相図の特徴付け液体担体として磁気ビーズを使用しました

要約

Here, we present a protocol to investigate multi-component phase diagrams using externally controlled magnetic beads as liquid carriers in a lab-in-tube approach. This approach can aid in applications that seek to gather further information on phase change in complex liquid systems.

要約

〜1.9μmの平均直径を有する磁性ビーズは、これらの液体のセグメントの位相変化を調査する目的で、チューブに隣接液体セグメント間の液体のマイクロリットル容量を輸送するために使用されました。磁気ビーズは、ビーズの外部に隣接液体セグメント間の空気バルブを埋めることを可能にする、磁石を用いて制御しました。疎水性コーティングは、二つの液体のセグメントの間の分離を強化するために、管の内面に塗布しました。印加磁場は、キャリーオーバー量と呼ばれ、クラスタ内の特定の液体の量を捕捉、磁気ビーズの集合体クラスターを形成しました。蛍光染料は、その後、隣接する液体のセグメント内の蛍光強度を変更し、液体の転送、一連の続いて、一つの液体部分に添加しました。測定された蛍​​光強度変化の数値解析に基づいて、磁気ビーズの質量あたりのキャリーオーバーの量が判明しています〜2〜3μL/ mgであることを。この液体の少量は、ラボ・イン・チューブアプローチするための装置の実現可能性を高め、数百マイクロリットルの比較的少量の液体セグメントの使用を可能にしました。液体体積の小さな組成変動を適用するこの技術は、水と界面活性剤C12E5（ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル）との二元状態図を分析する従来の方法よりも少ない試料容量で迅速分析に至るまで適用しました。

概要

直径1マイクロメートル程度の磁気ビーズ（MBS）は、特に生物医学装置のため、マイクロ流体ベースのアプリケーションでかなり頻繁に^1,2を使用されています。これらのデバイスでは、MBは​​、いくつか例を挙げると、そのような細胞および核酸分離、造影剤、および薬物送達などの機能を提供しています。外部（磁場）の制御および液滴ベースのマイクロフルイディクスの組み合わせは、少量（<100 NL）を使用したイムノアッセイの^{3コントロール}を可能にしました。液体^{4を処理するために}使用される場合、MBはまた、有望であることが示されました。このアプローチは、空気弁で​​区切られたチューブ内の液体セグメント間の生体分子を輸送するためにMBを使用しています。この方法は、過去に見られる他のより複雑なラボオンチップデバイスほど強力ではありませんが、それははるかに簡単ですし、液体のマイクロリットルサイズのボリュームを処理する能力を提供しません。同様のアプローチは、最近Haseltonのグループによって報告された⁵および生物医学に応用されていますアッセイ。

この装置の最も重要な側面の一つは、表面張力制御空気弁によって提供される液体のセグメントの分離です。あるMBに接続されている液体のマイクロリットルの容積は、外部印加磁場を使用して液体のセグメント間のこのエアギャップを介して輸送されます。外部磁界の影響下（1.9ミクロンの平均は直径〜0.4から7ミクロンから）微粒子のMBは内の液体をトラップする微細多孔クラスタを作成します。この液体閉じ込めの強さは、次の1つのリザーバからのMBを輸送する際に表面張力の力に耐えるのに十分です。ほとんどのアプローチは、液体のみ⁶内に含まれる（例えば、バイオマーカーとしての）特定の分子の輸送を必要として、典型的には、この効果は、望ましくありません。しかし、私たちの仕事に見られるように、この効果は、デバイスの正の側面となるために利用することができます。

私たちは、この「ラボ・イン・チューブを利用してきました二元材料系に相図を分析するために、 図1に概略的に示される」アプローチ。それはリッチを提供するので、それは広くなど特に医薬品、食品、化粧品などの産業用途で使用される界面活性剤C12E5は、特性の主な焦点として選択されている、H _{2 O} / C12E5二元系を調べました探索するフェーズのセット。我々は、この化学物質の混合物の特定の一態様によれば、ある濃度^7-9で液体結晶相に、すなわち遷移に焦点を当てています。この遷移は、容易に相境界を強調するために、光学顕微鏡研究において偏光板を組み込むことによって、我々の装置で観察されます。

