Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Resumen

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Resumen

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

Introducción

Resistencia Myxovirus (Mx) las proteínas son una parte importante de la defensa inmune innata contra los patógenos virales. Estas proteínas son grandes GTPasas-dynamin como que son inducidos por el tipo I y tipo III interferones. Los genes MX correspondientes están presentes en casi todos los vertebrados en una o varias copias y sus productos génicos inhiben una amplia gama de virus, incluyendo Orthomyxoviridae (por ejemplo., Virus de la gripe), Rhabdoviridae (por ejemplo., Virus de la estomatitis vesicular), Bunyaviridae (por ejemplo. , el virus de la crosse) y Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana-1) ^1-4. No está claro cómo estas proteínas reconocen una amplia gama de virus tales, sin ninguna secuencia primaria compartida aparente motivos en estos virus. El análisis de la interacción de proteínas Mx con sus objetivos virales, potencialmente involucra complejos de orden superior con otros factores de la célula huésped, le ayudará a comprender los mecanismos moleculares tsombrero de haber evolucionado en la carrera armamentista entre los virus y sus anfitriones.

La interacción entre las proteínas de mamíferos Mx y objetivos virales se ha estudiado más ampliamente para MxA humano. MxA humano puede inhibir la replicación de muchos virus, incluyendo el ortomixovirus influenza A y virus Thogoto. MxA une los complejos de ribonucleoproteína virus Thogoto (vRNPs), impidiendo de este modo su entrada nuclear, lo que resulta en el bloque ⁵ de la infección. Esta interacción entre MXa y Thogoto vRNPs virus se ha demostrado con co-sedimentación y co-inmunoprecipitación experimentos ^6-9. Cómo proteínas Mx obstaculizan virus de influenza A que está menos claro. Un problema importante es que no es fácil de demostrar una interacción entre una proteína Mx y un producto génico influenza. Un informe mostró una interacción entre MxA humana y la proteína NP de la gripe A células infectadas por virus ^10. Esta interacción sólo se pudo demostrar por co-immunoprecipitation si las células habían sido tratados con los ditiobis reactivo de reticulación (propionato de succinimidilo) antes de la lisis, lo que sugiere que la interacción es transitorio y / o débil. Estudios más recientes han demostrado que el diferencial Mx sensibilidad de las distintas cepas de la gripe A se determina por el origen de la proteína NP ^11,12. En línea con esto, los virus de la influenza A pueden escapar parte del control Mx mutando residuos específicos en la proteína NP ^13. Esto sugiere que el principal objetivo de los virus de la gripe A para el host Mx es la proteína NP, probablemente NP montado en complejos vRNP. Sin embargo, ninguno de estos estudios más recientes demostraron una interacción entre la gripe NP o vRNPs y, o bien MxA humano o de ratón Mx1.

