شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Summary

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Abstract

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

Introduction

مقاومة فيروس مخاطي (MX) البروتينات تعد جزءا هاما من الدفاع المناعي الفطري ضد مسببات الأمراض الفيروسية. هذه البروتينات هي GTPases مثل dynamin الكبيرة التي يتم الناجمة عن النوع الأول والنوع الثالث إنترفيرون. المقابلة الجينات الإرسال المتعدد موجودة في جميع الفقاريات تقريبا في واحدة أو عدة نسخ والمنتجات الجينات، تمنع مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروسات مخاطية قويمة (على سبيل المثال، فيروس الأنفلونزا)، فيروسات ربدية (على سبيل المثال، فيروس التهاب الفم الحويصلي)، الفيروسات البنياوية (على سبيل المثال. ، LA فيروس اكروس) وRetroviridae (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1) ^1-4. ومن غير الواضح كيف تعترف هذه البروتينات مثل مجموعة واسعة من الفيروسات، من دون أي تسلسل الأساسي المشترك واضح الزخارف في هذه الفيروسات. تحليل تفاعل البروتينات الإرسال المتعدد مع أهدافها الفيروسية، ويحتمل أن تنطوي على المجمعات أجل أعلى مع العوامل الخلية المضيفة الأخرى، سوف تساعد على فهم الآليات الجزيئية روقد تطورت قبعة في سباق التسلح بين الفيروسات ومضيفيهم.

وقد تمت دراسة التفاعل بين البروتينات الإرسال المتعدد في الثدييات والأهداف الفيروسية الأكثر نطاق واسع لMXA البشري. MXA الإنسان يمكن أن تحول دون تكرار العديد من الفيروسات، بما في ذلك orthomyxoviruses الأنفلونزا وفيروس Thogoto. MXA يربط Thogoto المجمعات بروتين نووي ريبوزي فيروس (vRNPs)، وبالتالي منع دخولهم النووي، مما يؤدي إلى كتلة من العدوى ^5. وقد تجلى هذا التفاعل بين MXA وThogoto vRNPs فيروس مع زملاء الترسيب وشارك في مناعي التجارب ^6-9. كيف تعيق البروتينات الإرسال المتعدد فيروسات الأنفلونزا A غير أقل وضوحا. واحد المشكلة الرئيسية هي أنه ليس واضحة لإثبات وجود التفاعل بين البروتين الإرسال المتعدد ومنتج الجين الأنفلونزا. أظهر تقرير واحد تفاعل بين MXA البشري والبروتين NP في الأنفلونزا A خلايا الفيروس ^10. يمكن أن يظهر هذا التفاعل إلا من خلال التعاون immunoprecipitation إذا كان قد تعامل الخلايا مع ربط عبر dithiobis كاشف (succinimidyl بروبيونات) قبل تحلل، مما يدل على أن التفاعل هو عابر و / أو ضعيف. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الفرق الإرسال المتعدد حساسية مختلفة سلالات الأنفلونزا A يتم تحديد من أصل البروتين NP ^11،12. وتماشيا مع هذا، يمكن أن فيروسات الأنفلونزا A الهروب جزئيا من سيطرة الإرسال المتعدد التي تحور بقايا محددة في البروتين NP ^13. وهذا يشير إلى أن الهدف الرئيسي من فيروسات الإنفلونزا A للمضيف MX هو البروتين NP، على الأرجح NP تجميعها في مجمعات vRNP. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الدراسات الأخيرة أظهرت وجود أكثر التفاعل بين NP الإنفلونزا أو vRNPs وإما MXA البشري أو الماوس MX1.

