שלב תרשים אפיון באמצעות חרוזים מגנטיים כדיסקים נוזליים

Summary

Here, we present a protocol to investigate multi-component phase diagrams using externally controlled magnetic beads as liquid carriers in a lab-in-tube approach. This approach can aid in applications that seek to gather further information on phase change in complex liquid systems.

Abstract

חרוזים מגנטיים עם ~ 1.9 מיקרומטר קוטר ממוצע שמשו להובלת כרכי microliter של נוזלים בין מגזרי נוזל רציפים עם צינור לצורך חקירת שינוי שלב של מגזרים אלה נוזליים. חרוזים המגנטיים חיצוניים נשלטו באמצעות מגנט, המאפשרים לחרוזים לגשר על שסתום האוויר בין מגזרי נוזל הסמוכים. ציפוי הידרופובי היה מוחל על המשטח הפנימי של הצינור על מנת לשפר את ההפרדה בין שני מגזרים נוזליים. השדה המגנטי נוצר מיושם אשכול כולל של חרוזים מגנטיים, לכידת כמות נוזל מסוימת בתוך האשכול שנקרא לשאת על נפח. צבע ניאון התווסף למגזר נוזל אחד, ואחריו סדרה של העברות נוזליים, אשר לאחר מכן שינו את עוצמת הקרינה במגזר הנוזל השכן. בהתבסס על הניתוח המספרי של שינוי עוצמת הקרינה שנמדד, לשאת על הנפח למסה של חרוזים מגנטיים כבר מצאלהיות ~ 2 עד 3 μl / מ"ג. כמות קטנה של נוזל זה מותר לשימוש במקטעי נוזל קטנים יחסית של כמה מאה מיקרוליטר, שיפור ההיתכנות של המכשיר לגישת מעבדה בצינור. טכניקה זו של החלת וריאציה הלחנה קטנה בנפח נוזל הייתה מוחלת על ניתוח תרשים שלב ינארי בין מים והחומרים פעילי השטח C12E5 (אתר monododecyl גליקול pentaethylene), שהוביל לניתוח מהיר יותר עם כרכי מדגם קטנים יותר מאשר בשיטות מקובלות.

Introduction

חרוזים מגנטיים (MBS) בסדר הגודל של מיקרומטר 1 בקוטר שימשו ^1,2 לעתים קרובות ביישומים מבוססי מייקרו-נוזליים, במיוחד עבור התקנים ביו-רפואיים. במכשירים אלה, מ"ב הציעו יכולות כגון תא והפרדת חומצות גרעין, חומרי ניגוד, ומשלוח סמים, עד כמה שם. השילוב של בקרה חיצונית (שדה מגנטי) ומיקרופלואידיקה מבוססת אגל אפשר ³ שליטה של immunoassays באמצעות כמויות קטנות (<100 NL). גם מ"ב הראו הבטחה בעת שימוש לנוזל טיפול ^4. גישה זו משתמשת במ"ב להעביר מולקולות ביולוגיות בין מגזרי נוזל בתוך צינור מופרד על ידי שסתום אוויר. שיטה זו היא לא חזקה כמו מכשירים מורכבים יותר אחרים מעבדה-על-שבב ראו בעבר, אבל זה הרבה יותר פשוט ואין להציע את היכולת של טיפול כרכי microliter בגודל של נוזל. גישה דומה דווחה לאחרונה על ידי הקבוצה של ⁵ Haselton ולהחיל ביו-רפואימבחני.

אחד ההיבטים החשובים ביותר של המכשיר הזה הוא הפרדת המקטע הנוזלית המוצעת על ידי שסתום האוויר המבוקר-פני השטח-מתח. כרכי microliter של נוזל המצורף למ"ב מועברים דרך אוויר פער זה בין מגזרים נוזליים באמצעות שדה מגנטי חיצוני. מ"ב microparticle (מ~ .4-7 מיקרומטר בקוטר עם ממוצע של 1.9 מיקרומטר) תחת ההשפעה של השדה המגנטי החיצוני ליצור אשכול מיקרו-נקבובי שלוכד את נוזל בתוך. כוחו של מלכוד נוזל זה הוא מספיק כדי לעמוד בכוחות של מתח פנים בעת הובלת מ"ב ממאגר אחד למשנהו. בדרך כלל, השפעה זו אינה רצויה, כמו רוב הגישות רוצה תחבורה של מולקולות ספציפיות (כגון סמנים ביולוגיים) בתוך הנוזלים ⁶ בלבד. עם זאת, כפי שניתן לראות בעבודה שלנו, השפעה זו יכולה להיות מנוצלת כדי להפוך להיבט חיובי של המכשיר.

