שנאגר המכיל 10 mM EDTA במשך 5 דקות. הכמוסות טופל EDTA מנוצלות ככמוסות חלולות (איור 1 ג).

4. תאי תרבות ואיסוף בקפסולות אלגינט

1. דגירה התאים במארז ב 75 סל"ד עם רעד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂במשך 10 ימים.
2. לאסוף דגירה הכמוסות ב 10 מ"מ EDTA על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 10 דקות. איסוף תאים מכמוסות אלגינט ללא טיפול PLL על ידי צנטריפוגה בז × 1,000 3 דקות.
3. אם מטופלים כמוסות אלגינט עם PLL, לשבור את קרום ALG-PLL ידי pipetting למעלה ולמטה כעשר פעמים עם מחט מחוברת למזרק ו צנטריפוגות זה ב 1000 - 5000 × גרם במשך 5 דקות. קוטר מחט צריך להיות נמוך יותר מגודל כמוסה ו -25 G מחטים (260 מיקרומטר) משמשות בניסוי זה (600 מיקרומטר)
4. לאחר צנטריפוגה, לאסוף תא גלולה לחלוטין מקרומי ALG-PLL שבור אם אתה רוצה לאסוף דגימות ה- mRNA מהתאים. קרומי ALG-PLL נותרו אולי למנוע טיהור mRNA.

תוצאות

בפרוטוקול 2.5, פתרון אלגינט גורש יוצר צורה כדורית מייד לאחר הגירוש (איור 2 א - ח). אם ההשעיה הוא גורש עם קצב זרימה N ₂ נמוך יותר מאשר 1 ליטר / דקה, גודל הטיפות הוא אחיד (איור ט 2). עם זאת, אם את זרימת N ₂ היא גבוהה יותר מאשר 1 ליטר / דקה, הטיפה מתפרקת

Discussion

תרבות Encapsulation ניתן להשוות עם תרבויות השעיה ישירות. תרבות השעיה היא שיטה פשוטה כדי להשיג כמויות גדולות של תאי גזע pluripotent מאשר שיטות אנקפסולציה. עם זאת, השליטה הצבירה של תאים בתרבית השעיה היא עדיין מאתגרת. בשיטת אנקפסולציה, צבירה סלולרית מוגבלת בכמוסות וניתן לשלוט ו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse embryo fibroblast	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES qualified  FBS	GIBCO	16141079
Antibacterial Antibiotics	GIBCO	15240
Nonessential Amino Acid	GIBCO	11140
2-mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G needle	Hoshiseido
10 ml Syringe	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Chloride	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Sodium Alginate	Wako	194-09955
Calcium Chloride	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge pump	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3