インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

要約

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

要約

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

概要

ミクソウイルス抵抗（MX）タンパク質は、ウイルスの病原体に対する先天性免疫防御の重要な部分である。これらのタンパク質は、I型およびIII型インターフェロンにより誘導される大ダイナミン様GTPアーゼである。対応のMx遺伝子は、1つまたは複数のコピーのほぼすべての脊椎動物に存在し、それらの遺伝子産物は、 オルソミクソウイルス科 （ 例えば 、インフルエンザウイルス）、 ラブドウイルス科 （ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）、 ブニヤウイルス科 （ 例えば含む、広範囲のウイルスを阻害する。 、ラクロスウイルス）およびレトロウイルス （ 例えば、ヒト免疫不全ウイルス^-1）1-4。それは、これらのタンパク質は、これらのウイルスの任意の明白な共有の一次配列モチーフのないウイルスのような幅広い配列を、認識かは不明である。潜在的に、それらのウイルス標的にはMxタンパク質の相互作用を分析する他の宿主細胞因子との高次複合体を含む、トン分子機構を理解するのに役立ちます帽子は、ウイルスとそのホスト間の軍拡競争に進化してきた。

哺乳類のMxタンパク質およびウイルス標的の間の相互作用は、ヒトMxAの最も広く研究されてきた。人間のMxAはオルトミクソウイルス、インフルエンザAおよびThogotoウイルスを含む多くのウイルスの複製を阻害することができる。のMxA、それによって感染⁵のブロックになりそれらの核侵入を防止、Thogotoウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNPs）に結合する。のMxAとThogotoウイルスvRNPsとの間のこの相互作用は、共同沈降と共免疫沈降実験^6-9で実証されている。 Mxのタンパク質は、インフルエンザAウイルスを妨げる方法あまり明らかではない。一つの大きな問題は、Mx蛋白質とインフルエンザ遺伝子産物間の相互作用を実証するために簡単ではないということである。一つのレポートには、インフルエンザウイルスに感染した細胞^10を人間のMxAおよびNPタンパク質との間の相互作用を実証した。この相互作用は、唯一の共同immunoprによって示すことができたecipitation細胞が相互作用は一過性および/または弱であることを示唆し、溶解する前に、架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）で処理した場合。より最近の研究は、異なるインフルエンザA株の差動Mxの感度はNPタンパク質^11,12の起点によって決定されることを示した。これに伴い、A型インフルエンザウイルスは、部分的にNPタンパク質¹³内の特定の残基を変異させることによりMxの制御から逃れることができます。これは、ホストのA型インフルエンザウイルスの主要なターゲットはMxのはおそらくNPがvRNP複合錯体で組み立て、NPタンパク質であることを示唆している。しかし、これらのより最近の研究はいずれも、インフルエンザNPまたはvRNPsおよびヒトのMxAまたはマウスMx1のいずれかの間の相互作用を示さなかった。