יש לנו מנוצלים "מעבדה בצינור זה"גישה, מוצגת באופן סכמטי באיור 1, לניתוח דיאגרמות שלב במערכות חומרים בינארי. פעילי שטח C12E5 נבחר כמוקד העיקרי של אפיון, כפי שהוא בשימוש נרחב ביישומים תעשייתיים כגון תרופות, מוצרי מזון, קוסמטיקה, וכו 'בפרט, ₂ מערכת בינארית H O / C12E5 נחקרה משום שהוא מספק עשיר סט של שלבים לחקור. יש לנו התמקדתי בהיבט מסוים אחד של תערובת כימית זו, כלומר המעברים לשלבי גבישים נוזליים תחת ריכוזים מסוימים ^7-9. מעבר זה נצפה בקלות במכשיר שלנו על ידי שילוב מקטבים במחקרי מיקרוסקופיה האופטיים על מנת להדגיש את גבולות שלב.

היכולת למפות דיאגרמות שלב היא אזור חשוב מאוד של מחקר כדי להבין קינטיקה מעורבת עם שלב מעבר ^10. היכולת לקבוע את האינטראקציה של חומרים פעילי שטח עם ממסים בדיוקND רכיבים אחרים הוא חיוניים בשל מורכבותם ושלבים ברורים רבים ^11. טכניקות רבות אחרות בעבר שימשו לאפיין שינוי שלב. הגישה המקובלת כרוכה בביצוע דגימות רבות, כל אחד בהיקף של ריכוזים שונים ומאפשר להם לאזן, אשר דורשת פעמים עיבוד ממושכות וכמות גבוהה של כרכי מדגם. ואז, דגימות מנותחות בדרך כלל על ידי שיטות אופטיות כגון תחבורת diffusive interfacial (DIT), המציעה רזולוציה גבוהה של יצירות פעילי שטח כגון ^12,13. בדומה לשיטה שנוצלנו, שיטת DIT משתמשת באור מקוטב לגבולות שלב מובחנים תמונה.

Protocol

1. הכנת חד-פעמי להשתמש בחומרים במכשיר

1. הכנת הצינור
   1. חותך צינורות לתוך 15 מגזרי סנטימטר. יש צינורות 1.6 מ"מ קוטר פנימי 3.2 מ"מ וקוטר חיצוני.
   2. מגזרי צינור לתלות אנכי באמצעות קלטת. מניחים מגבת נייר מתחת צינורות כדי לאסוף את פתרון fluoropolymer העודף.
   3. הזרק של פתרון fluoropolymer 100 μl לפתיחה עליונה של כל מגזר צינור באמצעות מזרק, כך שזה יבוא במגע עם היקף שלם על-הפנימי הקיר.
   4. לאפשר מגזרי צינור לתלות במקום עבור שעה 1 כדי להסיר סכום עודף של פתרון fluoropolymer.
   5. לנקות את כל פתרון fluoropolymer מצד תחתון של צינור שלא לטפטף החוצה. הסר צינורות מתליית עמדה ולהיפטר מגבות נייר.
   6. מגזרי צינור מקום לתנור ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לחשל את שכבת ציפוי fluoropolymer.
   7. הסר מגזרי צינור מתנור. להשתמש בפינצטה, כמו SEG צינורמפעלים יהיו חמים.
2. הכנת פתרון חרוז מגנטי מדולל
   1. חישוב ריכוז חרוז מגנטי הדרוש כדי להשיג את הרצוי לשאת על הנפח, כפי שנקבע על ידי מערכת היחסים בין לשאת על נפח וMB לראות המוני באיור 2.
      הערה: יש הפתרון המקורי MB 1 גרם של מ"ב ב 50 מיליליטר של תמיסה. בהתחשב מבחן קאמרי נפח של 20 μl, לדלל פתרון MB מקורי עם מים מזוקקים ליחס של 6: 4 (פתרון MB: מים) כדי להשיג לשאת על נפח של 0.4 ~ μl. התאם יחס דילול כאשר שונה לשאת על נפח רצוי.
   2. הנח בקבוקון 20 מיליליטר מדגם על מיקרו-מאזן. אפס האיזון.
   3. להתסיס את מיכל פתרון חרוז המגנטי, אז לסגת 0.6 מיליליטר באמצעות מיקרו-פיפטה.
   4. לוותר פתרון pipetted לתוך בקבוקון המדגם על איזון.
   5. לוותר 0.4 מיליליטר של מים מזוקקים לתוך בקבוקון המדגם.
3. l צבע פלואורסצנטיהכנת מוניטורים LCD
   1. לפזר 2 WT.% מצבע לתוך המים DI ידי vortexing פתרון דקות 1.

