المرحلة مخطط توصيف باستخدام الخرز المغناطيسي حيث الناقلون السائلة

Summary

Here, we present a protocol to investigate multi-component phase diagrams using externally controlled magnetic beads as liquid carriers in a lab-in-tube approach. This approach can aid in applications that seek to gather further information on phase change in complex liquid systems.

Abstract

واستخدمت حبات مغناطيسية مع ~ 1.9 ميكرون متوسط ​​قطر لنقل كميات ميكروليتر من السوائل بين قطاعات السائلة متجاورة مع أنبوب لغرض التحقيق في مرحلة تغيير من تلك الشرائح السائلة. وقد سيطر على حبات مغناطيسية خارجيا باستخدام المغناطيس، والسماح لحبات لسد صمام الهواء بين قطاعات السائلة المجاورة. تم تطبيق طلاء مسعور إلى السطح الداخلي للأنبوب لتعزيز الفصل بين جزأين السائلة. شكلت المجال المغناطيسي تطبق كتلة الإجمالية للحبات مغناطيسية، واستولت على كمية السائل معين داخل الكتلة التي يشار اليها على انها حجم المرحل. تمت إضافة صبغة الفلورسنت إلى الجزء السائل واحدة، تليها سلسلة من التحويلات السائلة، التي ثم تغير كثافة مضان في الجزء السائل المجاورة. استنادا إلى تحليل العددي لقياس تغير كثافة مضان، تم العثور على حجم المرحل في كتلة حبات مغناطيسيةأن يكون ~ 2-3 ميكرولتر / ملغ. هذه كمية صغيرة من السائل يسمح لاستخدام شرائح صغيرة نسبيا السائلة من بضع مئات من ميكرولتر، وتعزيز جدوى الجهاز لنهج مختبر في أنبوب. تم تطبيق هذه التقنية لتطبيق التباين التركيبي صغير في حجم السائل لتحليل مرحلة الرسم ثنائي بين المياه والسطحي C12E5 (pentaethylene جلايكول الأثير monododecyl)، مما أدى إلى أسرع التحليل مع أحجام العينة أصغر من الأساليب التقليدية.

Introduction

حبات مغناطيسية (ميجا) بناء على أمر من 1 ميكرومتر في القطر وقد استخدمت ^1،2 في كثير من الأحيان في التطبيقات المستندة إلى الموائع الدقيقة، ولا سيما للأجهزة الطبية الحيوية. في هذه الأجهزة، وعرضت ميجا قدرات مثل الخلايا وفصل الحمض النووي، عوامل التباين، وتسليم المخدرات، على سبيل المثال لا الحصر. وقد مكن مزيج من الخارجية (المجال المغناطيسي) السيطرة على microfluidics والقائم على قطرة ³ السيطرة المناعية باستخدام كميات صغيرة (<100 NL). وقد أظهرت ميجا كما وعد عندما تستخدم لمعالجة السائل ^4. يستخدم هذا النهج ميجا لنقل الجزيئات الحيوية بين قطاعات السائل داخل أنبوب مفصولة صمام الهواء. هذه الطريقة ليست قوية مثل أجهزة أخرى أكثر تعقيدا مختبر على رقاقة رأينا في الماضي، وإنما هو أبسط من ذلك بكثير ولا توفر القدرة على التعامل مع كميات ميكروليتر الحجم من السائل. وقد تم مؤخرا ذكرت نهج مماثل ⁵ من قبل مجموعة Haselton وتطبيقها على الطب الحيويالمقايسات.

واحدة من أهم جانب من جوانب هذا الجهاز هو فصل الجزء السائل التي تقدمها صمام هواء يمكن التحكم سطح التوتر. يتم نقل كميات ميكروليتر من السائل تعلق ميجا من خلال هذه الثغرة الجوي بين قطاعات السائلة باستخدام مجال مغناطيسي تطبيقها خارجيا. ميجا Microparticle (من ~ 0،4-7 ميكرون في القطر بمعدل 1.9 ميكرون) تحت تأثير مجال مغناطيسي خارجي خلق العنقودية الصغيرة التي يسهل اختراقها التي يعوض السائل داخل. قوة هذا انحباس سائل كافية لتحمل قوى التوتر السطحي عند نقل ميجا من خزان واحد إلى آخر. عادة، وهذا أثر غير مرغوب فيه، حيث أن معظم المناهج يريدون نقل جزيئات محددة (مثل المؤشرات الحيوية) الواردة في السوائل ⁶ فقط. لكن، وكما يمكن أن ينظر إليه في عملنا، وهذا التأثير يمكن استخدامها لتصبح أحد الجوانب الإيجابية للجهاز.