相図をマッピングできることは、相転移¹⁰に関わる動力学を理解するために研究の非常に重要な分野です。正確に溶剤Aと界面活性剤との相互作用を決定する能力ND他のコンポーネントは、それらの複雑さと、多くの異なるフェーズ¹¹に非常に重要です。多くの他の技術は、以前に相変化を特徴づけるために使用されています。従来の手法は、それぞれ異なる濃度からなる、それらは長い処理時間とサンプル量の高い量を必要とする、平衡化することができ、多くのサンプルを作ることを含みます。その後、サンプルは、典型的には、そのような界面活性剤組成物^12,13の高解像度を提供し、拡散界面輸送（DIT）、などの光学的方法により分析されます。私たちが利用している方法と同様に、DITの方法は、画像の異なる位相境界に偏光を使用しています。

プロトコル

デバイスでワンタイム関連材料の作製

1. チューブの準備
   1. 15cmのセグメントにチューブカット。チューブは1.6mmで、内径3.2 mmの外径を有します。
   2. ハングチューブセグメントは、垂直方向にテープを使用。過剰フッ素ポリマー液を収集するために、チューブの下に紙タオルを置きます。
   3. それは内壁に全周に接触するように、注射器を用いて、各管セグメントの上部開口部に、フルオロポリマー溶液100μlを注入します。
   4. チューブセグメントは、フルオロポリマー溶液を過剰量を除去するために、1時間の場所にハングアップすることができます。
   5. 滴り落ちなかったチューブの底側から任意のフルオロポリマーソリューションを清掃してください。位置をぶら下げからチューブを外し、ペーパータオルを処分。
   6. 1時間100℃のオーブン中に置き、チューブセグメントは、フルオロポリマーコーティング層をアニールします。
   7. オーブンからチューブセグメントを削除します。チューブワンセグとして、ピンセットを使用してくださいメントが熱くなります。
2. 希薄磁性ビーズ溶液の調製
   1. 質量図2に示されるキャリーオーバー量とMBとの間の関係によって決定されるように、所望のキャリーオーバー量を達成するために必要な磁気ビーズの濃度を計算します。
      注：元のMB溶液は、溶液の50ml中のMB 1gを有しています。 20μLの試験室の容積を考慮すると、6の比率を蒸留水で元のMBの溶液を希釈：〜0.4μLのキャリーオーバーの量を得るために：4（水MB溶液）。別のキャリーオーバー量が所望される場合に希釈率を調整します。
   2. マイクロバランスの上に20ミリリットルサンプルバイアルを置きます。バランスをゼロ。
   3. マイクロピペットを用いて0.6ミリリットルを撤回その後、磁気ビーズ液容器を攪拌します。
   4. バランスのサンプルバイアル中にピペットで解決策を分注します。
   5. サンプルバイアルに蒸留水を0.4ミリリットルを分注します。
3. 蛍光色素Liquid準備
   1. 1分間のソリューションをボルテックスすることによってDI水への色素の2重量％に溶解します。

蛍光実験のための実験のセットアップの調製

1. チュービング装置の作製。
   1. チューブの一端にメスルアーロックコネクタを挿入します。
   2. 3ミリリットルの容量と0.1ミリリットルの卒業を持つルアーロックシリンジにチューブを置きます。
   3. シリンジポンプにシリンジを配置し、2ミリリットル/時間で送り速度を設定します。
   4. チューブへの液体の正確な挿入のために、磁気ビーズ、蛍光色素を含む溶液を撤回するシリンジポンプを使用しています。
   5. シリンジポンプ撤退を使用してチューブ内に磁気ビーズ溶液20μlを挿入します。この液体セグメントは、テストチャンバ（テストチャンバ容積は、実験に応じて変えることができる）と呼ばれています。 1分間磁気ビーズ溶液の入った容器をボルテックスした後、中に手でかき混ぜます離脱サイクルは、均一なMB分散液を形成します。
   6. 試験室の液体挿入が終了した後、チューブに空気の6μLを引き出します。この空気の量は、後の二つの液セグメント間における弁を形成することになります。
   7. エアギャップの挿入が完了した後、蛍光色素で液体の回収180μLを始めます。この液体セグメントは、リザーバと呼ばれます。リザーバ容量は、実験に応じて変えることができます。より大きなリザーバ容量は、染料濃度の変化を最小限にすることが有益です。
   8. チューブのもう一方の端に二メスルアーロックコネクタを配置します。
   9. 注射器からチューブデバイスを削除します。
   10. デバイスの両端にルアーロックキャップを配置します。
2. 蛍光実験のための光学のセットアップ
   1. 倒立顕微鏡に接続されているすべてのコンポーネントの電源をオンにします。
   2. コンピュータの電源を入れ、顕微鏡イメージングソフトウェアを開きます。