Recientemente hemos demostrado, por primera vez, una interacción entre la influenza NP y la proteína Mx1 de ratón con un protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado ^14, que se describe aquí en detalle. En general, co-immunoprecipitation es uno de los enfoques bioquímicos utilizados más frecuentemente para investigar las interacciones proteína-proteína. Esta técnica se prefiere a menudo sobre las técnicas alternativas, por ejemplo, dos híbridos de levadura, ya que permite investigar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural. Co-inmunoprecipitación se puede llevar a cabo en las proteínas expresadas endógenamente si los anticuerpos contra las proteínas de interés están disponibles. Alternativamente, las proteínas de interés se pueden expresar en la célula a través de la transfección o infección y una etiqueta de afinidad pueden ser utilizados. Además de las ventajas mencionadas anteriormente, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite la detección de interacciones débiles y / o transitorios de proteínas. El componente principal de este protocolo optimizado es la adición de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de lisis celular. NEM es un reactivo de alquilación que reacciona con los grupos tiol libres tales como presente en cisteínas, a un pH de 6.5 a 7.5, para formar un éster tio-estable(Figura 1). A mayor pH, NEM también puede reaccionar con grupos amino o someterse a hidrólisis ^15. NEM se utiliza típicamente para bloquear los grupos tiol libres, con el fin de prevenir la formación de enlaces disulfuro o inhibir la actividad enzimática. Por ejemplo, NEM se utiliza a menudo para bloquear enzimas desumoylating, que son proteasas de cisteína. En el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita, NEM se incluyó en el tampón de lisis porque había sido informado de que la sumoilación de las proteínas de la gripe puede influir en la interacción entre las proteínas virales ^16. Inesperadamente, la adición de NEM resultó ser clave para documentar la interacción entre la gripe NP y el ratón Mx1 por co-inmunoprecipitación. No está claro por qué la adición de NEM es crucial para detectar la interacción NP-Mx1. Posiblemente la interacción es demasiado transitoria y / o débil. NEM podría estabilizar la interacción, por ejemplo, mediante la preservación de una conformación específica de Mx1, una proteína viral o incluso un tercero desconocido componente. Tal efecto estabilizador de NEM se ha observado antes, por ejemplo, para la interacción entre la ribonucleótido reductasa M1 y su gemcitabina inhibidor (F2dC) ^17. Mx1 y NP ambos contienen múltiples residuos de cisteína que podrían ser modificados por NEM. Por ejemplo, un estudio reciente de Rennie et al. Demostró que una variante sin pecíolo MxA contiene tres residuos de cisteína expuestos de disolventes que pueden ser modificados por yodoacetamida. La mutación de estos residuos de serinas no influyó en la actividad enzimática de MxA, pero impide la agregación mediada por disulfuro de ^18. Como estas cisteínas se conservan en Mx1, esto sugiere que las cisteínas análogos en Mx1 pueden ser modificados por NEM y como tal influencia su conformación o solubilidad. Además, NEM también podría afectar a la actividad GTPasa de Mx1, que es esencial para la actividad anti-influenza de Mx1, y con ello estabilizar la interacción entre Mx1 y NP. Sin embargo, un efecto directo de NEM en la GTPasa actividad de Mx1 es improbable, ya que también se requiere NEM para detectar la interacción entre la gripe NP y GTPasa mutantes inactivas de la proteína Mx1 ^14. Claramente, se necesita más investigación para desentrañar el efecto de NEM en la interacción NP-Mx1.

En resumen, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite estudiar la interacción entre la proteína antiviral Mx1 y su diana viral, la proteína NP de la gripe. Este protocolo también podría ser utilizado para estudiar otras interacciones débiles o transitorios que dependen de la estabilización de las conformaciones de proteínas específicas. Interacción proteína-proteína que dependen de conformaciones específicas se han descrito antes, por ejemplo, para las proteínas de unión a calcio tales como calmodulina ^19. Por último, el papel beneficioso de NEM también podría ser utilizado en otros métodos que detectan interacciones proteína-proteína, tales como ensayos de co-sedimentación.

Protocolo

Nota: El siguiente protocolo de transfección y co-inmunoprecipitación se establece para un formato de placa de Petri de 9 cm. Otros formatos también son posibles después de escalar el protocolo.

1. Siembra el riñón embrionario humano (HEK) Células 293T

1. Sembrar el células HEK293T un día antes de la transfección a 1,2 x 10 ⁶ células por 9 cm placa de Petri en 12 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 2 mM L-glutamina, 0,4 mM Na-piruvato, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 100 U / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina.
2. Cultivar las células 16 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
3. Inspeccione visualmente la morfología y la viabilidad de las células con un microscopio de luz invertida antes de la transfección. Las células necesitan para ser sub-confluente para una óptima eficiencia de transfección.

2.-fosfato de calcio transfección de células HEK293T

Nota: Uso 0,5-1 g de pCAXL-NP o plásmido vacío pCAXL en combinación con 1.3 g de pCAXL-Mx1 por 9 cm plato. Utilice una cantidad igual de ADN plasmídico total en todas las muestras; ajustar con el plásmido vacío si es necesario.