لقد استخدمت هذا "مختبر في أنبوب"النهج، كما هو موضح في الشكل 1 تخطيطي، لتحليل مخططات المرحلة في النظم المواد ثنائية. وقد تم اختيار السطحي C12E5 بوصفه المحور الرئيسي للتوصيف، كما يستخدم على نطاق واسع في التطبيقات الصناعية مثل الصناعات الدوائية، والمنتجات الغذائية، ومستحضرات التجميل، وما إلى ذلك على وجه الخصوص، وكان التحقيق في H ₂ O / C12E5 نظام ثنائي لأنه يوفر الأغنياء مجموعة من المراحل لاستكشاف. لقد ركزنا على جانب واحد محدد من هذا الخليط الكيميائي، وهي الانتقال الى مراحل البلورية السائلة تحت بعض تركيزات ^7-9. وقد لوحظ هذا التحول بسهولة في الجهاز لدينا من خلال دمج المستقطبات في الدراسات المجهر الضوئي من أجل تسليط الضوء على حدود المرحلة.

أن تكون قادرة على الخريطة مخططات المرحلة هي منطقة مهمة جدا من الدراسة من أجل فهم حركية يشارك مع المرحلة الانتقالية ^10. القدرة على تحديد بدقة التفاعل السطحي مع المذيبات لالثاني المكونات الأخرى أمر بالغ الأهمية نظرا لتعقيدها والعديد من مراحل متميزة ^(11). وقد سبق استخدام العديد من التقنيات الأخرى لتوصيف مرحلة تغيير. ينطوي النهج التقليدي صنع العديد من العينات، يتألف كل منها من تركيزات مختلفة والسماح لهم لكي تتوازن، الأمر الذي يتطلب أوقات المعالجة المطولة وكمية عالية من أحجام العينة. ثم، يتم عادة تحليل العينات عن طريق وسائل بصرية مثل النقل بينية ناشر (DIT)، والذي يقدم عالية الدقة من هذه التراكيب السطحي ^12،13. وعلى غرار الأسلوب نحن قد تستخدم، يستخدم أسلوب DIT الضوء المستقطب إلى صورة حدود مرحلة متميزة.

Protocol

1. إعداد لمرة واحدة استخدام المواد في الجهاز

1. إعداد أنبوب
   1. قطع الأنابيب إلى 15 سم قطاعات. أنابيب لديها 1.6 مم القطر الداخلي و 3.2 مم القطر الخارجي.
   2. شرائح أنبوب تعليق عموديا باستخدام الشريط. ضع منشفة ورقية تحت أنابيب لجمع الحل الفلورو بوليمر الزائد.
   3. ضخ 100 ميكرولتر من محلول الفلورو في افتتاح قمة كل شريحة باستخدام أنبوب حقنة، بحيث أنها سوف تأتي في اتصال مع محيط بأكمله على الجدار الداخلي.
   4. السماح قطاعات أنبوب لشنق في مكان لمدة 1 ساعة لإزالة كميات زائدة من حل الفلورو.
   5. تنظيف أي حل الفلورو من الجانب السفلي من الأنبوب الذي لم بالتنقيط بها. إزالة أنابيب من شنقا موقف والتخلص من المناشف الورقية.
   6. شرائح مكان الأنبوب في الفرن على 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ليصلب طبقة طلاء الفلورو.
   7. إزالة شرائح أنبوب من الفرن. استخدام ملاقط، وأنبوب ثوانىوالإدلاء بالبيانات تكون ساخنة.
2. إعداد المخفف حل حبة المغناطيسي
   1. حساب تركيز حبة المغناطيسي اللازمة لتحقيق حجم المرحل المطلوب، على النحو الذي تحدده العلاقة بين المرحل حجم وMB يظهر كتلة في الشكل 2.
      ملاحظة: MB حل الأصلي له 1 غرام من ميجا في 50 مل من محلول. النظر في حجم غرفة الاختبار من 20 ميكرولتر، وتمييع MB حل الأصلي مع الماء المقطر إلى نسبة 6: 4 (MB الحل: الماء) للحصول على حجم ترحيل ~ 0.4 ميكرولتر. ضبط نسبة التخفيف عند الرغبة مختلف حجم المرحل.
   2. ضع قارورة 20 مل العينة على التوازن الجزئي. الصفر التوازن.
   3. تستنهض الهمم الحاوية حل حبة المغناطيسي، ثم سحب 0.6 مل باستخدام ماصة الصغرى.
   4. الاستغناء عن حل pipetted في قارورة العينة على التوازن.
   5. الاستغناء عن 0.4 مل من الماء المقطر في عينة قارورة.
3. صبغة الفلورسنت لإعداد iquid
   1. حل 2 وزن٪ من الصبغة في الماء DI قبل vortexing الحل لمدة 1 دقيقة.