2. הכנת ההתקנה הניסיונית לניסויים בקרינה

1. הכנת מכשיר צינורות.
   1. הכנס מחבר luer נעילה נקבה על קצה אחד של הצינור.
   2. מניחים את הצינור לתוך מזרק luer נעילה שיש 3 מיליליטר נפח 0.1 מיליליטר וסיום הלימודים.
   3. מניחים את המזרק לתוך משאבת המזרק ולקבוע את שיעור העדכון של 2 מיליליטר / שעה.
   4. להחדרה מדויקת של נוזלים לתוך צינורות, להשתמש במשאבת המזרק למשוך את התמיסה המכילה חרוזים מגנטיים וצבע ניאון.
   5. הכנס 20 μl של פתרון חרוז מגנטי לתוך צינור באמצעות נסיגת משאבת מזרק. קטע נוזל זה נקרא חדר בדיקה (בדיקת תא הנפח יכול להשתנות בהתאם לניסוי). מערבולת המכל עם פתרון חרוז מגנטי דקות 1 ולאחר מכן להתסיס ביד במהלך מחזור הנסיגה ליצירת תפוצות MB אחידים.
   6. לאחר הכניסה נוזל תא הבדיקה הגיעה למסקנה, לסגת 6 μl של אוויר לתוך הצינור. נפח זה של אוויר יהיה מאוחר יותר ליצור שסתום בין שני המגזרים נוזליים.
   7. לאחר הכניסה פער האוויר הושלמה, מתחיל נסיגה 180 μl של נוזל בצבע ניאון. קטע נוזל זה נקרא המאגר. מאגר נפח יכול להשתנות בהתאם לניסוי. נפח מאגר גדול יותר מועיל כדי למזער את השינוי של ריכוז צבע.
   8. הנח מחבר luer נעילה נקבה שני על הקצה השני של הצינור.
   9. הסר את התקן הצינור מהמזרק.
   10. מניחים כובעי Luer נעילה בשני הקצוות של המכשיר.
2. התקנת אופטיקה לניסויי הקרינה
   1. הפעל את כל הרכיבים המחוברים למיקרוסקופ ההפוך.
   2. הפעל את המחשב ולפתוח את תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ.