أظهرنا مؤخرا، لأول مرة، وهو التفاعل بين أنفلونزا NP والبروتين MX1 الماوس مع الأمثل بروتوكول التعاون مناعي ^14، الذي يوصف هنا بالتفصيل. في العام، وشارك في طmmunoprecipitation هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية الأكثر استخداما للتحقيق تفاعلات البروتين البروتين. وغالبا ما يفضل هذه التقنية على تقنيات بديلة، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين، لأنه يسمح للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتين في بيئتها الطبيعية. يمكن أن يتم التعاون مناعي خارجا على البروتينات وأعرب التطور الطبيعي إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات ذات الاهتمام المتاحة. بدلا من ذلك، البروتينات من الفائدة يمكن التعبير في الخلية من خلال ترنسفكأيشن أو العدوى، ويمكن استخدامه علامة التقارب. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه، وبروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح للكشف عن ضعف و / أو عابرة تفاعلات البروتين. المكون الرئيسي في هذا البروتوكول الأمثل هو إضافة N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت تحلل الخلية. NEM هو كاشف مؤلكل أن يتفاعل مع مجموعات ثيول المجانية مثل موجودة في cysteines، في الرقم الهيدروجيني من 6،5-7،5، لتشكيل مستقر ثيو استر(الشكل 1). في ارتفاع درجة الحموضة، ويمكن NEM أيضا تتفاعل مع مجموعات الأمينية أو الخضوع التحلل ^15. وعادة ما تستخدم NEM لمنع الجماعات ثيول الحرة، وذلك لمنع تشكيل ثاني كبريتيد السندات أو تمنع النشاط الأنزيمي. على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم NEM لمنع desumoylating الإنزيمات، والتي هي البروتياز السيستين. في بروتوكول التعاون مناعي وصفها، أدرج NEM في البداية في المخزن المؤقت تحلل لقد ذكر أن sumoylation من البروتينات الإنفلونزا يمكن أن تؤثر في التفاعل بين البروتينات الفيروسية ^16. بشكل غير متوقع، أثبتت إضافة NEM أن يكون المفتاح لتوثيق التفاعل بين NP الإنفلونزا، والماوس MX1 التي شارك في مناعي. ومن غير الواضح لماذا إضافة NEM أمر حاسم للكشف عن التفاعل NP-MX1. ربما التفاعل هو عابر جدا و / أو ضعيف. NEM يمكن تحقيق الاستقرار في التفاعل، على سبيل المثال، من خلال الحفاظ على التشكل محدد من MX1، وهو بروتين فيروسي أو حتى كومبو الثالث غير معروفnent. وقد لوحظ مثل هذا أثر في تحقيق الاستقرار من NEM من قبل، على سبيل المثال، للتفاعل بين اختزال الريبونوكليوتيد M1 وجيمسيتابين المانع لها (F2dC) ^17. MX1 وNP كلا تحتوي على بقايا السيستين متعددة والتي يمكن تعديلها من قبل NEM. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أجرتها ريني آخرون أن stalkless MXA-البديل يحتوي على ثلاثة المذيبات بقايا السيستين يتعرض التي يمكن تعديلها من قبل iodoacetamide. تحور هذه المخلفات إلى serines لم يؤثر على النشاط الأنزيمي من MXA، ولكن منعت بوساطة ثاني كبريتيد التجميع ^18. كما يتم حفظها هذه cysteines في MX1، وهذا يشير إلى أن cysteines مماثل في MX1 يمكن تعديلها من قبل NEM وعلى هذا النحو تأثير التشكل، أو الذوبان. وبالإضافة إلى ذلك، NEM قد تؤثر أيضا على النشاط GTPase من MX1، وهو أمر ضروري للنشاط مضاد للأنفلونزا من MX1، وبالتالي تحقيق الاستقرار في التفاعل بين MX1 وNP. ومع ذلك، فإن التأثير المباشر للNEM على تشغيل إشارات GTPasevity من MX1 غير المحتمل، كما هو مطلوب NEM أيضا للكشف عن التفاعل بين NP الإنفلونزا، وGTPase المسوخ غير نشطة من البروتين MX1 ^14. ومن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف تأثير NEM على التفاعل NP-MX1.

وباختصار، فإن بروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين MX1 المضادة للفيروسات وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة أخرى التفاعلات الضعيفة أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة. وقد وصفت البروتين البروتين التفاعل التي تعتمد على التشكل محددة من قبل، على سبيل المثال، على البروتينات ملزم الكالسيوم مثل كالمودولين ^19. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا دور الفعال لNEM في الطرق الأخرى التي تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين، مثل فحوصات المشارك الترسيب.