2. إعداد الإعداد التجريبية للتجارب الإسفار

1. إعداد جهاز الأنابيب.
   1. إدراج الإناث موصل لور قفل على واحدة من نهاية الأنبوب.
   2. وضع أنبوب في محقنة لور قفل لديها حجم 3 مل و 0.1 مل التخرج.
   3. ضع الحقنة في ضخ حقنة وضبط معدل التغذية في 2 مل / ساعة.
   4. لالإدراج دقيقة من السوائل في الأنابيب، واستخدام ضخ حقنة لسحب محلول يحتوي على حبات مغناطيسية وصبغة الفلورسنت.
   5. إدراج 20 ميكرولتر من محلول حبة المغناطيسي في أنبوب باستخدام ضخ حقنة الانسحاب. ويشار إلى هذا الجزء السائل باسم غرفة الاختبار (اختبار حجم الغرفة يمكن أن تختلف تبعا التجربة). دوامة الحاوية مع الحل حبة المغناطيسي لمدة 1 دقيقة ثم تستنهض الهمم باليد أثناء دورة انسحاب لتشكيل MB التفرق موحدة.
   6. بعد اختتمت غرفة الاختبار الإدراج السائل، سحب 6 ميكرولتر من الهواء في الأنبوب. وهذا الحجم من الهواء تشكل في وقت لاحق صمام بين اثنين من شرائح السائلة.
   7. بعد اكتمال فجوة الهواء الإدراج، تبدأ سحب 180 ميكرولتر من السائل مع صبغة الفلورسنت. ويشار إلى هذا الجزء السائل باسم الخزان. حجم الخزان يمكن أن تختلف تبعا التجربة. أكبر حجم المكمن هو مفيد للحد من تغير تركيز الصبغة.
   8. وضع الإناث موصل لور قفل الثاني على الطرف الآخر من الأنبوب.
   9. إزالة الجهاز أنبوب من الحقنة.
   10. تضع سقفا لور قفل على طرفي الجهاز.
2. الإعداد البصريات للتجارب مضان
   1. بدوره على جميع مكونات متصلة مجهر مقلوب.
   2. قم بتشغيل الكمبيوتر وفتح برامج التصوير المجهر.

