العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

Summary

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Abstract

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Introduction

The cancer research community has known of the existence of circulating tumor cells (CTCs) since first being observed by Thomas Ashworth in 1869¹. Since then, CTCs have been shown to be important in tumor metastasis and disease progression^2-5. Today, solid tumors are a major cause of morbidity and mortality worldwide. CTCs are rare cells that originate from primary tumors and travel through the blood stream to different organs of which only a small fraction ultimately develop into metastasis^2-5. Notably, there is positive correlation between tumor size and CTC number^3,4.

An understanding of CTC biology can contribute to the search for targeted therapy. Furthermore, CTCs may have diagnostic applications. To achieve these potential clinical applications, one needs to overcome some current challenges to studying CTCs. One challenge is related to the fact that CTCs may be present as single cells or as clusters and they may even be able to change their phenotype in response to the blood microenvironment². Moreover, detection can be very challenging, in part, due to the low count of CTCs (a few to hundreds per milliliter) among one billionhematologic cells per milliliterin the blood⁶. Nevertheless, in recent years, research into the potential clinical applications of CTCs from solid organ cancers has intensified.

Despite these efforts, the challenges of studying and understanding the role of CTCs persist due to the rarity of CTCs and the inadequacy of the technological tools currently available. Despite these challenges, the tremendous potential for clinical applications continues to be an incentive to pursue research into the role of CTCs in cancer metastasis.

We were recently successful in isolating and propagating in cell culture CTCs from an orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis⁵. The purpose of the current paper is to describe in detail all aspects of the successful methodology. The significance of this methodology lies in the fact that this approach may be modified in order to successfully isolate and propagate in culture human CTCs, thus enhancing the possibility of in vitro studies of CTC biology.

There are multiple potential clinical applications for the use of CTCs. CTCs may be useful for prognosis, response monitoring, screening, dynamic monitoring of tumor molecular alterations, and personalized therapy⁴. Therefore, a better understanding of the biology of CTCs has high potential for clinical impact.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من كلية هنتر في جامعة مدينة نيويورك.

1. إجراءات ما قبل التجربة

1. ولدى وصوله إلى منشأة الحيوان، إيواء البداية 3 BALB / ج الفئران إلى قفص مع كبار ورقائق الخشب الفراش تصفيتها. تأكد من أن الفئران لديها حرية الوصول إلى المواد الغذائية، بورينا طعام القوارض والمياه. يجب تغيير الفراش والطعام مرتين في الأسبوع، بينما يجب تنظيف الأقفاص مرة واحدة في الأسبوع.
2. حمل التخدير العام في الفئران باستخدام المرذاذ الأيزوفلورين جنبا إلى جنب مع الأكسجين بمعدل تدفق ثابت من 1 L لكل دقيقة. هذا النظام هو الاعتماد على الذات ويشمل المرذاذ الدقة.
3. الحيوان الموقف في مربع من البلاستيك الذي يحتوي على المرذاذ الدقة والغاز / نظام مخدر لأنها مرتبطة. حددت في البداية المرذاذ إلى 2.5 حتى الحيوان فاقد الوعي، وعند هذه النقطة خفض المرذاذ إلى 2.
4. في ذلك الوقت، والتبديلخط صمام، وختم على مربع وفتحه للمخروط الأنف.
5. نقل الحيوان إلى منطقة التحضير، مع مخروط الأنف وضعها بشكل صحيح ومتصل (للتخدير الصيانة).
6. إعداد 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر HCC لزرع في الماوس. BNL 1ME A.7R.1 يجب نموا في المتوسط ​​(10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين) تفرخ في طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و5٪ CO _2.
7. مع حقنة ذات إبرة 20 G، زرع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 خلايا فأر سرطان الكبد في الفص من كبد BALB / ج الفئران لإنتاج الأورام الأولية. بعد الزرع، منزل BALB / ج الفئران في قفص مع متطلبات المنزل بنفس ما قبل الزرع.
8. في نقطة النهاية التجريبية، الأدلة السريرية لسرطان الكبد يمكن ملاحظته كما خفض كبير في حالة الجسمتسجيل (الكشف عن عادة بعد 4 أسابيع). عند هذه النقطة، هناك احتمال أن الأورام الأولية قد وضعت في الكبد بينما شكلت ودائع المنتشر في الرئتين. بعد ذلك، تبدأ عملية عزل ونشر تعميم الخلايا السرطانية.