最近では、初めて、インフルエンザNPおよび、ここでは詳細に説明されて最適化された共免疫沈降プロトコル^14、マウスMx1のタンパク質との間の相互作用を示した。一般に、コのimmunoprecipitationは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために最も頻繁に使用される生化学的アプローチの一つである。それは、それらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用を調査することを可能にするので、この技術は、多くの場合、代替技術、 例えば、酵母ツーハイブリッドよりも好ましい。目的のタンパク質に対する抗体が利用可能である場合、共免疫沈降は、内因的に発現されるタンパク質に行うことができる。あるいは、目的のタンパク質は、トランスフェクションまたは感染を介して細胞内で発現させることができ、親和性タグを使用することができる。上記の利点に加えて、説明し、共免疫沈降プロトコルは、弱いおよび/または一過性タンパク質相互作用の検出を可能にする。この最適化されたプロトコルの主な成分は、細胞溶解緩衝液中にN-エチルマレイミド（NEM）の添加である。 NEMは、安定したチオエステルを形成するために、6.5〜7.5のpHで、そのようなシステイン中に存在する遊離チオール基と反応するアルキル化試薬である（ 図1）。より高いpHでは、NEMは、アミノ基と反応または加水分解^15を受けることができる。 NEMは、典型的には、ジスルフィド結合の形成を防止または酵素活性を阻害するために、遊離チオール基をブロックするために使用される。例えば、NEMは、多くの場合、システインプロテアーゼであるdesumoylating酵素をブロックするために使用される。それはインフルエンザタンパク質のSUMO化は、ウイルスタンパク質¹⁶との間の相互作用に影響を与えることができることが報告されていたので、記載の免疫共沈降プロトコルでは、NEMは、最初の溶解緩衝液に含まれていた。予想外に、NEMの添加は、共免疫沈降によってインフルエンザNPおよびマウスMx1の間の相互作用を文書化キーであることが判明した。 NEMの添加は、NP-Mx1の相互作用を検出することが重要である理由は不明である。おそらく相互作用があまりにも一過性および/または弱い。 NEMは、Mx1の特定のコンホメーションを保存することにより、例えば 、ウイルスタンパク質、あるいは未知の第三のコンポを相互作用を安定させることができポーネント。 NEMのこのような安定化効果は、リボヌクレオチド還元酵素M1とその阻害剤ゲムシタビン^（F2dC）17との間の相互作用のために、例えば 、以前に観察されている。 Mx1のとNPの両方がNEMによって修正することができる複数のシステイン残基を含む。例えば、レニーらによる最近の研究はstalkless MxAの変異はヨードアセトアミドにより修飾することができる3つの溶媒露出したシステイン残基を含有することを実証した。セリンにこれらの残基を変異することのMxAの酵素活性に影響を与えるが、ジスルフィド媒介凝集^18を妨げませんでした。これらのシステインはMx1の中で保存されているように、これはMx1の中の類似のシステインがNEMによって、そのような影響は、そのコンホメーまたは溶解度のように変形することができることを示唆している。また、NEMもMx1の抗インフルエンザ活性に必須であるMx1の、のGTPase活性に影響を与え、それによってMx1のとNPとの相互作用を安定化させるかもしれない。しかし、GTPアーゼACTI上のNEMの直接の効果NEMはまた、インフルエンザNPおよびGTPアーゼMx1のタンパク質¹⁴の非アクティブな変異体の間の相互作用を検出する必要があるとしてMx1ののVITYは、ほとんどありません。明らかに、より多くの研究がNP-Mx1の相互作用にNEMの影響を解明するために必要とされる。

要約すると、説明した共免疫沈降プロトコルは、抗ウイルスMx1のタンパク質とそのウイルス標的、インフルエンザNPタンパク質間の相互作用を研究することができます。このプロトコルは、特定のタンパク質コンフォメーションの安定化に依存する他の弱いまたは一時的な相互作用を研究するために使用することができる。特定のコンホメーションに依存する、タンパク質-タンパク質相互作用は、カルモジュリン¹⁹などのカルシウム結合タンパク質のために、例えば 、以前に記載されている。最後に、NEMの有益な役割はまた、そのような共沈降アッセイなどのタンパク質 - タンパク質相互作用を検出する他の方法で使用することができる。

プロトコル

注：以下のトランスフェクションおよび共免疫沈降プロトコルは9センチメートルシャーレ形式のために確立されている。他の形式のプロトコルをスケーリング後も可能である。

ヒト胚腎臓（HEK）293T細胞を播種1.