"> 3. الإجراءات التجريبية للتجارب الإسفار

1. اتخاذ الأولي قياس كثافة مضان من غرفة الاختبار وخزان باستخدام مجهر مقلوب. عند تحليل مضان من العينة، وضمان أن يتم التركيز في موقف مركز (في كلا الاتجاهين x و Y) الجزء السائل داخل الأنبوب. قياسات سجل في جدول البيانات.
2. وضع الجهاز على رأس مكعب المغناطيس بحيث حبات مغناطيسية كل فصل إلى منطقة واحدة في غرفة الاختبار. نقل حبات إلى الخزان عن طريق تحريك الجهاز على أعلى من المغناطيس (~ 10 ثانية). 1 بوصة النيوديميوم مكعب المغناطيس الصف N48 مع قوة سحب من 45.6 كجم.
3. مرة واحدة يتم نقل كتلة حبة المغناطيسي من خلال فجوة الهواء وداخل الخزان، وتستنهض الهمم حبات مغناطيسية من خلال وضع الجهاز على أعلى من المغناطيس والدورية للافراج عن السائل الوقوع داخل الكتلة. تواصل التحريض من حبات مغناطيسية حتى يتم التجانس الخزانالانتهاء (~ 30-45 ثانية).
4. وضع الجهاز على رأس المغناطيس بحيث حبات مغناطيسية في الخزان كل فصل إلى منطقة واحدة. نقل الكتلة حبة المغناطيسي مرة أخرى إلى غرفة الاختبار.
5. مرة واحدة الكتلة تصل إلى غرفة الاختبار، تستنهض الهمم حبات مغناطيسية من خلال وضع الجهاز على أعلى من المغناطيس والدورية للافراج عن السائل الفلورسنت محاصرين داخل. تواصل التحريض من حبات مغناطيسية حتى تم الانتهاء تجانس غرفة الاختبار (~ 30-45 ثانية).
6. أخذ قياسات كثافة مضان من كل من غرفة الاختبار وخزان باستخدام مجهر مقلوب. قياسات سجل في جدول البيانات.
7. وتتكرر الخطوات 3،2-3،6 حتى قطاعي السائلة تلتقي لشدة مضان مماثلة (~ 100 دورات).

4. التحليل العددي من البيانات الفلورسنت

1. مع تخزين البيانات كثافة الفلورسنت في جدول بيانات، نفذ التحليل العددي باستخدام MATLAB.
2. Derivالمعادلات البريد لحساب قيمة النظرية للكثافة مضان في كل من خزان وغرفة الاختبار. دمج المعادلات التالية في ملف نصي MATLAB:
   حيث I هي شدة مضان (AU)، V هو حجم (ميكرولتر)، ن هو عدد التحويلات، R هو الخزان، T هو غرفة الاختبار، وC هو ترحيل.
3. باستخدام MATLAB، وتوليد المؤامرات وتحليل لتحديد حجم المرحل لجميع التجارب. استخدام هذه البيانات لإنتاج الشكل 2.

5. إعداد الإعداد التجريبية للتجارب السطحي

1. إعداد جهاز الأنابيب.
   1. إدراج الإناث لور قفل على واحدة من نهاية الأنبوب.
   2. وضع أنبوب في محقنة لور قفل.
   3. ضع الحقنة في ضخ حقنة وضبط معدل التغذية في 2 مل / ساعة.
   4. لالإدراج دقيقة من السوائل في الأنابيب، واستخدام ضخ حقنة لسحب محلول يحتوي على حبات مغناطيسية وسوrfactant.
   5. إدراج حل حبة 20 ميكرولتر المغناطيسي في أنبوب باستخدام ضخ حقنة الانسحاب. ويشار إلى هذا الجزء السائل باسم غرفة الاختبار (اختبار حجم الغرفة يمكن أن تختلف تبعا التجربة). تستنهض الهمم الحاوية مع الحل حبة المغناطيسي باليد أثناء دورة انسحاب لتشكيل MB التفرق موحدة.
   6. بعد اختتمت غرفة الاختبار الإدراج السائل، سحب 6 ميكرولتر من الهواء في الأنبوب. سيتم لاحقا يشار إلى هذا الحجم من الهواء على أنها فجوة الهواء.
   7. بعد اكتمال فجوة الهواء الإدراج، تبدأ سحب 180 ميكرولتر من الذهب الخالص C12E5 السطحي. هذا سيتم لاحقا يشار إلى الخزان.
2. الإعداد البصريات للتجارب السطحي.
   1. نقل ضخ حقنة مع جهاز أنابيب بحيث غرفة الاختبار مع حبات مغناطيسية هو في التركيز مع المجهر ستيريو.
   2. وضع ورقة من فيلم المستقطب على رأس مصدر ضوء LED. حرك مصدر ضوء LED تحت أنبوب تعلقضخ حقنة.
   3. نعلق الفيلم المستقطب آخر لعدسة المجهر ستيريو باستخدام الشريط. مما لا شك فيه أن اثنين من الأفلام المستقطب لها 90 درجة تعويض عن بعضها البعض.
   4. شن CCD (المسؤول إلى جانب جهاز) الكاميرا إلى مجهر ستيريو. توصيل الكاميرا إلى الكمبيوتر وفتح برامج التصوير.