"> 3. נוהל ניסיון לניסויים בקרינה

1. קח מדידת עוצמת הקרינה ראשונית של חדר בדיקה ומאגר באמצעות מיקרוסקופ ההפוכה. כאשר מנתח את הקרינה של המדגם, להבטיח כי המוקד הוא בעמדת המרכז (בשני כיווני x ו- y) של מגזר הנוזל בתוך הצינור. שיא מדידות בגיליון אלקטרוני נתונים.
2. מניחים את מכשיר על גבי מגנט קובייה כך שכל חרוזים המגנטיים להפריד לאזור אחד בחדר הבדיקה. העבר את החרוזים למאגר על ידי הזזת המכשיר על גבי המגנט (~ 10 שניות). מגנט ניאודימיום קוביית 1 אינץ 'הוא הכיתה N48 עם כוח משיכה של 45.6 קילוגרם.
3. ברגע שאשכול חרוז מגנטי מועבר דרך פער האוויר ולתוך המאגר, להתסיס את חרוזים המגנטיים על ידי הנחת המכשיר על גבי המגנט ומסתובב כדי לשחרר את הנוזל שלכוד בתוך האשכול. המשך תסיסה של חרוזים המגנטיים עד הומוגניות של המאגר הייתההושלם (~ 30-45 שניות).
4. מניחים את מכשיר על גבי מגנט כך שהחרוזים המגנטיים במאגר כל להפריד לאזור אחד. העבר את אשכול חרוז המגנטי חזרה לחדר הבדיקה.
5. ברגע שמגיע לאשכול חדר הבדיקה, להתסיס את חרוזים המגנטיים על ידי הנחת המכשיר על גבי המגנט ומסתובב כדי לשחרר את נוזל הניאון לכוד בתוך. המשך תסיסה של חרוזים המגנטיים עד הומוגניות של חדר הבדיקה הושלמה (~ 30-45 שניות).
6. קח מדידות עוצמת הקרינה של שניהם חדר הבדיקה ומאגר באמצעות מיקרוסקופ ההפוכה. שיא מדידות בגיליון אלקטרוני נתונים.
7. צעדים 3.2-3.6 חוזרים עד ששני מגזרי הנוזל להתכנס לעוצמות הקרינה דומות (~ 100 מחזורים).

4. אנליזה נומרית של נתונים פלורסנט

1. נתוני עוצמת ניאון עם מאוחסנים לתוך גיליון אלקטרוני, לבצע אנליזה נומרית באמצעות MATLAB.
2. Derivמשוואות דואר לחשב שווי תיאורטי של עוצמת הקרינה בשני המאגרים וחדר בדיקה. לשלב את המשוואות לקובץ תסריט MATLAB הבאות:
   שבו אני הוא את עוצמת הקרינה (AU), V הוא נפח (μl), n הוא מספר ההעברות, R הוא המאגר, T הוא חדר הבדיקה, ו- C הוא לשאת מעל.
3. באמצעות MATLAB, ליצור חלקות ולנתח כדי לקבוע לשאת על הנפח לכל הניסויים. להשתמש בנתונים אלה כדי לייצר איור 2.

5. הכנת ההתקנה הניסיונית לניסויים פעילים שטח

1. הכנת מכשיר צינורות.
   1. הכנס Luer נעילת נקבה על קצה אחד של הצינור.
   2. מניחים את הצינור לתוך מזרק luer נעילה.
   3. מניחים את המזרק לתוך משאבת המזרק ולקבוע את שיעור העדכון של 2 מיליליטר / שעה.
   4. להחדרה מדויקת של נוזלים לתוך צינורות, להשתמש במשאבת המזרק למשוך את התמיסה המכילה חרוזים המגנטיים וsurfactant.
   5. הכנס פתרון חרוז 20 μl מגנטי לתוך צינור באמצעות נסיגת משאבת מזרק. קטע נוזל זה נקרא חדר בדיקה (בדיקת תא הנפח יכול להשתנות בהתאם לניסוי). להתסיס את המכל עם פתרון חרוז מגנטי ביד במהלך מחזור הנסיגה ליצירת תפוצות MB אחידים.
   6. לאחר הכניסה נוזל תא הבדיקה הגיעה למסקנה, לסגת 6 μl של אוויר לתוך הצינור. נפח זה של אוויר יהיה מאוחר יותר ייקרא פער האוויר.
   7. לאחר הכניסה פער האוויר הושלמה, מתחיל נסיגה 180 μl של שטח C12E5 הטהור. זה יהיה מאוחר יותר ייקרא המאגר.
2. התקנת אופטיקה לניסויי שטח.
   1. הזז משאבת מזרק עם מכשיר צינורות כך שחדר הבדיקה עם חרוזים מגנטיים הוא בפוקוס עם מיקרוסקופ סטריאו.
   2. הנח גיליון של סרט מקטב על גבי מקור אור LED. חלק את מקור אור LED מתחת לצינור המחובר למשאבת המזרק.
   3. צרף אחר סרט מקטב לעדשה של מיקרוסקופ סטריאו באמצעות קלטת. הקפד ששני סרטי המקטב יש תואר 90 לקזז אחד מהשני.
   4. הר CCD (התקן מצמידים תשלום) מצלמה למיקרוסקופ סטריאו. חבר את המצלמה למחשב ולפתוח את תוכנת ההדמיה.

