Fase Diagramma Caratterizzazione utilizzando biglie magnetiche come vettori liquidi

Riepilogo

Here, we present a protocol to investigate multi-component phase diagrams using externally controlled magnetic beads as liquid carriers in a lab-in-tube approach. This approach can aid in applications that seek to gather further information on phase change in complex liquid systems.

Abstract

Perline magnetiche con ~ 1,9 micron di diametro medio sono stati usati per trasportare volumi microlitro di liquidi tra segmenti contigui liquidi con un tubo per lo scopo di indagare cambiamento di fase dei segmenti liquidi. Le perline magnetiche sono stati controllati esternamente utilizzando un magnete, permettendo alle sfere di colmare la valvola dell'aria tra i segmenti adiacenti liquidi. Un rivestimento idrofobo è stato applicato alla superficie interna del tubo per aumentare la separazione tra due segmenti liquidi. Il campo magnetico applicato formato un gruppo aggregato di perline magnetiche, catturando una certa quantità di liquido all'interno del cluster che viene definito come il volume riporto. Un colorante fluorescente è stato aggiunto ad un segmento liquido, seguita da una serie di trasferimenti liquidi, che poi cambiato l'intensità di fluorescenza nel segmento liquido vicina. Sulla base dell'analisi numerica della variazione di fluorescenza misurata intensità, è stato trovato il volume riporto per massa di perline magneticheessere ~ 2 a 3 ml / mg. Questa piccola quantità di liquido consentito per l'uso di relativamente piccoli segmenti liquide di una coppia cento microlitri, migliorando la fattibilità del dispositivo per un approccio lab-in-tubo. Questa tecnica di applicazione piccola variazione composizionale in un volume di liquido è stato applicato all'analisi diagramma di fase binaria tra acqua e tensioattivo C12E5 (pentaethylene glicole monododecyl etere), portando ad analisi veloce con piccoli volumi di campione rispetto ai metodi convenzionali.

Introduzione

Perline magnetiche (MB) dell'ordine di 1 micron di diametro sono stati utilizzati ^1,2 molto spesso nelle applicazioni basate microfluidica, particolarmente per dispositivi biomedicali. In questi dispositivi, MB hanno offerto funzionalità quali cellule e la separazione degli acidi nucleici, mezzi di contrasto, e la somministrazione di farmaci, per citarne alcuni. La combinazione di controllo esterno (campo magnetico) e microfluidica basata goccioline-ha consentito ^{3 Controllo} dei test immunologici usando piccoli volumi (<100 nl). MB hanno anche mostrato risultati promettenti quando viene utilizzato per la gestione dei liquidi ^4. Questo approccio utilizza MBS per trasportare biomolecole tra segmenti liquidi all'interno di un tubo separato da una valvola di sfiato. Questo metodo non è potente come altri dispositivi lab-on-chip più complessi visti in passato, ma è molto più semplice e non offre la capacità di gestire microlitro dimensioni volumi di liquido. Un approccio simile è stato recentemente riportato ⁵ dal gruppo di Haselton e applicato a biomedicosaggi.

Uno degli aspetti più importanti di questo dispositivo è la separazione segmento liquido offerto dalla valvola tensione superficiale controllata. Volumi microlitro di liquido attaccato MB vengono trasportati attraverso questa traferro tra i segmenti liquidi usando un campo magnetico applicato esternamente. MB microparticelle (da ~ 0,4-7 micron di diametro, con una media di 1,9 micron) sotto l'effetto del campo magnetico esterno creano un cluster microporosa che intrappola liquido all'interno. La forza di questo intrappolamento liquido è tale da resistere alle forze di tensione superficiale durante il trasporto MBS da un serbatoio all'altro. In genere, questo effetto non è auspicabile, come maggior parte degli approcci vogliono solo trasporto di molecole specifiche (come biomarcatori) contenuti nei liquidi ^6. Tuttavia, come si può vedere nel nostro lavoro, questo effetto può essere utilizzato per diventare un aspetto positivo del dispositivo.

Abbiamo utilizzato questo 'laboratorio-in-tubo'Approccio, illustrato schematicamente in figura 1, per analizzare diagrammi di fase nei materiali per binari. Il tensioattivo C12E5 è stato scelto come l'obiettivo principale di caratterizzazione, come è ampiamente usato in applicazioni industriali quali i prodotti farmaceutici, prodotti alimentari, cosmetici, ecc In particolare, _l'H 2 O / C12E5 sistema binario è stato indagato perché fornisce un ricco serie di fasi da esplorare. Ci siamo concentrati su un aspetto specifico di questa miscela chimica, vale a dire le transizioni ad fasi cristalline liquide in determinate concentrazioni ^7-9. Questa transizione è facilmente osservata nel nostro dispositivo incorporando polarizzatori negli studi di microscopia ottica per evidenziare confini di fase.

