L'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d'un cancer Modèle Souris

Résumé

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Résumé

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Introduction

The cancer research community has known of the existence of circulating tumor cells (CTCs) since first being observed by Thomas Ashworth in 1869¹. Since then, CTCs have been shown to be important in tumor metastasis and disease progression^2-5. Today, solid tumors are a major cause of morbidity and mortality worldwide. CTCs are rare cells that originate from primary tumors and travel through the blood stream to different organs of which only a small fraction ultimately develop into metastasis^2-5. Notably, there is positive correlation between tumor size and CTC number^3,4.

An understanding of CTC biology can contribute to the search for targeted therapy. Furthermore, CTCs may have diagnostic applications. To achieve these potential clinical applications, one needs to overcome some current challenges to studying CTCs. One challenge is related to the fact that CTCs may be present as single cells or as clusters and they may even be able to change their phenotype in response to the blood microenvironment². Moreover, detection can be very challenging, in part, due to the low count of CTCs (a few to hundreds per milliliter) among one billionhematologic cells per milliliterin the blood⁶. Nevertheless, in recent years, research into the potential clinical applications of CTCs from solid organ cancers has intensified.

Despite these efforts, the challenges of studying and understanding the role of CTCs persist due to the rarity of CTCs and the inadequacy of the technological tools currently available. Despite these challenges, the tremendous potential for clinical applications continues to be an incentive to pursue research into the role of CTCs in cancer metastasis.

We were recently successful in isolating and propagating in cell culture CTCs from an orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis⁵. The purpose of the current paper is to describe in detail all aspects of the successful methodology. The significance of this methodology lies in the fact that this approach may be modified in order to successfully isolate and propagate in culture human CTCs, thus enhancing the possibility of in vitro studies of CTC biology.

There are multiple potential clinical applications for the use of CTCs. CTCs may be useful for prognosis, response monitoring, screening, dynamic monitoring of tumor molecular alterations, and personalized therapy⁴. Therefore, a better understanding of the biology of CTCs has high potential for clinical impact.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York.

1. Procédures pré-expérimentation

1. À l'arrivée à l'animalerie, Maison initialement 3 souris BALB / c à une cage avec une literie de haut et de copeaux de bois filtré. Veiller à ce que les souris ont un accès libre à la nourriture, nourriture pour rongeurs Purina, et de l'eau. Literie et la nourriture doivent être changés deux fois par semaine, alors que les cages doivent être nettoyés une fois par semaine.
2. Induire une anesthésie générale chez la souris en utilisant un vaporisateur isoflurane avec de l'oxygène à un débit constant de 1 litre par minute. Le système est autonome et comprend un vaporisateur de précision.
3. Position animal dans une boîte en plastique sur lequel le vaporisateur de précision et / système de gaz anesthésique est connecté. Initialement fixé le vaporisateur à 2,5 jusqu'à ce que l'animal est inconscient, à quel point réduire le vaporisateur à 2.
4. À ce moment, mettez leLigne de soupape, en le scellant à la surface, et l'ouvrir pour le cône de nez.
5. Déplacez l'animal à la zone de préparation, avec le cône de nez placé et raccordé correctement (pour entretien de l'anesthésie).
6. Préparer 5 × 10 ⁶ cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1 pour l'implantation par souris. BNL 1ME A.7R.1 devrait être de plus en plus dans le milieu (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) l'incubation dans une boîte de culture de cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% CO _2.
7. Avec une seringue ayant une aiguille G 20, l'implant 100 pi de PBS contenant 5 x 10 ⁶ cellules de carcinome hépatocellulaire de souris BNL 1ME A.7R.1 dans un lobe de le foie des souris BALB / c pour produire les tumeurs primaires. Post-implantation, maison, les souris BALB / c dans une cage avec les mêmes exigences de maison comme pré-implantatoire.
8. Au point de fin d'expérimentation, des signes cliniques de carcinome hépatocellulaire est observable comme réduction significative de la condition corporellemarquer (généralement détectée après 4 semaines). À ce stade, il est probable que les tumeurs primaires ont développé dans le foie tandis que les dépôts métastatiques ont formé dans les poumons. Par la suite, commence le procédé de l'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes.

2. Collecte de sang total pour la circulation des cellules tumorales Isolement

REMARQUE: correctement filtrées la zone de la chirurgie et assurez-vous qu'il est sans encombrement. Autoclave tous les instruments chirurgicaux ou faire tremper dans un désinfectant selon les recommandations du fabricant

1. Sacrifiez souris par euthanasie au expérimentale point final (signes cliniques de développement de la tumeur). Euthanasie des souris devrait impliquer CO ₂ asphyxie. Observez la souris correctement pour confirmer l'anesthésie est correctement distribué. Le dioxyde de carbone doit être libéré lentement dans la chambre sur une période de 5 à 10 min, ce qui provoque un arrêt respiratoire. Suivez par exsanguination intracardiaque et cervical dislocation. ⁵
2. Utiliser une aiguille 25 G fixée à une seringue de 1 ml pour la collecte de sang total. Heparanize la seringue avec 0,01 ml d'héparine. Ponction immédiatement la peau avec l'aiguille inférieur au xyphisternum à environ 45 ° d'angle. Avancez lentement aiguille pour percer le cœur, puis abaissez l'angle de l'aiguille. Maintenir fermement l'aiguille et la seringue en place, et d'en tirer 500 pi - 1000 ul de sang entier du cœur.
3. Retirez la seringue et l'aiguille et transférer le sang dans un tube apyrogène 1,5 ml pré-étiquetés. Centrifuger le sang total recueilli dans tube de 1,5 ml apyrogène à 1167 g pendant 5 min.
   REMARQUE: La centrifugation sépare l'échantillon de sang en trois couches: la couche inférieure ou de l'hématocrite constitué de globules rouges, une couche mince intermédiaire de couche leuco-plaquettaire, et une couche supérieure de plasma.
4. Retirer soigneusement le plasma par pipetage et la collecte dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparé pour Furthexpériences telles que la détection des acides nucléiques sans cellules ⁷ RE.
5. Pour l'isolement de cellules tumorales circulantes (CTC), de recueillir la couche leucocytaire dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparée en préparation de globules rouges (RBC) lyse. Cela est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels dans la couche leuco-plaquettaire.