6. נוהל ניסיון לניסויים פעילים שטח

1. הנח את מגנט הקובייה ליד חדר הבדיקה ואילו המגנט הוא רכוב על דוכן.
2. ברגע שהחרוזים המגנטיים יוצרים אשכול, להתחיל שאיבת נוזלים בצינור בשיעור של 2 מיליליטר / שעה ההזנה כך שאשכול חרוז המגנטי מועבר מחדר הבדיקה, על פני פער האוויר, ולתוך תא המאגר פעילי שטח.
3. ברגע שאשכול חרוז המגנטי מגיע לנקודת האמצע של תא המאגר, להפסיק את השאיבה במשאבת המזרק.
4. הזז את מגנט הקובייה מהצינור, המאפשר לחרוזים מגנטיים להפרידND לצמצם את זמן דיפוזיה של נוזלי לכודים באשכול חרוז המגנטי.
5. צפה במסך המחשב כדי לצפות בH ₂ O / מחזור תערובת C12E5 דרך שלבים שונים.
6. ברגע ששינוי דיפוזיה והשלב של הנוזל הושלם, למקם את המגנט חזרה ליעד לשעבר במאגר כך חרוזים המגנטיים יוצרים לאשכול.
7. באמצעות משאבת המזרק, למשוך את הנוזלים כך שאשכול חרוז המגנטי מועבר מהמאגר פעילי השטח, על פני פער האוויר, ובחזרה לחדר בדיקת ₂ O H.
8. ברגע שאשכול חרוז המגנטי מגיע לנקודת האמצע של חדר הבדיקה, להפסיק את השאיבה במשאבת המזרק.
9. הזז את מגנט הקובייה מהצינור. זה יאפשר חרוזים מגנטיים להפריד ויעזור לצמצם את זמן דיפוזיה של נוזלי לכודים באשכול חרוז המגנטי.
10. צפה במסך המחשב כדי לצפות בH ₂ O / מחזור תערובת C12E5 דרך שלבים שונים.
11. ברגע ששינוי דיפוזיה והשלב של הנוזל הושלם, למקם את המגנט חזרה ליעד לשעבר שלה על ידי תא הבדיקה כדי חרוזים המגנטיים יוצרים לאשכול.
12. חזור על שלבים 6.2-6.11 עד חדר הבדיקה מציג שינוי שלב.

תוצאות

שימוש בגישה Lab-ב- טיוב להובלת כמויות μl בנפח של נוזל עם חרוזים מגנטיים יחד עם MATLAB לאנליזה נומרית, כרכים לשאת על נוזל ממוצע, כפונקציה של מסת חרוז מגנטית, נמצאו (איור 2). מסה גבוהה יותר של חרוזים מגנטיים מספקת גבוה יותר לשאת על נפח בשיעור 2-3 μl / מ"ג. הגדרת הניסוי

Discussion

בטכניקות הנפוצות ביותר לחקירת תרשים שלב, דוגמאות רבות עם יצירות ויחסים שונים צריכים להיות מוכנות וצריך להגיע לשיווי משקל תרמודינמי שגורם תהליך ארוך וכמות משמעותית של חומר. ניתן לפתור אתגרים מסוימים על ידי DIT שיטה (תחבורת interfacial diffusive) באמצעות נימים שטוחות ושיטת ניתוח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetic beads
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymer solution
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescent dye
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Female
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Male
Syringe	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Syringe Pump	Stoelting	53130
Stereo Microscope	Nikon	SMZ-2T
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	The filter cube used had an excitation wavelength range from 540-580 nm and a dichroic mirror at 585 nm, allowing for photoemission ranging from 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Microscope-Mounted Camera	Motic	5000