2. جمع الدم الكامل للاعارة ورم عزل الخلايا

ملاحظة: تطهير الوجه الصحيح في منطقة الجراحة والتأكد من أنها خالية من الفوضى. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية أو نقع في مطهر وفقا لتوصية الشركة الصانعة

1. التضحية الفئران عن طريق القتل الرحيم إنسانية في التجريبية نقطة النهاية (الأدلة السريرية التنمية ورم). Euthanization من الفئران ينبغي أن تشمل CO ₂ الاختناق. مراقبة الفئران بشكل صحيح لتأكيد التخدير يتم توزيعها بشكل صحيح. ينبغي الإفراج عن ثاني أكسيد الكربون ببطء في الغرفة على مدى فترة من 5-10 دقيقة، مما تسبب في توقف التنفس. متابعة من قبل استنزاف داخل القلب وcervicآل التفكك. ⁵
2. استخدام إبرة 25 G تعلق على حقنة 1 مل لجمع الدم الكامل. Heparanize الحقنة مع 0.01 مل الهيبارين. ثقب الجلد على الفور مع إبرة أقل شأنا من xyphisternum في حوالي 45 درجة زاوية. دفع الإبرة ببطء لثقب في القلب، ومن ثم خفض زاوية الإبرة. عقد على نحو مطرد الإبر والمحاقن في المكان، واستخلاص 500 ميكرولتر - 1000 ميكرولتر من الدم الكامل من القلب.
3. إزالة المحاقن والإبر ونقل الدم إلى 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب المسمى مسبقا. أجهزة الطرد المركزي الدم كله تم جمعها في 1.5 مل خالية من مولد الحمى الأنبوب في 1167 x ج لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: الطرد المركزي يفصل عينة دم كاملة إلى ثلاث طبقات: الطبقة السفلية أو الهيماتوكريت تتكون من خلايا الدم الحمراء، وهي طبقة رقيقة المتوسطة من معطف الشهباء، وطبقة البلازما أعلى.
4. إزالة البلازما بعناية من قبل pipetting وجمع مثل هذه المعلومات في أنبوب الحرة مولد الحمى 1.5 مل منفصل لفورثتجارب إيه مثل الكشف عن خالية من الخلايا الأحماض النووية ^7.
5. لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs)، وجمع معطف الشهباء إلى منفصل 1.5 مل خالية من مولد الحمى أنبوب استعدادا لخلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل. وهذا أمر ضروري لإزالة كرات الدم الحمراء المتبقية في طبقة معطف الشهباء.

3. وصفة لخلايا الدم الحمراء (RBC) الاحتياطي تحلل

1. جعل حل 1 L من RBC تحلل العازلة.
2. جعل 500 مل من كلوريد الأمونيوم و 500 مل من تريس. ثم تخلط لإيجاد حل 1 L من RBC تحلل العازلة مع تركيز النهائي من 155 ملم من كلوريد الأمونيوم و 10 ملي تريس.
3. العازلة الحل لدرجة الحموضة من 7.5. تخزين العازلة تحلل RBC في 2-8 درجة مئوية، وتقديمهم إلى RT مباشرة قبل الاستعمال.

4. RBC تحلل من معطف بافي

1. إضافة 1 مل من RBC تحلل العازلة للخالية من مولد الحمى العقيمة 1.5 مل أنبوب يحتوي على معطف الشهباء التي تم جمعها.
2. خلط محتويات الأنبوب بواسطةعكس عدة مرات. احتضان محتويات مختلطة من الأنبوب لمدة 5 دقائق على RT على مقاعد البدلاء. أجهزة الطرد المركزي محتويات المختلطة لمدة 5 دقائق في 1167 ز س.
3. بعد الطرد المركزي، وسيتم الحصول على بيليه بيضاء. تجاهل طاف المحمر ببطء وبعناية في المبيض بنسبة 10٪ دون أي تعطيل لبيليه. إذا كان بيليه ليست بيضاء، وإعادة افعل الخطوات 3،1-3،5. زيادة فترة حضانة في RBC العازلة تحلل إلى 10-15 دقيقة قد يكون من المفيد أيضا.
4. التخلص الآمن من النفايات البيولوجية مرة واحدة إزالة التلوث من النفايات البيولوجية في التبييض 10٪ كاملة بعد 24 ساعة.