Protocol

ملاحظة: تم تأسيس بروتوكول ترنسفكأيشن وشارك في مناعي التالية لشكل طبق بتري 9 سم. صيغ أخرى ممكنة أيضا بعد توسيع نطاق البروتوكول.

1. البذر الكلى الجنينية البشرية (HEK) خلايا 293T

1. البذور قبل ترنسفكأيشن عند 1.2 × 10 ⁶ خلايا في 9 سم طبق بتري في 12 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم L-الجلوتامين، 0.4 ملي نا-البيروفات الخلايا HEK293T يوم واحد، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 100 U / البنسلين مل و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين.
2. تنمو الخلايا 16 ساعة على 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪.
3. بصريا تفتيش على التشكل وقابلية الخلايا مع مجهر الضوء المعكوس قبل ترنسفكأيشن. الخلايا تحتاج إلى أن تكون متكدسة الفرعية لأفضل كفاءة ترنسفكأيشن.

2. الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من خلايا HEK293T

ملاحظة: استخدام 0.5-1 ميكروغرام من pCAXL-NP أو فارغة بلازميد pCAXL في تركيبة مع 1-3 ميكروغرام من pCAXL-MX1 في 9 سم الطبق. استخدام مبلغ مساو من إجمالي DNA البلازميد في جميع العينات. ضبط مع البلازميد فارغة إذا لزم الأمر.

1. إعداد مخازن ترنسفكأيشن التالية:
   1. إعداد تريس، EDTA (TE) مع تركيزات 1.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 0.1 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0.
   2. إعداد BS / HEPES مع تركيزات 25 ملي HEPES (5.96 غرام / L، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 274 مم كلوريد الصوديوم (16 ز / L)، 10 ملي بوكل (0.74 جم / L)، 1.5 ملي NaHPO ₄ · 12H ₂ O (0.5 غرام / L) و 11.1 مم سكر العنب (2 ز / L). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05.
   3. إعداد CaCl ₂ / HEPES مع تركيزات 1.25 M CaCl ₂ · 2H ₂ O (183.8 جم / L) و 125 ملي HEPES (29.79 جم / لتر). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05 مع هيدروكسيد الصوديوم.
2. تدفئة مخازن ترنسفكأيشن في 37 ° C قبل الاستخدام.
3. إعداد العينات البلازميد التي كتبها تمييع DNA البلازميد في 600 ميكرولتر من TE.إعداد هذه الخلائط في الآبار من لوحة 6 جيدا.
4. إضافة 150 ميكرولتر من CaCl ₂ / HEPES بطريقة حكيمة قطرة للعينات البلازميد ومزيج من قبل pipetting 3 مرات صعودا وهبوطا.
5. إعداد الحل ترنسفكأيشن قطرة مضيفا الحكمة الحل البلازميد (TE + DNA + CaCl ₂ / HEPES، 750 ميكرولتر) إلى 750 ميكرولتر من العازلة BS / HEPES المنصوص عليها في لوحة 6 جيدا جديدة. توزيع الحل البلازميد بالتساوي على كامل تحتوي كذلك BS / HEPES العازلة.
6. يهز الحل ترنسفكأيشن على لوحة شاكر لمدة 90 ثانية في 1،000 دورة في الدقيقة.
7. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. إضافة محلول ترنسفكأيشن (1.5 مل) قطرة من الحكمة أن الخلايا. استخدام ممص مكروي P1000 بالتنقيط الحل ترنسفكأيشن على الخلايا. تفريق الخليط على كامل 9 سم طبق بتري ويهز لوحة بلطف شديد.
9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 6 ساعة. ثم إزالة المتوسطة التي كتبها طموح واستبدال واي فوراعشر 12 مل الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت. بلطف إضافة متوسطة جديدة للخلايا لمنع انفصال الخلية. لهذا، وعقد غيض من الماصة ضد الجانب من البئر وبلطف طرد المتوسط.
10. احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪.