蛍光実験のための "> 3。実験手順

1. 倒立顕微鏡を用いて試験室とリザーバの初期蛍光強度の測定を行います。サンプルの蛍光を分析する場合、フォーカスは、チューブ内の液体のセグメントの（x、y方向の両方で）中央の位置にあることを確認してください。データスプレッドシートに記録し測定。
2. 磁気ビーズ全てが試験チャンバー内の1つの領域に分離するような立方体磁石の上にデバイスを配置します。マグネット（〜10秒）の上に装置を移動させることにより、容器にビーズを転送します。 1インチネオジムキューブ磁石は45.6キロの引っ張り力でグレードN48です。
3. 磁気ビーズクラスタは、エアギャップを通ってリザーバ内に転送されると、磁石の上にデバイスを配置し、クラスタ内に捕捉された液体を放出するために回転させて磁気ビーズを撹拌します。貯水池の均質化がされるまで磁気ビーズの撹拌を続行完成した（〜30〜45秒）。
4. 磁石容器内の磁気ビーズをすべて1つの領域に分離するようなの上にデバイスを配置します。試験室に戻って磁気ビーズクラスタを転送します。
5. クラスタは、試験室に到達すると、磁石の上にデバイスを配置し、内に閉じ込められた蛍光の液体を放出するために回転させて磁気ビーズを撹拌します。試験室の均質化が完了するまで磁気ビーズの撹拌を継続する（〜30〜45秒）。
6. 倒立顕微鏡を用いて、試験室とリザーバの両方の蛍光強度の測定を行います。データスプレッドシートに記録し測定。
7. 両方の液体のセグメントが類似の蛍光強度（〜100サイクル）に収束するまで、ステップ3.2から3.6までを繰り返します。

蛍光データの4数値解析

1. スプレッドシートに保存された蛍光強度のデータでは、MATLABを用いた数値解析を行います。
2. DERIVeは、式リザーバと試験室の両方での蛍光強度の理論値を算出します。 MATLABスクリプトファイルに次の式を組み込みます：
   Iは、蛍光強度（AU）であり、Vは体積（μL）であり、nは転送の数であり、Rはリザーバーで、Tは、試験室であり、Cは、キャリーオーバーです。
3. MATLABを使用して、プロットを生成し、すべての実験のためのキャリーオーバーの量を決定するために分析します。 図2を生成するためにこのデータを使用してください。

界面活性剤の実験のための実験のセットアップの準備5。

1. チュービング装置の作製。
   1. チューブの一端にメスルアーロックを挿入します。
   2. ルアーロックシリンジにチューブを置きます。
   3. シリンジポンプにシリンジを配置し、2ミリリットル/時間で送り速度を設定します。
   4. チューブへの液体の正確な挿入のために、磁気ビーズおよびSUを含む溶液を撤回するシリンジポンプを使用rfactant。
   5. シリンジポンプ撤退を使用してチューブに20μlの磁気ビーズ溶液を挿入します。この液体セグメントは、テストチャンバ（テストチャンバ容積は、実験に応じて変えることができる）と呼ばれています。均一なMB分散液を形成するために離脱サイクル中に手で磁気ビーズ溶液で容器を攪拌します。
   6. 試験室の液体挿入が終了した後、チューブに空気の6μLを引き出します。この空気の量は、後にエアギャップと呼ぶことにします。
   7. エアギャップの挿入が完了した後、純粋なC12E5界面活性剤の離脱180μLを始めます。これは、後に、リザーバと呼ぶことにします。
2. 界面活性剤の実験のための光学のセットアップ。
   1. 磁気ビーズと試験室は、ステレオ顕微鏡の焦点にあるようにチューブ装置を、シリンジポンプを動かします。
   2. LED光源の上に偏光フィルムのシートを配置します。に接続されているチューブの下にLED光源をスライドさせシリンジポンプ。
   3. テープを使用して、実体顕微鏡のレンズに別の偏光フィルムを取り付けます。 2偏光フィルムが互いにオフセット90度を持っていることを確認してください。
   4. ステレオ顕微鏡にCCD（電荷結合素子）カメラをマウントします。カメラをパソコンに接続し、イメージングソフトウェアを開きます。

界面活性剤の実験のための実験手順6.