1. 10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、0.4mMのピルビン酸ナトリウムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）12mlの9cmのペトリ皿あたり1.2×10 ⁶細胞でのトランスフェクションの前にHEK293T細胞を一日に播種、 0.1mMの非必​​須アミノ酸、100 U / mlペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン。
2. 細胞を37℃で16時間、5％CO _2を成長させる。
3. 視覚的にトランスフェクション前に反転光顕微鏡で細胞の形態および生存を検査。細胞は、最適なトランスフェクション効率のためのサブ集密にする必要があります。

HEK293T細胞の2リン酸カルシウムのトランスフェクション

注意：9 cmディッシュあたりpCAXL-Mx1の1-3μgのとの組み合わせでpCAXL-NPまたは空pCAXLプラスミドの使用0.5〜1μgの。全試料中の全プラスミドDNAの等量を使用する。必要に応じて、空のプラスミドで調整します。

1. 以下のトランスフェクションバッファを準備します。
   1. 1.0 mMのトリス-HClの濃度は8.0と0.1のEDTA pH8.0でトリスEDTA（TE）を準備します。
   2. 、25mMのHEPES（5.96グラム/ L、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）の濃度でBS / HEPESを準備、274 mMのNaClを（16グラム/ L）、10のKCl（0.74グラム/ L） 1.5ミリモルのNaHPO _{4·12H 2} O（0.5g / Lの）、および11.1 mMのデキストロース（2g / Lの）。 7.05にpHを調整する。
   3. 1.25 MのCaCl _{2·2H 2} O（183.8グラム/ L）と125 mMのHEPES（29.79グラム/ L）の濃度でのCaCl ₂ / HEPESを準備します。 NaOHで7.05にpHを調整する。
2. 使用前に37℃でのトランスフェクション緩衝液を温める。
3. TEの600μlのプラスミドDNAを希釈することによって、プラスミドのサンプルを準備します。6ウェルプレートのウェル中でこれらの混合物を準備します。
4. プラスミドサンプルに滴下方式でのCaCl ₂ / HEPES150μlのを追加し、上下に3回ピペッティングして混ぜる。
5. 新鮮な6ウェルプレートに設けBS / HEPES緩衝液の750μlに、プラスミド溶液（750μlのTE + DNA +のCaCl ₂ / HEPES）を追加すること滴下することによりトランスフェクション溶液を準備します。よくBS / HEPES緩衝液を含む完全に均等にプラスミド溶液を配布します。
6. 1000rpmで90秒間プレートシェーカー上トランスフェクション溶液を振る。
7. 室温で5分間混合物をインキュベートする。
8. トランスフェクション溶液（1.5ミリリットル）を細胞に滴下して追加します。細胞にトランスフェクション溶液を滴下するP1000のマイクロピペットを使用してください。完全な9センチメートルペトリ皿の上に混合物を分散させ、非常に静かにプレートを横に振る。
9. 6時間37℃で細胞を、5％CO _2でインキュベートする。その後、吸引により培地を除去し、すぐのWiを交換12ミリリットル新鮮な、予め温めた培地番目。静かに細胞の剥離を防止するために、細胞に新鮮な培地を追加。このために、ウェルの側面にピペットの先端を保持し、静かにメディアを押し出す。
10. 37℃でさらに16時間細胞をインキュベートし、5％CO _2。