1. Prepare los siguientes tampones de transfección:
   1. Preparar Tris-EDTA (TE) con concentraciones de 1,0 mM Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 0,1 mM pH 8,0.
   2. Preparar BS / HEPES con concentraciones de 25 mM HEPES (5,96 g / L, 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), NaCl 274 mM (16 g / L), 10 mM KCl (0,74 g / L), 1,5 mM NaHPO ₄ · 12H ₂ O (0,5 g / L) y dextrosa 11,1 mM (2 g / L). Ajustar el pH a 7,05.
   3. Preparar CaCl ₂ / HEPES con concentraciones de 1,25 M CaCl ₂ · 2H ₂ O (183,8 g / L) y 125 mM HEPES (29,79 g / L). Ajustar el pH a 7,05 con NaOH.
2. Calentar los buffers de transfección a 37 ° C antes de su uso.
3. Preparar las muestras de plásmido mediante la dilución del ADN plásmido en 600 l de TE.Preparar estas mezclas en pocillos de una placa de 6 pocillos.
4. Añadir 150 l de CaCl ₂ / HEPES en un gota a gota de manera que las muestras de plásmidos y mezclar pipeteando 3 veces arriba y abajo.
5. Preparar la solución de transfección a gota la adición de la solución sabia plásmido (TE + ADN + CaCl ₂ / HEPES; 750 l) a 750 l de tampón BS / HEPES proporcionados en una placa de 6 pocillos fresco. Distribuir el plásmido de manera uniforme sobre el buffer / HEPES BS así que contiene completa.
6. Agite la solución de transfección en un agitador de placas durante 90 segundos a 1000 RPM.
7. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Añadir la solución de transfección (1,5 ml) gota a gota a las células. Utilice una micropipeta P1000 a gotear la solución de transfección en las células. Dispersar la mezcla sobre la completa 9 cm placa de Petri y agitar la placa muy suavemente.
9. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 6 horas. A continuación, retire el medio por aspiración y sustituir de inmediato wiº 12 ml de medio fresco, pre-calentado. Añadir con cuidado el medio fresco a las células para evitar el desprendimiento de células. Para ello, mantenga la punta de la pipeta contra el lado del pozo y empuje suavemente hacia fuera el medio.
10. Se incuban las células durante una 16 h adicionales a 37 ° C y 5% de CO _2.

3. Co-inmunoprecipitación

Nota: Realice el coinmunoprecipitación 24 horas después de la transfección.

