El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Resumen

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Resumen

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Introducción

The cancer research community has known of the existence of circulating tumor cells (CTCs) since first being observed by Thomas Ashworth in 1869¹. Since then, CTCs have been shown to be important in tumor metastasis and disease progression^2-5. Today, solid tumors are a major cause of morbidity and mortality worldwide. CTCs are rare cells that originate from primary tumors and travel through the blood stream to different organs of which only a small fraction ultimately develop into metastasis^2-5. Notably, there is positive correlation between tumor size and CTC number^3,4.

An understanding of CTC biology can contribute to the search for targeted therapy. Furthermore, CTCs may have diagnostic applications. To achieve these potential clinical applications, one needs to overcome some current challenges to studying CTCs. One challenge is related to the fact that CTCs may be present as single cells or as clusters and they may even be able to change their phenotype in response to the blood microenvironment². Moreover, detection can be very challenging, in part, due to the low count of CTCs (a few to hundreds per milliliter) among one billionhematologic cells per milliliterin the blood⁶. Nevertheless, in recent years, research into the potential clinical applications of CTCs from solid organ cancers has intensified.

Despite these efforts, the challenges of studying and understanding the role of CTCs persist due to the rarity of CTCs and the inadequacy of the technological tools currently available. Despite these challenges, the tremendous potential for clinical applications continues to be an incentive to pursue research into the role of CTCs in cancer metastasis.

We were recently successful in isolating and propagating in cell culture CTCs from an orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis⁵. The purpose of the current paper is to describe in detail all aspects of the successful methodology. The significance of this methodology lies in the fact that this approach may be modified in order to successfully isolate and propagate in culture human CTCs, thus enhancing the possibility of in vitro studies of CTC biology.

There are multiple potential clinical applications for the use of CTCs. CTCs may be useful for prognosis, response monitoring, screening, dynamic monitoring of tumor molecular alterations, and personalized therapy⁴. Therefore, a better understanding of the biology of CTCs has high potential for clinical impact.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de Hunter College de la City University de Nueva York.

1. Procedimientos Pre-experimento

1. A su llegada a las instalaciones de animales, albergará inicialmente 3 ratones Balb / c con una jaula con una ropa de cama de arriba y astillas de madera filtrada. Asegúrese de que los ratones tienen libre acceso a la alimentación, purina comida para roedores y agua. Ropa de cama y comida deben cambiarse dos veces por semana, mientras que las jaulas deben limpiarse una vez a la semana.
2. Inducir la anestesia general en ratones usando un vaporizador de isoflurano junto con oxígeno a una velocidad de flujo constante de 1 L por minuto. El sistema es autosuficiente e incluye un vaporizador de precisión.
3. Posición animal en una caja de plástico que tiene el vaporizador precisión y gas / sistema de anestésico conectado a él. Inicialmente, ajuste el vaporizador para 2,5 hasta animal es inconsciente, en cuyo punto más bajo del vaporizador a 2.
4. En ese momento, cambie ellínea de válvulas, sellado a la caja y abrirla al cono de la nariz.
5. Mueva el animal a la zona de preparación, con el cono de la nariz colocado adecuadamente y conectado (para la anestesia de mantenimiento).
6. Preparar 5 × 10 ⁶ células HCC ratón BNL 1ME A.7R.1 para su implantación por ratón. BNL 1ME A.7R.1 debería estar creciendo en un medio (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) incubar en una placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% CO _2.
7. Con una jeringa que tiene una aguja G 20, el implante 100 l de PBS que contenía 5 x 10 ⁶ células de carcinoma hepatocelular ratón BNL 1ME A.7R.1 en un lóbulo de los hígados de los ratones BALB / c para producir los tumores primarios. Post-implantación, la casa de los ratones BALB / c en una jaula con los mismos requisitos de las casas como de pre-implantación.
8. En el punto final experimental, evidencia clínica de carcinoma hepatocelular es observable como la reducción significativa en la condición corporalanotar (usualmente detectada después de 4 semanas). En este punto, hay una probabilidad de que los tumores primarios han desarrollado en el hígado mientras que los depósitos metastásicos se han formado en los pulmones. A partir de entonces, comenzará el proceso de aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes.

2. Recolección de sangre entera para hacer circular Tumor Aislamiento celular

NOTA: correctamente desinfectado la zona de la cirugía y asegúrese de que está libre de desorden. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos o sumergirse en un desinfectante de acuerdo con las recomendaciones del fabricante

1. Sacrificar los ratones por eutanasia humanitaria al experimental de punto final (evidencia clínica de desarrollo de tumores). La eutanasia de los ratones debería involucrar _asfixia de CO 2. Observar los ratones adecuadamente para confirmar la anestesia se distribuye correctamente. El dióxido de carbono debe ser liberado lentamente en la cámara durante un período de 5 - 10 min, causando paro respiratorio. Siga por desangrado intracardiaca y CervicAl dislocación. ⁵
2. Use una aguja 25 G unida a una jeringa de 1 ml para la recogida de sangre completa. Heparanize la jeringa con 0,01 ml de heparina. Punción inmediatamente la piel con la aguja inferior al xyphisternum aproximadamente a 45 ° de ángulo. Avanzar la aguja lentamente para perforar el corazón, y luego bajar el ángulo de la aguja. Constantemente mantener la aguja y una jeringa en su lugar, y extraer 500 l - 1.000 l de sangre entera desde el corazón.
3. Retire la jeringa y la aguja y la transferencia de la sangre en un tubo libre de pirógenos pre-marcado con 1,5 ml. Centrifugar la sangre entera recogida en 1,5 ml tubo libre de pirógenos a 1.167 xg durante 5 min.
   NOTA: La centrifugación separa la muestra de sangre en tres capas: la capa inferior o el hematocrito que consiste en células rojas de la sangre, una capa delgada intermedia de la capa leucocitaria, y una capa de plasma superior.
4. Retire el plasma con cuidado con la pipeta y recoger en un tubo de 1,5 ml pirógenos separado para furthexperimentos er como la detección de ácidos nucleicos libres de células ^7.
5. Para el aislamiento de células tumorales circulantes (CTC), recoger la capa leucocitaria en un tubo libre de pirógenos 1,5 ml por separado en la preparación de glóbulos rojos (RBC) de lisis. Esto es necesario para eliminar los glóbulos rojos residuales en la capa de la capa leucocitaria.