3.共免疫沈降

注：トランスフェクション後に共免疫沈降24時間を実行します。

1. 低塩の溶解緩衝液および高塩洗浄緩衝液を調製する。
   1. NEMの量を秤量し、無水エタノールに溶解することにより2 M N-エチルマレイミド（NEM）のストック溶液を調製する。使用前に新鮮なNEM原液を準備します。
      注意：NEMは、ドラフト中、この原液を調製し、使用し、非常に有毒である。
   2. 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1％NP40およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度で低塩溶解用緩衝液を調製する（表1を溶解するを50mlの溶解緩衝液中でt）とする。 25ミリ（ すなわち、1：80に希釈）の最終濃度にNEMを追加します。プロテアーゼ阻害剤とNEMを追加した後、氷上で保管してください。
      注：常に新鮮に使用前にプロテアーゼ阻害剤とNEMを追加します。
   3. 50mMトリス - 塩酸pHが8、500mMのNaCl、5mMのEDTA、1％NP40の濃度の高塩洗浄緩衝液を調製する。高塩洗浄バッファーはNEMが含まれていないことに注意してください。
2. 細胞溶解物の調製。
   1. 培地を除去し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）2mlで細胞を洗浄する。 HEK293T細胞を容易に切り離すように非常に優しく、洗浄緩衝液を加える。
   2. PBSを除去し、9センチメートルペトリ皿当たりの氷冷低塩の溶解バッファー600μlを添加する。
   3. 氷上で20分間プレートをインキュベートします。溶解緩衝液でプレート表面を完全にカバーを確実にするために、プレートが水平に保たれていることを確認します。静かに5分ごとにプレートを横に振る。
   4. 1.5ミリリットルの微量細胞溶解物を収集不溶性画分をペレット化4℃16,000×gで3分間のチューブと遠心分離機。
   5. 新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞溶解物、 すなわち可溶性画分を移し、氷上に保つ。すぐに相互作用するタンパク質の解離を防止するために、共免疫沈降プロトコルに進みます。溶解物中のタンパク質分解活性を制限するために氷の上または4℃で可能な限りすべて、次の手順を実行します。
3. 免疫複合体の生成。
   注：このステップでは、目的のタンパク質を適切な抗体によって結合される。 NP-Mx1の相互作用を研究するために、マウス抗NPモノクローナル抗体を使用する。
   1. 各サンプルについて、抗NPモノクローナル抗体の2μLと低塩溶解バッファー（250μlの総体積）の113μlの溶解物の135μLをミックス。推測されるインテラの発現レベルを文書化する、ウエスタンブロッティング等のさらなる分析のために-20℃で、残りの溶解物を保管してくださいトランスフェクトした細胞におけるctionパートナー。
      注：また、各溶解物のために、（ 例えば、Bradford試薬で）溶解物のタンパク質濃度を測定し、総タンパク質の一定量を使用して、 例えば、400μgの。
   2. 4℃で回し車で3時間のための抗体 - 溶解物ミックスをインキュベートする。このステップは、一晩のインキュベーションに拡張することができる。
4. プロテインGビーズの調製。
   注：プロテインGビーズを出荷および保存のために20％エタノール中で保存されている。ビーズスラリーは、通常、50％のビーズで構成され、これらのビーズは、それらが免疫複合体を免疫沈降させるために使用される前に洗浄する必要がある。
   1. 各サンプルについて、 すなわちビーズ、50μlの、ビーズスラリーの100μlのを使用してください。 1管中の共免疫沈降アッセイにおけるすべてのサンプルのために必要なビーズの量を洗ってください。ビーズスラリーのピペット操作を容易にするために1ミリリットルピペットチップの先端をカットします。
   2. 8000 xにおけるプロテインGビーズスラリーを遠心30秒間g及び4℃。エタノール溶液を除去し、低塩の溶解緩衝液の等容量を加える。遠心機で30秒間8000×gで4℃でプロテインGビーズスラリーと優しく上清を除去。この洗浄工程を3回繰り返します。
      注：ビーズを洗浄し、低塩の溶解緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤またはNEMを含む必要はない。
   3. プロテインGビーズの体積を推定し、低塩の溶解緩衝液中で新たな50％ビーズスラリーを作成する低塩の溶解緩衝液の等容量を加える。
   4. 各サンプルについて、新しい1.5 mlマイクロチューブにビーズスラリーの100μlのを転送し、使用するまで氷上で保存する。これらのビーズはすぐにチューブの底に沈降するように、除する前に、ビーズスラリーを再懸濁するように注意してください。
5. プロテインGビーズおよびそれらの溶出による免疫複合体の免疫沈降。
   1. 免疫沈降のためにプロテインGビーズを使用する前に、遠心すべての管8000×gで30秒、4℃、全てのサンプル中に存在するビーズの等量があることを目視により確認する。必要に応じて、再びサンプルと遠心機のいくつかでビーズの量を調整します。上清を捨てる。ペレット化プロテインGビーズを乱さないように注意してください。
   2. 簡単に言えばチューブの底に完全なサンプルを収集するために8000×gで4℃で30秒間、免疫複合体（ すなわち 、抗体との溶解物、250μl）を遠心する。プロテインGビーズ（50μl）を、免疫複合体を転送します。
   3. 4℃で回し車で60分インキュベートします。プロテインGビーズへのタンパク質の非特異的結合を減らすためにビーズと75分より長くこれらの免疫複合体をインキュベートしないでください。
   4. 8000×gで30秒間（結合した免疫複合体との）プロテインGビーズを遠心し、4℃、上清を取り除く。ペレット化プロテインGビーズを乱さないように注意してください。オプション：-20後の解析のためのC°4°Cで、この上清を保存し、例えば、非結合タンパク質の量を推定する。
   5. 高塩溶解緩衝液900μlの約5分間プロテインGビーズを洗浄する。ビーズが完全に最適な洗浄のための洗浄バッファーに再懸濁されていることを確認してください。 8000×gで30秒間プロテインGビーズを遠心し、4℃、上清を捨てる。この洗浄工程を4回繰り返します。免疫沈降材料の損失を回避するために、ペレット化プロテインGビーズを乱さないように注意してください。
   6. 最後の洗浄工程の後、ビーズを2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを追加し、（共）免疫沈降したタンパク質を溶出させ、95℃で10分間、懸濁液を加熱する。
      1. βメルカプトエタノールの1 Mトリス塩酸pHが6.8と420μLのドデシル硫酸ナトリウムの1グラムで6倍Laemmli緩衝液の10ミリリットル、グリセロールの3.5ミリリットル、3.5ミリリットルを準備します。蒸留水を加え、10 mLの総体積に調整する。 2×Laemmli緩衝液を得るために、蒸留水で3倍に希釈する。
         注意：＆＃946;メルカプトエタノールは毒性があり、準備し、ドラフト内でLaemmliのバッファを使用。
   7. 加熱した後、8000×gで30秒間遠心プロテインGビーズを、4℃（短期）または-20℃（長期）でサンプルを保存する。