5. نشر في خلية الثقافة

ملاحظة: الخلايا السرطانية يتم عادة بسرعة تنمو الخلايا خلايا الدم البيضاء التي تنتشر بكثرة في المزيج الأصلي الخلايا المزروعة في طبق. بعد التغيير المتكرر للمتوسطة، والممرات لاحقة من CTCs، تتم إزالة كافة خلايا الدم البيضاء ويبقى السكان نقية نسبيا من CTCs.

1. بعدالتخلص من طاف في التبييض 10٪، وغسل بيليه بيضاء في 1 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS) مرة واحدة على الأقل، وresuspend في كامل مستنبت للنشر في ثقافة الخلية.
2. بمجرد الانتهاء من غسل، إضافة 1 مل من BNL 1ME مستنبت A.7R.1 (10٪ الحرارة المعطل FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2mm و L-الجلوتامين) إلى بيليه و resuspend بيليه في مستنبت.
3. البذور مزيج معلق للخلايا في طبق ثقافة الخلية. احتضان طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع الهواء و 5٪ CO _2.
4. تغيير خلية ثقافة المتوسط ​​كل 2-3 أيام. بعد 5-7 أيام، وسوف CTCs انضمت إلى الطبق زراعة الخلايا والتي المتكاثرة. ستبقى هذه الخلايا قابلة للحياة إلى ما بعد 25 الممرات وبعد تكرار تجميد والذوبان دورات ^5.

6. التحقق من سرطان الكبد تداول ورم خط الخلية

1. أداء ا ف بolymerase سلسلة من ردود الفعل (PCR) طريقة المستندة إلى تضخيم جزء DNA معين واحد فقط من الجين الماوس β-غلوبين للتأكد من أن الرواية أنشأت خطوط الخلايا CTC هي خلايا فأر مثل الأصلي زرع خط BNL 1ME A.7R.1 HCC. وقد وصفت في الأصل طريقة والتصديق عليها من قبل Steube وآخرون ^5،8
2. أداء المناعية للعنصر استجابة الكبدية محددة علامة مخيم البروتين مثل 3 3 (CREB3L3) ملزمة باستخدام الأجسام المضادة المحددة. وهذا يؤكد أن الرواية CTCs المنشأة هي في الواقع خلايا الكبد مثل زرع خط الخلية BNL 1ME A.7R.1 الأصلي. ⁵

النتائج

وقد أظهرت المنهجية الموضحة هنا أن CTCs يمكن عزل. الموت الرحيم كانت الفئران معاملة إنسانية في التجريبية نقطة النهاية. الكربون الاختناق عملية المشاركة ثاني أكسيد، استنزاف داخل القلب، وخلع عنق الرحم. ويوضح التخطيطي من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل

Discussion

In this study, how to isolate and propagate CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse with HCC were described. The objective of this work is to enhance the ongoing studies of the mechanisms of cancer metastasis.

A factor that contributes to the poor prognosis of many cancers is the lack of timely detection and consequent widespread dissemination of the malignancy³. CTCs originate from primary cancers and spread via the blood stream to distant organs. As such, CTCs are importan...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1G	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5mL Clear NS	VWR	89511-254	1.5mL  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25GX1IN	VWR	BD305125	25G Needle
Slp Tip SRNG 1ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1mL syringe tip
Syringe 1ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 mL syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15X15X5MM PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25X75MM PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22X5oMM OZ	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500G	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2  5KG	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox® Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500mL)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1X
DMEM, 1X  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1X media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Seru8m	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13000rpm Centrifuge