Essere in grado di mappare diagrammi di stato è una zona molto importante di studio al fine di comprendere la cinetica coinvolti transizione di fase ^10. La capacità di determinare con precisione l'interazione di tensioattivi con solventi and altri componenti è fondamentale per la loro complessità e molte fasi distinte ^11. Molte altre tecniche sono state precedentemente utilizzati per caratterizzare cambiamento di fase. L'approccio convenzionale consiste nel fare molti campioni, ciascuno composto di diverse concentrazioni e consentendo loro di equilibrare, che richiede tempi di lavorazione lunghi ed elevata quantità di volumi di campione. Quindi, i campioni sono tipicamente analizzati con metodi ottici come diffusiva trasporto interfacciale (DIT), che offre alta risoluzione di tali composizioni tensioattivi ^12,13. Simile al metodo che abbiamo utilizzato, il metodo DIT utilizza la luce polarizzata per immagini confini di fase distinte.

Protocollo

1. Preparazione di One-Time utilizzano materiali in Device

1. Preparazione del tubo
   1. Tagliare la tubazione in 15 cm segmenti. Tubing ha 1,6 mm di diametro interno e diametro esterno 3,2 millimetri.
   2. Segmenti di tubo Hang verticalmente con del nastro. Mettere tovagliolo di carta sotto i tubi per raccogliere la soluzione fluoropolimero in eccesso.
   3. Iniettare 100 ul di soluzione di fluoropolimero in apertura superiore di ciascun segmento tubolare mediante siringa, in modo tale che possa venire a contatto con tutta la circonferenza interna sulla parete.
   4. Consentire segmenti di tubo da appendere sul posto per 1 ora per eliminare l'eccesso quantità di soluzione fluoropolimero.
   5. Pulire qualsiasi soluzione fluoropolimero da una parte inferiore del tubo che non gocciola fuori. Rimuovere il tubo dalla posizione appeso e smaltire tovaglioli di carta.
   6. Luogo segmenti di tubo in forno a 100 ° C per 1 ora per temprare lo strato di rivestimento di fluoropolimero.
   7. Rimuovere segmenti di tubo dal forno. Utilizzare le pinzette, come tubo segmenti sarà caldo.
2. Preparazione della soluzione diluita perla magnetica
   1. Calcolare concentrazione perlina magnetica necessaria per raggiungere il volume di riporto desiderata, come determinato dal rapporto tra il volume di riporto e MB di massa mostrato in Figura 2.
      Nota: La soluzione MB originale ha 1 g di MB in 50 ml di soluzione. Considerando un volume della camera di prova di 20 microlitri diluita MB iniziale con acqua distillata ad un rapporto di 6: 4 (soluzione MB: acqua) per ottenere un volume riporto di ~ 0,4 microlitri. Regolare rapporto di diluizione quando si desidera diverso volume di riporto.
   2. Posizionare un flaconcino da 20 ml campione su un micro-equilibrio. Azzerare la bilancia.
   3. Agitare il contenitore della soluzione perlina magnetica, quindi prelevare 0,6 ml usando un micro-pipetta.
   4. Dispensare soluzione pipetta nel flaconcino campione sulla bilancia.
   5. Dispensare 0,4 ml di acqua distillata nel flacone del campione.
3. Colorante fluorescente lpreparazione iquid
   1. Sciogliere 2 peso.% Di colorante nell'acqua DI vortex la soluzione per 1 minuto.