1. 磁石がスタンドに取り付けている間に試験室の隣のキューブ磁石を配置します。
2. 磁気ビーズは、クラスタを形成した後、磁気ビーズクラスタは、エアギャップを横切って、及び界面活性剤の貯留室に、テストチャンバから移動されるように、2ミリリットル/時間の供給速度でチューブ内の液体をポンピング始めます。
3. 磁気ビーズクラスタはリザーバ室の中間点に達すると、シリンジポンプにポンプを停止します。
4. 磁気ビーズを分離することを可能にする、チューブから離れキューブ磁石を移動ND磁気ビーズクラスタに閉じ込められた液体の拡散時間を短縮。
5. 異なる段階を経て、H ₂ O / C12E5混合サイクルを観察するためにコンピュータの画面を見ます。
6. 液体の拡散と相変化が完了すると、磁気ビーズクラスターに形成ので、貯水池によってバック元の宛先への磁石を配置します。
7. シリンジポンプを用いて、磁気ビーズクラスタは、エアギャップを横切って、界面活性剤リザーバから転送され、そのようなことは、液体を引き出すバックH ₂ O、試験室へ。
8. 磁気ビーズクラスタは試験室の中間点に達すると、シリンジポンプにポンプを停止します。
9. 離れてチューブからキューブ磁石を移動します。これは、磁気ビーズを分離することができますし、磁気ビーズクラスタに閉じ込められた液体の拡散時間を減らすのに役立ちます。
10. 異なる段階を経て、H ₂ O / C12E5混合サイクルを観察するためにコンピュータの画面を見ます。
11. 液体の拡散と相変化が完了すると、磁気ビーズクラスターに形成ので、試験室によって元の宛先に戻って磁石を配置します。
12. 試験室は、位相変化が表示されるまで繰り返して、6.2から6.11を繰り返します。

結果

磁気ビーズ質量の関数として、数値解析、平均液体キャリーオーバーボリュームのMATLABと共に磁気ビーズと液体のマイクロリットル容量の量を輸送するためのラボ・イン・チューブのアプローチを使用して、（図2）が見出されました。磁気ビーズの高い質量が2〜3μL/ mgでの割合が高いキャリーオーバーのボリュームを提供します。実験（ 図1）は、H _{2 O} / C12E5...

ディスカッション

相図の調査のための最も一般的な技術では、異なる組成および比率を有する複数のサンプルを調製し、長いプロセスと材料のかなりの量を引き起こす熱力学的平衡に到達する必要があることが必要です。いくつかの課題DITによって解決することができます（拡散界面輸送）方法は、平らな毛細血管および赤外線分析法を用いて、それらのどれも、低コストの投資ですべての問題を解決するこ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuBead	Bioneer Inc.	TS-1010-1	Magnetic beads
C12E5 Surfactant	Sigma-Aldrich	76437
Thermo Scientific Nalgene 890	Fisher Scientific	14176178
Cube Magnet	Apex Magnets	M1CU
Polarizer Film	Edmund Optics	38-493
Teflon AF	Dupont	400s1-100-1	Fluoropolymer solution
Keyacid Red Dye	Keystone	601-001-49	Fluorescent dye
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-12	Female
Luer-Lock	Cole-Parmer	T-45502-56	Male
Syringe	Fisher Scientific	14-823-435	3 ml
Syringe Pump	Stoelting	53130
Stereo Microscope	Nikon	SMZ-2T
Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	The filter cube used had an excitation wavelength range from 540-580 nm and a dichroic mirror at 585 nm, allowing for photoemission ranging from 593-668 nm.
Balance	Denver Instruments	PI-225D
Microscope-Mounted Camera	Motic	5000