4.（共）免疫沈降したタンパク質を分析

1. SDS-PAGE ²⁰と^21,22ウエスタンブロッティングによる細胞溶解物と共免疫沈降の溶出液中に存在するタンパク質を可視化。通常、ゲルでレムリ溶出液の半分をロードします。ゲルローディングのための試料を採取する際にペレット化プロテインGビーズを乱さないように注意してください。 Mx1のおよびNPの発現は、それぞれ^14、抗Mx1の及び抗NP抗体を用いて明らかにした。バンドはHRPベースの化学発光及びX線フィルム現像液を用いて検出した。

結果

N-エチルマレイミドは、システインプロテアーゼ（ 図1）を阻害するために、例えば 、不可逆的に遊離のチオール基を修飾するために用いることができる有機化合物である。

抗ウイルスMx1のタンパク質は、インフルエンザAウイルスの核タンパク質と相互作用することによりウイルス複製を阻害する。ここで説明する最適化された共免疫沈降プロトコ?...

ディスカッション

抗ウイルス性タンパク質およびそれらのウイルス標的の間の相互作用を研究することは、これらのタンパク質の抗ウイルス機構の詳細を理解することが非常に重要である。これは、ウイルスとそのホストが共同どのように進化したかに新たな洞察を与え、新たな抗ウイルス戦略の開発のための基礎となり得る。ここで説明する最適化された共免疫沈降プロトコルは、マウスMx1のタンパク質と?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM high glucose	Gibco	52100-047
N-Ethylmaleimide	Sigma	E-3876	Toxic
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	also known as NP40
Protease inhibitor cocktail	Roche	11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-4282	ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-3133	directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL western blotting substrate	Pierce	32106