6. إجراء التجارب لتجارب السطحي

1. وضع مغناطيس مكعب المقبل إلى غرفة الاختبار بينما شنت المغناطيس على موقف.
2. مرة واحدة تشكل حبات مغناطيسية كتلة، تبدأ ضخ السوائل في الأنبوب في معدل التغذية من 2 مل / ساعة بحيث يتم نقل الكتلة حبة المغناطيسي من غرفة الاختبار، عبر فجوة الهواء، والى غرفة الخزان السطحي.
3. وبمجرد وصول كتلة حبة المغناطيسي في منتصف الغرفة الخزان، ووقف الضخ على ضخ حقنة.
4. تحريك المغناطيس المكعب بعيدا عن الأنبوب، والسماح لحبات مغناطيسية لفصلالثانية تقليل الوقت نشر السائل المحاصرين في الكتلة حبة المغناطيسي.
5. مشاهدة شاشة الكمبيوتر لمراقبة H ₂ O / C12E5 دورة الخليط من خلال مراحل مختلفة.
6. بمجرد الانتهاء من نشر ومرحلة التغيير من السائل، ضع مغناطيس إلى وجهتها سابقا من قبل الخزان بحيث تشكل حبات مغناطيسية إلى كتلة.
7. عن طريق ضخ حقنة، سحب السوائل مثل أن الكتلة حبة المغناطيسي يتم نقلها من الخزان السطحي، عبر فجوة الهواء، ومرة أخرى إلى H _{2 O} اختبار الغرفة.
8. وبمجرد وصول كتلة حبة المغناطيسي في منتصف غرفة الاختبار، ووقف الضخ على ضخ حقنة.
9. تحريك المغناطيس المكعب بعيدا عن الأنبوب. وهذا سوف يسمح حبات مغناطيسية لفصل وسوف يساعد على التقليل من الوقت نشر السائل المحاصرين في الكتلة حبة المغناطيسي.
10. مشاهدة شاشة الكمبيوتر لمراقبة H ₂ O / C12E5 دورة الخليط من خلال مراحل مختلفة.
11. بمجرد الانتهاء من نشر ومرحلة التغيير من السائل، ضع مغناطيس إلى الوجهة السابقة من خلال غرفة الاختبار بحيث تشكل حبات مغناطيسية إلى كتلة.
12. كرر الخطوات 6،2-6،11 حتى تعرض غرفة الاختبار تغيير المرحلة.

النتائج

باستخدام نهج مختبر في انابيب لنقل كميات ميكرولتر حجم السائل مع حبات مغناطيسية جنبا إلى جنب مع MATLAB للتحليل العددي، متوسط ​​حجم التداول المرحل السائلة، بوصفها وظيفة من المغناطيسية كتلة حبة، تم العثور على (الشكل 2). كتلة أكبر من حبات مغناطيسية توفر أعلى حجم ال...

Discussion

في التقنيات الأكثر شيوعا لتحقيق مرحلة الرسم، وعينات متعددة مع التراكيب ونسب مختلفة تحتاج إلى أن تكون مستعدة ولديها للوصول إلى التوازن الحرارية الذي يسبب عملية طويلة وكمية كبيرة من المواد. بعض التحديات يمكن حلها عن طريق DIT طريقة (نقل بينية ناشر) باستخدام الشعرية شقة و...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetic beads
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymer solution
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescent dye
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Female
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Male
Syringe	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Syringe Pump	Stoelting	53130
Stereo Microscope	Nikon	SMZ-2T
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	The filter cube used had an excitation wavelength range from 540-580 nm and a dichroic mirror at 585 nm, allowing for photoemission ranging from 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Microscope-Mounted Camera	Motic	5000