3. Receta de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis

1. Hacer una solución 1 L de tampón de lisis RBC.
2. Hacer una 500 ml de cloruro de amonio y 500 ml de Tris. A continuación, mezclar para crear una solución de 1 l de tampón de lisis RBC con una concentración final de 155 mM de cloruro de amonio y 10 mM de Tris.
3. Amortiguar la solución a un pH de 7,5. Almacene el tampón de lisis RBC entre +2 y +8 ° C, y llevar a RT inmediatamente antes de su uso.

4. RBC lisis de Buffy Coat

1. Añadir 1 ml de tampón de lisis RBC al tubo de 1,5 ml estéril libre de pirógenos que contiene la capa leucocitaria recogida.
2. Mezclar el contenido del tubo porinvirtiendo varias veces. Incubar los contenidos mezclados del tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente en el banquillo. Centrifugar los contenidos mezclados durante 5 min a 1167 x g.
3. Después de la centrifugación, se obtendrá un pellet blanquecino. Descartar el sobrenadante rojizo lentamente y con cuidado en 10% de lejía sin ninguna interrupción al sedimento. Si la pastilla no es blanquecina, volver a hacer los pasos 3.1 a 3.5. El aumento del tiempo de incubación en tampón de lisis RBC a 10 - 15 min también puede ser útil.
4. Deseche los residuos biológicos vez descontaminación de desechos biológicos en el 10% de lejía se completa después de 24 horas.

5. propagación en cultivo celular

NOTA: Las células tumorales son típicamente crecen rápidamente las células de glóbulos blancos que son abundantes en la mezcla original de células sembradas en el plato. Tras el cambio repetido de medio, y los pasajes posteriores de CTC, todas las células blancas de la sangre se retiran y una población relativamente pura de CTC permanece.

1. Despuésdescartando el sobrenadante en 10% de lejía, lavar el sedimento blanquecino en 1 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) al menos una vez, y resuspender en medio de cultivo completo para la propagación en cultivo celular.
2. Una vez que se ha completado lavado, añadir 1 ml de medio de cultivo A.7R.1 completa BNL 1ME (10% FBS inactivado por calor, 1% de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-Glutamina) al sedimento y resuspender el precipitado en el medio de cultivo.
3. Sembrar la mezcla se volvieron a suspender las células en una placa de cultivo celular. Incubar la placa de cultivo celular a 37 ° C en un incubador humidificado con aire y 5% de CO _2.
4. Cambiar el medio de cultivo celular cada dos o tres días. Después de cinco a siete días, los CTC se han adherido a la placa de cultivo celular y comenzó a proliferar. Estas células se mantendrán viable más allá de 25 pasajes y después de congelación y descongelación ciclos repetidos ^5.

6. Verificación de carcinoma hepatocelular circulantes línea de células tumorales

1. Realizar apolymerase reacción en cadena (PCR) método basado, para amplificar solamente un segmento de ADN específica del gen β-globina de ratón para confirmar que la novela estableció líneas celulares de CTC son células de ratón como la línea de BNL 1ME A.7R.1 HCC original implantada. Método fue originalmente descrito y validado por Steube et al. ^5,8
2. Realizar la inmunotinción para el elemento de respuesta a cAMP marcador específico de hepatocitos proteína de unión 3-like 3 (CREB3L3) mediante el uso de un anticuerpo específico. Esto confirmará que la novela CTC establecidos son de hecho los hepatocitos como el implantado línea original de células BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Resultados

La metodología descrita aquí ha demostrado que las CTC se pueden aislar. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente al experimental de punto final. El proceso implicado carbono asfixia con dióxido, desangrado intra-cardiaca, y la dislocación cervical. Un diagrama esquemático de los pasos clave del procedimiento se ilustran en la Figura 2. Muestras de sangre total extraída por desangrado intra-cardiaca se procesaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de ...

Discusión

In this study, how to isolate and propagate CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse with HCC were described. The objective of this work is to enhance the ongoing studies of the mechanisms of cancer metastasis.

A factor that contributes to the poor prognosis of many cancers is the lack of timely detection and consequent widespread dissemination of the malignancy³. CTCs originate from primary cancers and spread via the blood stream to distant organs. As such, CTCs are importan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1G	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5mL Clear NS	VWR	89511-254	1.5mL  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25GX1IN	VWR	BD305125	25G Needle
Slp Tip SRNG 1ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1mL syringe tip
Syringe 1ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 mL syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15X15X5MM PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25X75MM PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22X5oMM OZ	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500G	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2  5KG	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox® Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500mL)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1X
DMEM, 1X  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1X media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Seru8m	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13000rpm Centrifuge