Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель

Резюме

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Аннотация

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Введение

The cancer research community has known of the existence of circulating tumor cells (CTCs) since first being observed by Thomas Ashworth in 1869¹. Since then, CTCs have been shown to be important in tumor metastasis and disease progression^2-5. Today, solid tumors are a major cause of morbidity and mortality worldwide. CTCs are rare cells that originate from primary tumors and travel through the blood stream to different organs of which only a small fraction ultimately develop into metastasis^2-5. Notably, there is positive correlation between tumor size and CTC number^3,4.

An understanding of CTC biology can contribute to the search for targeted therapy. Furthermore, CTCs may have diagnostic applications. To achieve these potential clinical applications, one needs to overcome some current challenges to studying CTCs. One challenge is related to the fact that CTCs may be present as single cells or as clusters and they may even be able to change their phenotype in response to the blood microenvironment². Moreover, detection can be very challenging, in part, due to the low count of CTCs (a few to hundreds per milliliter) among one billionhematologic cells per milliliterin the blood⁶. Nevertheless, in recent years, research into the potential clinical applications of CTCs from solid organ cancers has intensified.

Despite these efforts, the challenges of studying and understanding the role of CTCs persist due to the rarity of CTCs and the inadequacy of the technological tools currently available. Despite these challenges, the tremendous potential for clinical applications continues to be an incentive to pursue research into the role of CTCs in cancer metastasis.

We were recently successful in isolating and propagating in cell culture CTCs from an orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis⁵. The purpose of the current paper is to describe in detail all aspects of the successful methodology. The significance of this methodology lies in the fact that this approach may be modified in order to successfully isolate and propagate in culture human CTCs, thus enhancing the possibility of in vitro studies of CTC biology.

There are multiple potential clinical applications for the use of CTCs. CTCs may be useful for prognosis, response monitoring, screening, dynamic monitoring of tumor molecular alterations, and personalized therapy⁴. Therefore, a better understanding of the biology of CTCs has high potential for clinical impact.

протокол

О себе Этика: Все исследования на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Хантер-колледже из Городского университета Нью-Йорке.

1. Предварительно эксперимент процедуры

1. По прибытии на объект животного, первоначально дом 3 линии BALB / C мышей в клетке с фильтрованной верхней и щепы постельные принадлежности. Убедитесь, что мыши имеют свободный доступ к пище, Purina грызунов и воды. Постельное белье и еда должна быть изменена два раза в неделю, пока клетки должны быть очищены один раз в неделю.
2. Вызвать общую анестезию на мышах с использованием изофлуран испаритель вместе с кислородом при постоянной скорости потока 1 л в минуту. Система самостоятельной и включает в себя точность испаритель.
3. Позиция животных в пластиковой коробке, которая имеет точность испаритель и газа / обезболивающий систему, связанную с ним. Первоначально установлен испаритель до 2,5 до животное не находится в бессознательном состоянии, в котором точка снизить испарителя до 2.
4. В то время, переключитьклапан на линии, уплотнения его в коробку и открытии его в носовом конусе.
5. Перемещение животное в области подготовки, с носовой конус расположен правильно и подключен (для обслуживания анестезии).
6. Подготовьте 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клетки для имплантации в мышь. BNL 1ME A.7R.1 следует росли в среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) инкубирование клеток в культуральной чашке при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% _{СО 2.}
7. С шприц, имеющий 20 G иглу, имплантаты 100 мкл PBS, содержащие 5 ^х 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы клеток в доле печени BALB / с мышей, чтобы произвести первичные опухоли. После имплантации, дом BALB / с мышей в клетке с теми же требованиями, как дома предварительной имплантации.
8. В экспериментальной конечной точки, клинические признаки гепатоцеллюлярной карциномы наблюдается в значительному снижению состояния организмаоценка (обычно обнаруживается после 4 недель). В этот момент, существует вероятность того, что первичные опухоли были разработаны в печени, а метастатические отложениях в легких. После начала процесса выделения и распространения циркулирующих опухолевых клеток.

2. Сбор цельной крови для циркулирующих опухолевых клеток изоляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно продезинфицировать область хирургии и убедитесь, что это беспорядок бесплатно. Автоклав все хирургические инструменты или понежиться в качестве дезинфицирующего средства в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя

1. Жертвоприношение мышей гуманными эвтаназии при экспериментальном конечной точки (клинические признаки развития опухоли). Euthanization мышей следует привлекать СО ₂ удушья. Соблюдайте мышей правильно, чтобы подтвердить анестезии правильно распределены. Двуокись углерода должна быть выпущена медленно в камере в течение определенного периода 5 - 10 мин, в результате чего остановку дыхания. Следуйте внутрисердечной обескровливания и cervicаль дислокации. ⁵
2. Использование 25 г иглу, прикрепленную к 1 мл шприца для сбора цельной крови. Heparanize шприц с 0,01 мл гепарина. Прокол кожи сразу с иглой уступает xyphisternum примерно под углом 45 °. Авансовые иглу медленно, чтобы проколоть сердце, а затем опустите угол иглы. Неуклонно проводить иглу и шприц на месте, и вытянуть 500 мкл - 1000 мкл цельной крови из сердца.
3. Извлеките шприц и иглу и передачи кровь в предварительно меченных 1,5 мл апирогенной трубки. Центрифуга цельной крови в 1,5 мл апирогенной трубки при 1167 х г в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: центрифугирования отделяет всего образца крови в три слоя: нижний и гематокрита слой, состоящий из красных кровяных клеток, промежуточного тонкого слоя светлого сгустка крови, и верхний слой плазмы.
4. Удалить плазму тщательно с помощью пипетки и сбора его в отдельном 1,5 мл апирогенной трубки для FurthER эксперименты, такие как обнаружение бесклеточных нуклеиновых кислот. ⁷
5. Для выделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), собирают слой светлого сгустка крови в отдельную 1,5 мл апирогенной трубки при подготовке к эритроцитов (RBC) лизиса. Это необходимо для удаления остаточных эритроцитов в Баффи пальто слоя.