2. Preparazione di setup sperimentale per gli esperimenti di fluorescenza

1. Preparazione del dispositivo tubi.
   1. Inserire un connettore Luer lock femmina su un'estremità del tubo.
   2. Posizionare il tubo in una siringa luer-lock che ha un volume di 3 ml e 0,1 ml graduazione.
   3. Posizionare la siringa nella pompa a siringa e impostare la velocità di alimentazione a 2 ml / hr.
   4. Per l'inserimento preciso di liquidi nel tubo, utilizzare la pompa a siringa per aspirare la soluzione contenente le perline magnetiche e colorante fluorescente.
   5. Inserire 20 ml di soluzione di perla magnetica in tubo con ritiro pompa a siringa. Questo segmento liquido viene indicato come camera di prova (volume della camera di test può variare a seconda dell'esperimento). Vortex il contenitore con la soluzione tallone magnetico per 1 minuto e poi agitare a mano durante il ciclo di ritiro per formare dispersioni MB uniformi.
   6. Conclusa camera di prova inserimento liquido, prelevare 6 microlitri di aria nel tubo. Questo volume di aria verrà successivamente formare una valvola tra i due segmenti liquidi.
   7. Dopo l'inserimento traferro è completata, iniziare recesso 180 ml di liquido con colorante fluorescente. Questo segmento liquido viene indicato come il serbatoio. Volume del serbatoio può variare a seconda dell'esperimento. Più grande volume del serbatoio è vantaggioso per minimizzare la variazione della concentrazione di colorante.
   8. Posizionare un secondo connettore Luer lock femmina sull'altra estremità del tubo.
   9. Rimuovere il dispositivo tubo dalla siringa.
   10. Mettere tappi Luer-Lock su entrambe le estremità del dispositivo.
2. Configurazione ottica per gli esperimenti di fluorescenza
   1. Accendere tutti i componenti collegati al microscopio invertito.
   2. Accendere il computer e aprire il software di imaging microscopio.

"Procedura> 3. Sperimentale per gli esperimenti di fluorescenza

1. Prendere misurazione dell'intensità di fluorescenza iniziale della camera di prova e serbatoio utilizzando il microscopio invertito. Analizzando la fluorescenza del campione, garantire che il focus è nella posizione centrale (in entrambe le direzioni X e Y) del segmento liquido all'interno del tubo. Registra misurazioni nel foglio di calcolo dei dati.
2. Posizionare dispositivo sopra la parte superiore del cubo magnetico tale che le sfere magnetiche tutti segregano ad una zona nella camera di prova. Trasferire le perline al serbatoio spostando il dispositivo sopra la parte superiore del magnete (~ 10 sec). Il magnete al neodimio cubo 1 pollice è di grado N48 con una forza di trazione di 45,6 kg.
3. Una volta grappolo perla magnetica viene trasferito attraverso il traferro e nel serbatoio, agitare i perline magnetiche, disponendo il dispositivo sopra la parte superiore del magnete e ruotare per rilasciare il liquido che viene intrappolato all'interno del cluster. Continuare agitazione delle sfere magnetiche fino omogeneizzazione del serbatoio è statacompletato (~ 30-45 sec).
4. Posizionare dispositivo sopra la parte superiore del magnete in modo che le sfere magnetiche nel serbatoio tutti segregano ad una zona. Trasferire il cluster tallone magnetico di nuovo alla camera di prova.
5. Una volta che il cluster raggiunge la camera di prova, agitare i perline magnetiche, disponendo il dispositivo sopra la parte superiore del magnete e ruotare per rilasciare il liquido fluorescente intrappolato all'interno. Continua l'agitazione delle sfere magnetiche fino omogeneizzazione della camera di prova è stato completato (~ 30-45 sec).
6. Prendere misure di intensità di fluorescenza sia della camera di prova e il serbatoio utilizzando il microscopio invertito. Registra misurazioni nel foglio di calcolo dei dati.
7. Passi 3,2-3,6 si ripetono fino a quando entrambi i segmenti liquidi convergono per intensità di fluorescenza simili (~ 100 cicli).

4. Analisi Numerica dei dati fluorescente

1. Con i dati di intensità fluorescenti memorizzati in un foglio di calcolo, eseguire l'analisi numerica con MATLAB.
2. Derive le equazioni per calcolare un valore teorico di intensità di fluorescenza sia nel serbatoio e camera di prova. Incorporare le seguenti equazioni in un file di script di MATLAB:
   dove I è l'intensità di fluorescenza (AU), V è il volume (ml), n è il numero di trasferimenti, R è il serbatoio, T è la camera di prova, e C è riporto.
3. Utilizzando MATLAB, generare grafici e analizzare per determinare il volume di riporto per tutti gli esperimenti. Utilizzare questi dati per produrre Figura 2.