1. Preparación de la baja tampón de lisis sal y tampón de lavado alta en sal.
   1. Preparar una solución madre de 2 M N-etil-maleimida (NEM) pesando la cantidad de NEM y disolviéndolo en etanol absoluto. Preparar la solución madre NEM fresco antes de su uso.
      PRECAUCIÓN: NEM es muy tóxica, preparar y utilizar esta solución madre en una campana de humos.
   2. Preparar baja tampón de lisis a concentraciones de sal mM Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), 1% de NP40 y un cóctel inhibidor de la proteasa (1 disolver tablat en tampón de lisis 50 ml). Añadir NEM a una concentración final de 25 mM (es decir, diluir 1:80). Mantener en hielo después de la adición de los inhibidores de la proteasa y NEM.
      Nota: Siempre agregue los inhibidores de la proteasa y NEM recién antes de su uso.
   3. Preparar un tampón de lavado de sal alta en concentraciones de 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM y 1% de NP40. Tenga en cuenta que el tampón de lavado alta en sal no contiene NEM.
2. Preparación de lisados ​​celulares.
   1. Retire el medio y se lavan las células con 2 ml de hielo frío buffer fosfato salino (PBS). Añadir Muy suavemente el tampón de lavado, como células HEK293T se desprenden fácilmente.
   2. Retire el PBS y añadir 600 l de tampón enfriado con hielo bajo lisis sal por 9 cm placa de Petri.
   3. Se incuban las placas durante 20 minutos en hielo. Asegúrese de que las placas se mantienen horizontal, para asegurar la cobertura completa de la superficie de la placa con tampón de lisis. Agite suavemente las placas cada 5 minutos.
   4. Recoger el lisado de células en una microcentrífuga de 1,5 mltubo y centrifugar durante 3 min a 4 ° C y 16.000 xg para sedimentar la fracción insoluble.
   5. Transferencia de la fracción soluble, es decir, el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y mantenerla en hielo. Inmediatamente continuar con el protocolo de co-inmunoprecipitación, para evitar la disociación de las proteínas que interactúan. Realice todos los pasos siguientes en lo posible en el hielo o a 4 ° C para limitar la actividad proteolítica en los lisados.
3. Generación de complejos inmunes.
   Nota: En este paso, la proteína de interés está vinculado por el anticuerpo apropiado. Para estudiar la interacción NP-Mx1, utilizar un anticuerpo monoclonal anti-NP ratón.
   1. Para cada muestra, mezclar 135 l de lisado con 2 l de anti-NP anticuerpo monoclonal y 113 l de tampón de lisis de baja sal (volumen total de 250 l). Almacenar el lisado restante a -20 ° C para su posterior análisis como el Western Blot, para documentar los niveles de expresión de la Intera conjeturadosocios cción en las células transfectadas.
      Nota: Como alternativa, medir la concentración de proteína del lisado (por ejemplo, con el reactivo de Bradford) y el uso de una cantidad fija de proteína total, por ejemplo, 400 g, para cada lisado.
   2. Se incuba la mezcla de anticuerpos lisado durante 3 horas en una rueda giratoria a 4 ° C. Este paso se puede extender a una incubación durante la noche.
4. Preparación de la proteína G cuentas.
   Nota: Las perlas de proteína G se envían y se almacenan en etanol al 20% para su conservación. El talón suspensión normalmente consiste de 50% de perlas y estas perlas necesitan ser lavados antes de ser utilizados para inmunoprecipitar los complejos inmunes.
   1. Utilice 50 l de perlas, es decir, 100 l de perlas en suspensión, para cada muestra. Lavar la cantidad de perlas necesarios para todas las muestras en el ensayo de co-inmunoprecipitación en un solo tubo. Cortar la punta de una punta de pipeta de 1 ml para facilitar el pipeteado de la perla de la lechada.
   2. Centrifugar la proteína G perlas suspensión a 8000 xg y 4 ° C durante 30 seg. Retirar la solución de etanol y añadir un volumen igual de tampón de lisis de baja sal. Centrifugar la proteína G bead-suspensión a 8000 xg y 4 ° C durante 30 segundos y retirar el sobrenadante con suavidad. Repita este paso de lavado 3 veces.
      Nota: El tampón de lisis de baja sal utilizada para lavar las perlas no necesita contener inhibidores de la proteasa o NEM.
   3. Estimar el volumen de la proteína G cuentas y añadir un volumen igual de tampón de baja lisis sal para hacer un nuevo 50% del grano-suspensión en tampón de baja lisis sal.
   4. Para cada muestra, la transferencia de 100 l de perlas en suspensión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco y almacenar en hielo hasta su uso. Tenga cuidado para resuspender la suspensión de perlas antes de dividir, ya que estas perlas se sedimentan rápidamente a la parte inferior del tubo.
5. La inmunoprecipitación de los complejos inmunes de perlas de proteína G y su elución.
   1. Antes de utilizar las proteínas G bolas para la inmunoprecipitación, todos los tubos de centrífuga de 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C yverificar mediante inspección visual de que hay una cantidad igual de perlas presente en todas las muestras. Si es necesario ajustar la cantidad de perlas en algunas de las muestras y se centrifuga de nuevo. Deseche los sobrenadantes. Tenga cuidado de no molestar a las proteínas G bolas sedimentadas.
   2. Centrifugar brevemente los complejos inmunes (es decir., Lisados ​​con el anticuerpo, 250 l) durante 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C para recoger la muestra completa en la parte inferior del tubo. La transferencia de los complejos inmunes a las perlas proteína G (50 l).
   3. Incubar 60 min en una rueda de inflexión a 4 ° C. No incubar estos complejos inmunes más de 75 min con las perlas para reducir la unión no específica de proteínas a la proteína G cuentas.
   4. Centrifugar las perlas de proteína G (con complejos inmunes ligados) durante 30 segundos a 8000 xg y 4 ° C y retirar los sobrenadantes. Tenga cuidado de no molestar a las proteínas G bolas sedimentadas. Opcional: almacenar estos sobrenadantes a 4 ° C o -20 ° C para su posterior análisis,por ejemplo, para estimar la cantidad de proteína no unida.
   5. Lavar las proteínas G bolas durante aproximadamente 5 min con 900 l de tampón de lisis de alta sal. Asegúrese de que las cuentas están completamente resuspendidas en el tampón de lavado para el lavado óptimo. Centrifugar las proteínas G bolas durante 30 segundos a 8.000 xg y 4 ° C y descartar el sobrenadante. Repita este paso de lavado 4 veces. Tenga cuidado de no alterar las perlas de proteína G sedimentadas para evitar la pérdida de material inmunoprecipitado.
   6. Después de la última etapa de lavado, se añaden 50 l de tampón de muestra 2x Laemmli a las perlas y se calienta la suspensión durante 10 min a 95 ° C para eluir los (co) proteínas inmunoprecipitadas.
      1. Preparar 10 ml de tampón de Laemmli 6x con 1 g de dodecil-sulfato de sodio, 3,5 ml de glicerol, 3,5 ml de 1 M Tris-HCl pH 6,8 y 420 l de β-mercaptoetanol. Ajustar a un volumen total de 10 ml por adición de agua destilada. Diluir 3 veces en agua destilada para obtener tampón Laemmli 2x.
         PRECAUCIÓN: &# 946; mercaptoetanol es tóxico, preparar y usar tampón Laemmli en una campana de humos.
   7. Después de calentar, centrifugar las proteínas G bolas durante 30 segundos a 8.000 xg y almacenar las muestras a 4 ° C (corto plazo) o -20 ° C (a largo plazo).