3. المشارك مناعي

ملاحظة: إجراء شارك في مناعي 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

1. إعداد منخفض العازلة تحلل الملح والملح العالية غسل العازلة.
   1. إعداد محلول المخزون من 2 M N-ethylmaleimide (NEM) عن طريق وزن كمية NEM وحلها في الايثانول المطلق. إعداد الأسهم حل NEM الطازجة قبل استخدامها.
      تنبيه: NEM سامة جدا، وإعداد واستخدام هذا الحل الأسهم في غطاء الدخان.
   2. إعداد منخفض الملح العازلة تحلل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 1٪ NP40 وكوكتيل مثبط البروتياز (حل الجدول 1ر في 50 مل العازلة تحلل). إضافة NEM إلى تركيز النهائي من 25 ملم (أي تمييع 1:80). الحفاظ على الجليد بعد إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM.
      ملاحظة: دائما إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM الطازجة قبل استخدامها.
   3. إعداد الملح العالية العازلة يغسل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 500 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ NP40. لاحظ أن غسل العازلة الملح العالية لا يحتوي NEM.
2. إعداد لست] الخلية.
   1. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS). إضافة بلطف جدا غسل العازلة، وخلايا HEK293T تنفصل بسهولة.
   2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميكرولتر من الجليد الباردة منخفض العازلة تحلل الملح في 9 سم طبق بتري.
   3. احتضان لوحات لمدة 20 دقيقة على الجليد. تأكد من أن لوحات يتم الاحتفاظ الأفقي، لضمان تغطية كاملة لسطح اللوحة مع تحلل العازلة. يهز بلطف لوحات كل 5 دقائق.
   4. جمع المحللة خلية في microcentrifuge 1.5 ملأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج لتكوير جزء غير قابلة للذوبان.
   5. نقل جزء القابلة للذوبان، أي المحللة خلية إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع بروتوكول التعاون مناعي، لمنع تفكك البروتينات التفاعل. تنفيذ كافة الخطوات التالية قدر الإمكان على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من نشاط بروتين في لست].
3. جيل من المركبات المناعية.
   ملاحظة: في هذه الخطوة، البروتين من الفائدة لا بد من الأجسام المضادة المناسبة. لدراسة التفاعل NP-MX1، واستخدام الماوس لمكافحة NP وحيدة النسيلة الأجسام المضادة.
   1. لكل عينة، مزيج 135 ميكرولتر من المحللة مع 2 ميكرولتر من مكافحة NP الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و 113 ميكرولتر من تحلل العازلة منخفضة الملح (إجمالي حجم 250 ميكرولتر). تخزين المحللة المتبقية في -20 ° C لمزيد من التحليل مثل النشاف الغربي، لتوثيق مستويات التعبير من INTERA مظنونشركاء ction في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وقياس تركيز البروتين من المحللة (على سبيل المثال مع برادفورد كاشف) واستخدام كمية ثابتة من البروتين الكلي، على سبيل المثال، 400 ميكروغرام لكل المحللة.
   2. احتضان مزيج الأجسام المضادة المحللة لمدة 3 ساعة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. ويمكن تمديد هذه الخطوة إلى الحضانة بين عشية وضحاها.
4. إعداد البروتين الخرز G.
   ملاحظة: يتم شحنها والخرز البروتين G وتخزينها في 20٪ من الإيثانول لحفظ. للالطين حبة يتكون عادة من 50٪ الخرز وتحتاج إلى أن تغسل هذه الخرز قبل أن يتم استخدامها لimmunoprecipitate المركبات المناعية.
   1. استخدام 50 ميكرولتر من الخرز، أي 100 ميكرولتر من حبة الطين، لكل عينة. تغسل كمية من الخرز اللازمة لجميع العينات في مقايسة شارك في مناعي في أنبوب واحد. قطع غيض من طرف ماصة 1 مل لتخفيف pipetting لمن حبة الطين.
   2. أجهزة الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 Xز و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة حل الإيثانول وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح. الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة طاف بلطف. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات.
      ملاحظة: منخفض العازلة تحلل الملح تستخدم لغسل حبات ليست في حاجة لاحتواء مثبطات الأنزيم البروتيني أو NEM.
   3. تقدير حجم البروتين الخرز G وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح لجعل الجديد 50٪ حبة الطين في انخفاض العازلة تحلل الملح.
   4. لكل عينة، ونقل 100 ميكرولتر من حبة الطين في الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. كن حذرا لresuspend وحبة الطين قبل تقسيم، وهذه الخرز الرواسب بسرعة إلى أسفل الأنبوب.
5. مناعي من المركبات المناعية عن طريق بروتين G الخرز وشطف بهم.
   1. قبل استخدام بروتين G الخرز لمناعي، الطرد المركزي كل 30 ثانية في أنابيب 8،000 x ج و 4 ° C وتحقق عن طريق التفتيش البصري أن هناك مبلغ مساو من الخرز موجودة في جميع العينات. إذا لزم الأمر ضبط كمية من الخرز في بعض من العينات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات.
   2. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على المركبات المناعية (أي.، لست] مع الأجسام المضادة، 250 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C لجمع العينة كاملة في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل المركبات المناعية للبروتين G الخرز (50 ميكرولتر).
   3. احتضان 60 دقيقة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. لا احتضان هذه المركبات المناعية أطول من 75 دقيقة مع حبات للحد ملزمة انوعي من البروتينات للبروتين G الخرز.
   4. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G (مع المربوطة المركبات المناعية) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وإزالة supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات. اختياري: تخزين هذه supernatants في 4 درجات مئوية أو -20 ° C لتحليلها لاحقا،على سبيل المثال، لتقدير كمية البروتين غير منضم.
   5. غسل بروتين G الخرز لحوالي 5 دقائق مع 900 ميكرولتر من الملح العالية العازلة تحلل. تأكد من أن الخرز ومعلق تماما في غسل العازلة لغسل الأمثل. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وتجاهل supernatants. كرر هذه الخطوة غسل 4 مرات. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز بروتين G مكعبات لتجنب فقدان المواد immunoprecipitated.
   6. بعد الخطوة غسل الماضي، إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة إلى الخرز وتسخين تعليق لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى أزل (المشترك) البروتينات immunoprecipitated.
      1. إعداد 10 مل من العازلة 6X Laemmli مع 1 غرام من دوديسيل كبريتات الصوديوم، 3.5 مل من الجلسرين، و 3.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 420 ميكرولتر من β المركابتويثانول. التكيف مع إجمالي حجم 10 مل بإضافة الماء المقطر. تمييع 3 مرات في الماء المقطر للحصول عازلة 2X Laemmli.
         تنبيه: &# 946؛ -mercaptoethanol غير سامة، وإعداد واستخدام عازلة Laemmli في غطاء الدخان.
   7. وبعد التسخين، أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج وتخزين العينات في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو -20 ° C (على المدى الطويل).