5. Preparazione di setup sperimentale per gli esperimenti tensioattivi

1. Preparazione del dispositivo tubi.
   1. Inserire un luer lock femmina su un'estremità del tubo.
   2. Mettere la provetta a una siringa Luer-lock.
   3. Posizionare la siringa nella pompa a siringa e impostare la velocità di alimentazione a 2 ml / hr.
   4. Per l'inserimento preciso di liquidi nel tubo, utilizzare la pompa a siringa per aspirare la soluzione contenente le perline magnetiche e surfactant.
   5. Inserire soluzione tallone 20 microlitri magnetica nel tubo con ritiro pompa a siringa. Questo segmento liquido viene indicato come camera di prova (volume della camera di test può variare a seconda dell'esperimento). Agitare il contenitore con la soluzione perla magnetica a mano durante il ciclo di recesso per formare dispersioni MB uniformi.
   6. Conclusa camera di prova inserimento liquido, prelevare 6 microlitri di aria nel tubo. Sarà successivamente indicato Questo volume d'aria come il traferro.
   7. Dopo l'inserimento traferro è completato, inizierà il ritiro di 180 ml di puro tensioattivo C12E5. Questo sarà successivamente indicato come il serbatoio.
2. Configurazione ottica per esperimenti tensioattivi.
   1. Spostare pompa a siringa con dispositivo tubi in modo che la camera di prova con sfere magnetiche è a fuoco con il microscopio stereo.
   2. Posizionare un foglio di pellicola polarizzatore sulla cima di una sorgente luminosa a LED. Far scorrere la sorgente luminosa a LED sotto il tubo collegato ala pompa a siringa.
   3. Attaccare un altro film polarizzatore alla lente del microscopio stereo con nastro. Assicurarsi che i due film polarizzatore hanno uno scostamento tra loro di 90 gradi.
   4. Montare un CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) della fotocamera per microscopio stereo. Collegare la fotocamera al computer e aprire il software di imaging.

Procedura sperimentale 6. per gli esperimenti tensioattivi

1. Posizionare il cubo magnetico vicino alla camera di prova, mentre il magnete è montato su un supporto.
2. Una volta che le sfere magnetiche formano un cluster, iniziare il pompaggio di liquidi nel tubo con l'avanzamento di 2 ml / hr tale che il cluster tallone magnetico viene spostato dalla camera di prova, attraverso il traferro, e nella camera di serbatoio tensioattivo.
3. Una volta che il cluster tallone magnetico raggiunge il punto medio della camera serbatoio, arrestare il pompaggio della pompa a siringa.
4. Spostare il cubo magnetico lontano dal tubo, consentendo perline magnetiche per separare unnd ridurre il tempo di diffusione del liquido intrappolato nel cluster tallone magnetica.
5. Guarda lo schermo del computer per osservare _l'H 2 O / C12E5 ciclo miscela attraverso diverse fasi.
6. Una volta che il cambiamento di diffusione e di fase del liquido viene completato, posizionare il magnete al suo precedente destinazione dal serbatoio in modo che le sfere magnetiche formano in un cluster.
7. Utilizzando la pompa siringa, aspirare i liquidi in modo che il cluster tallone magnetico viene trasferita dal serbatoio tensioattivo, attraverso il traferro, e di nuovo nel H ₂ O camera di prova.
8. Una volta che il cluster tallone magnetico raggiunge il punto medio della camera di prova, arrestare il pompaggio della pompa a siringa.
9. Spostare il cubo magnetico lontano dal tubo. Questo permetterà sfere magnetiche di separare e contribuirà a ridurre il tempo di diffusione del liquido intrappolato nel cluster tallone magnetica.
10. Guarda lo schermo del computer per osservare _l'H 2 O / C12E5 ciclo miscela attraverso diverse fasi.
11. Una volta che il cambiamento di diffusione e di fase del liquido viene completato, posizionare il magnete al suo precedente destinazione dalla camera di prova in modo che le sfere magnetiche formano in un cluster.
12. Ripetere i passaggi 6,2-6,11 fino alla camera di prova mostra un cambiamento di fase.

Risultati

Utilizzando l'approccio Lab-in-tubo per il trasporto importi microlitri volume di liquido con perline magnetiche con MATLAB per l'analisi numerica volumi medi riporto liquido, in funzione della massa del branello magnetico, sono stati trovati (Figura 2). Maggiore massa di sfere magnetiche fornisce un volume più alto riporto del tasso di 2-3 ml / mg. Il setup sperimentale (Figura 1) è stato utilizzato per osservare il cambiamento di fase del gruppo H _{2 O} / sistema bi...

Discussione

In più comuni tecniche di indagine diagramma di fase, campioni multipli di varia composizione e rapporti devono essere preparati e devono raggiungere l'equilibrio termodinamico che provoca un processo lungo e una notevole quantità di materiale. Alcune sfide possono essere risolti DIT metodo (trasporto interfacciale diffusiva) con capillare piano e il metodo di analisi a raggi infrarossi, ma nessuno di loro in grado di risolvere tutte le sfide con un investimento a basso costo.

La possi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetic beads
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymer solution
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescent dye
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Female
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Male
Syringe	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Syringe Pump	Stoelting	53130
Stereo Microscope	Nikon	SMZ-2T
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	The filter cube used had an excitation wavelength range from 540-580 nm and a dichroic mirror at 585 nm, allowing for photoemission ranging from 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Microscope-Mounted Camera	Motic	5000