4. Analizar la (co) inmunoprecipitaron proteínas

1. Visualizar las proteínas presentes en el lisado de células y eluato de la co-inmunoprecipitación por SDS-PAGE ²⁰ y el oeste de transferencia de ^21,22. Normalmente cargar medio del eluido Laemmli en gel. Tenga cuidado de no molestar a los granos G de proteínas sedimentadas al tomar muestras para carga de gel. Mx1 y expresión NP se revelaron con un anti-Mx1 y anticuerpo-NP anti, respectivamente ^14. Las bandas se detectaron con quimioluminiscencia basado-HRP y un desarrollador de película de rayos X.

Resultados

N-etil-maleimida es un compuesto orgánico que se puede utilizar para modificar irreversiblemente grupos tiol libres, por ejemplo, para inhibir las proteasas de cisteína (Figura 1).

La proteína antiviral Mx1 inhibe la replicación del virus influenza A mediante la interacción con la nucleoproteína viral. El protocolo coinmunoprecipitación optimizado descrito aquí permite estudiar esta interacción NP-Mx1. Células HEK293T fueron transfectadas con vectores de e...

Discusión

El estudio de la interacción entre las proteínas antivirales y sus dianas virales es muy importante para entender los detalles del mecanismo antiviral de estas proteínas. Esto puede dar nuevas pistas sobre cómo coevolucionado virus y sus anfitriones y ser la base para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales. El protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado descrito aquí permite estudiar la interacción entre la proteína Mx1 de ratón y su diana viral, la proteína NP de la gripe. El aspecto más importan...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Gibco	52100-047
N-Ethylmaleimide	Sigma	E-3876	Toxic
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	also known as NP40
Protease inhibitor cocktail	Roche	11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-4282	ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-3133	directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL western blotting substrate	Pierce	32106