4. تحليل (المشارك) Immunoprecipitated البروتينات

1. تصور البروتينات الموجودة في الخلايا المحللة وشطافة من شارك في مناعي من قبل SDS-PAGE ²⁰ و غرب النشاف ^21،22. تحميل عادة نصف شطافة Laemmli على هلام. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز مكعبات G البروتين عند أخذ عينات للهلام التحميل. تم الكشف عن MX1 وNP التعبير مع مضاد للMX1 ومكافحة NP الأجسام المضادة، على التوالي ^14. تم الكشف عن العصابات مع لمعان كيميائي على أساس HRP ومطور فيلم الأشعة السينية.

النتائج

N-ethylmaleimide هو مركب عضوي التي يمكن استخدامها لتعديل بشكل لا رجعة فيه جماعات ثيول الحرة، على سبيل المثال لمنع البروتياز السيستين (الشكل 1).

بروتين مضاد للفيروسات الأنفلونزا A MX1 يمنع تكاثر الفيروس من خلال التفاعل مع البر...

Discussion

دراسة التفاعل بين البروتينات المضادة للفيروسات وأهدافها الفيروسية مهم جدا لفهم تفاصيل آلية المضادة للفيروسات من هذه البروتينات. هذا يمكن أن تعطي رؤى جديدة في كيفية الفيروسات ومضيفيهم شارك تطورت وتكون أساسا لوضع استراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. والأمثل بروتوك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Gibco	52100-047
N-Ethylmaleimide	Sigma	E-3876	Toxic
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	also known as NP40
Protease inhibitor cocktail	Roche	11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-4282	ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-3133	directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL western blotting substrate	Pierce	32106