3. Рецепт для красных кровяных телец (эритроцитов) буфера для лизиса

1. Сделайте 1 л раствора РБК буфера для лизиса.
2. Сделать 500 мл раствора хлористого аммония и 500 мл Трис. Затем смешать, чтобы создать 1 л раствора буфера для лизиса эритроцитов с конечной концентрацией 155 мМ хлорида аммония и 10 мМ Трис.
3. Буфер раствора до рН 7,5. Храните буфера для лизиса эритроцитов при от +2 до +8 ° C, и довести до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

4. РБК Лизис Баффи пальто

1. Добавить 1 мл буфера для лизиса эритроцитов в стерильной апирогенной 1,5 мл пробирку, содержащую собранную поглощающее покрытие.
2. Смешайте содержимое пробирки с помощьюинвертирующий несколько раз. Выдержите смешанной содержимое пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре на скамейке. Центрифуга смешанные содержимое в течение 5 мин при 1167 х г.
3. После центрифугирования осадок беловато будут получены. Откажитесь от красновато супернатант медленно и осторожно в 10% отбеливателя без каких-либо сбоев в гранулы. Если осадок не беловатый, повторно выполните шаги 3.1 - 3.5. Увеличение времени инкубации в буфере для лизиса эритроцитов до 10 - 15 мин и может быть полезным.
4. Безопасное распоряжаться биологические отходы сразу обеззараживания биологических отходов в 10% отбеливателя полный после 24 часов.

5. Распространение в клеточной культуре

Примечание: Опухолевые клетки, как правило, быстро растущие клетки лейкоциты, которые в изобилии в исходной смеси клеток, посеянных на блюдо. После повторного изменения среды, и последующих проходов ЦОК, все белые клетки крови удаляются и относительно чистой население ЦОК остается.

1. Послеотбрасывая супернатант в 10% хлорной, мыть беловатый осадок в 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), по крайней мере один раз, и ресуспендируют в полной культуральной среде для распространения в клеточной культуре.
2. После промывки завершена, добавляют 1 мл полной BNL 1ME A.7R.1 культуральной среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) к осадку и ресуспендируют осадок в культуральной среде.
3. Семенной ресуспендированные смесь клеток в культуре клеток блюдо. Инкубируйте клеточной культуры блюдо при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и _5% CO 2.
4. Изменить среду для культивирования клеток каждые два-три дня. После пяти до семи дней, ЦОК будет присоединились к клеточной культуры блюдо и начал пролиферирующих. Эти клетки остаются жизнеспособными за 25 проходов и после повторных циклов замораживания и оттаивания ^5.

6. Проверка гепатоцеллюлярной карциномы циркулирующих опухолевых клеток линии

1. Выполните APolymerase цепной реакции (ПЦР) основе метода, чтобы усилить только один конкретный сегмент ДНК мыши β-глобина гена, чтобы подтвердить, что роман создан клеточные линии СТС являются клетки мыши, как в оригинальной имплантированного BNL 1ME A.7R.1 HCC линии. Метод был впервые описан и подтверждено Steube др. ^5,8
2. Выполнение иммунного окрашивания для гепатоцитов-специфическим маркером цАМФ реагировать элемент связывающего белка 3-3 (как CREB3L3) с помощью специфического антитела. Это подтвердит, что роман, установленные ЦОК действительно гепатоцитов, как в оригинальной имплантированного клеточной линии BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Результаты

Методика описана здесь показал, что ЦОК может быть выделен. Мышей умерщвляли гуманным в экспериментальной конечной точки. Этот процесс предполагает углерода диоксида удушье, внутри сердца обескровливание и шейки дислокации. Схема основных этапов процедуры, показаны на рисунке 2.

Обсуждение

In this study, how to isolate and propagate CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse with HCC were described. The objective of this work is to enhance the ongoing studies of the mechanisms of cancer metastasis.

A factor that contributes to the poor prognosis of many cancers is the lack of timely detection and consequent widespread dissemination of the malignancy³. CTCs originate from primary cancers and spread via the blood stream to distant organs. As such, CTCs are importan...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1G	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5mL Clear NS	VWR	89511-254	1.5mL  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25GX1IN	VWR	BD305125	25G Needle
Slp Tip SRNG 1ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1mL syringe tip
Syringe 1ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 mL syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15X15X5MM PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25X75MM PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22X5oMM OZ	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500G	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2  5KG	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox® Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500mL)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1X
DMEM, 1X  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1X media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Seru8m	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13000rpm Centrifuge