3. Recette pour Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse

1. Ajouter une solution à 1 L de tampon de lyse RBC.
2. Faire un 500 ml de chlorure d'ammonium et 500 ml de Tris. Puis mélanger pour créer une solution à 1 L de tampon de lyse RBC avec une concentration finale de 155 mM de chlorure d'ammonium et 10 mM de Tris.
3. Tamponner la solution à un pH de 7,5. Conservez le tampon de lyse RBC à +2 et +8 ° C, et porter à RT immédiatement avant l'utilisation.

4. RBC Lysis de Buffy Coat

1. Ajouter 1 ml de tampon de lyse RBC au tube de 1,5 ml apyrogène stérile contenant la couche leucocyto-plaquettaire collectée.
2. Mélanger le contenu du tube parinverser plusieurs fois. Incuber le contenu mélangé du tube pendant 5 min à température ambiante sur le banc. Centrifuger les contenus mixtes pendant 5 min à 1167 x g.
3. Après centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Jeter le surnageant rougeâtre lentement et avec précaution dans l'eau de Javel à 10% sans aucune interruption au culot. Si la pastille est pas blanchâtre, refaire les étapes 03.01 à 03.05. L'augmentation de la durée d'incubation dans un tampon de lyse RBC à 10 - 15 min peut également être utile.
4. Éliminer en toute sécurité les déchets biologiques, une fois la décontamination des déchets biologiques dans 10% de javel est complète après 24 h.

5. Propagation dans la culture cellulaire

REMARQUE: Les cellules tumorales sont généralement des cellules en croissance rapide des globules blancs qui sont abondants dans le mélange initial de cellules ensemencées dans le plat. Suite à changement répété de support, et les passages subséquents de CTC, les globules blancs sont éliminés et une population relativement pur de CTC reste.

1. Aprèsélimination du surnageant dans 10% d'agents blanchissants, laver le culot dans une solution saline blanchâtre ml tamponnée au phosphate (PBS) au moins une fois, et remettre en suspension dans un milieu de culture complet pour une propagation dans la culture cellulaire.
2. Une fois lavage est terminée, ajouter 1 ml de milieu de culture complet A.7R.1 BNL 1ME (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) à la pastille et remise en suspension du culot dans du milieu de culture.
3. Ensemencer le mélange remis en suspension de cellules dans une boîte de culture cellulaire. Incuber la boîte de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l'air et 5% de CO _2.
4. Changer le milieu de culture cellulaire toutes les deux à trois jours. Après cinq à sept jours, CTC aura adhéré à la boîte de culture cellulaire et a commencé à proliférer. Ces cellules vont rester viable au-delà de 25 passages et après plusieurs cycles gel et de dégel ^5.

6. La vérification du carcinome hépatocellulaire circulation Tumor Cell Line

1. Effectuer APolymerase réaction en chaîne (PCR) à base, pour amplifier un seul segment d'ADN spécifique du gène β-globine souris pour confirmer que le roman a créé des lignées de cellules de la CCT sont des cellules de souris, comme la ligne BNL 1ME A.7R.1 HCC implanté originale. Méthode a été décrite et validée par Steube et al. ^5,8
2. Effectuer immunocoloration pour le spécifique hépatocytes marqueur AMPc protéine de liaison 3-like 3 (CREB3L3) en utilisant un anticorps spécifique élément sensible. Cela confirmera ce roman CTC sont en effet établies hépatocytes comme la ligne originale implanté des cellules BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Résultats

La méthodologie décrite ici a montré que les CTC peuvent être isolés. Les souris ont été euthanasiés au expérimentale point final. Le processus impliqué asphyxie du dioxyde de carbone, l'exsanguination intra-cardiaque et dislocation cervicale. Un schéma d'étapes de cette intervention sont illustrées sur la figure 2. Des échantillons de sang total prélevé par exsanguination intracardiaque ont été traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Après quoi, la ce...

Discussion

In this study, how to isolate and propagate CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse with HCC were described. The objective of this work is to enhance the ongoing studies of the mechanisms of cancer metastasis.

A factor that contributes to the poor prognosis of many cancers is the lack of timely detection and consequent widespread dissemination of the malignancy³. CTCs originate from primary cancers and spread via the blood stream to distant organs. As such, CTCs are importan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1G	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5mL Clear NS	VWR	89511-254	1.5mL  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25GX1IN	VWR	BD305125	25G Needle
Slp Tip SRNG 1ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1mL syringe tip
Syringe 1ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 mL syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15X15X5MM PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25X75MM PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22X5oMM OZ	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500G	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2  5KG	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox® Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500mL)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1X
DMEM, 1X  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1X media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Seru8m	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13000rpm Centrifuge