النمذجة دماغي من الولادة المبكرة قبل الولادة عن طريق نقص الأكسجة-نقص التروية مع lipopolysaccharide في البينية الذي يحيط بالجنين في الفئران

Summary

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Abstract

التهاب الدماغ الخداج (EOP) هو المصطلح الذي يشمل نظام العصبي المركزي (CNS) التشوهات المرتبطة الولادة المبكرة. ولأفضل الأهداف مسبقا متعدية وكشف استراتيجيات علاجية جديدة لإصابات الدماغ المرتبطة الولادة المبكرة، يجب نماذج ما قبل السريرية من EOP تشمل آليات مماثلة الإصابة العالمية قبل الولادة لوحظ في البشر وإشراك عناصر متعددة من النظام الأم والجنين المشيمة،. من الناحية المثالية، ينبغي أن نماذج تنتج مجموعة مماثلة من عجز وظيفي في الحيوان ناضجة وألخص جوانب متعددة من الفيزيولوجيا المرضية. لتقليد النظامية عيوب الإنسان المشيمة نضح، underperfusion المشيمة و / أو شريوأمنيونيتيس المرتبطة التهاب الناجم عن العوامل المسببة للأمراض في أوائل الولادة قبل الأوان، وضعنا نموذجا للما قبل الولادة عابرة النظامية نقص الأكسجة نقص التروية (TSHI) جنبا إلى جنب مع lipopolysaccharide في داخل الأمنيوسي (LPS). في الحوامل الفئران سبراغ داولي، TSHI عبر الرحم انسداد الشريان سن يوم الجنينية 18 (E18) يؤدي الى خلل underperfusion المشيمة متدرج المرتبطة بزيادة الضرر CNS في الجنين. عندما يقترن حقن LPS البينية الذي يحيط بالجنين، يتم زيادة التهاب المشيمة وتفاقم الضرر CNS مع الأبيض المرتبطة المسألة، مشية والتصوير شذوذ. قبل الولادة TSHI وTSHI + LPS الشتائم قبل الولادة تلبية العديد من المعايير لنموذج EOP بما في ذلك تلخص الإهانة داخل الرحم، مما تسبب في فقدان الخلايا العصبية، الخلايا قليلة التغصن والمحاور، وفقدان subplate، وعجز وظيفي في الحيوانات البالغة التي تحاكي تلك التي لوحظت في الأطفال الذين يولدون للغاية قبل الأوان. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج يسمح للتشريح الالتهاب الناجم عن أنواع الإصابات المختلفة.

Introduction

مع أكثر من 12٪ من الرضع الذين ولدوا في الولايات المتحدة قبل سن 37 أسبوعا يقدر الحمل ^1، إصابات الدماغ فترة ما حول الولادة (PBI) من الخداج هو سببا مهما من أسباب العجز الدائم. PBI من الخداج، اعتلال الدماغ يطلق عليه أيضا من الخداج (EOP)، ويؤثر على الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS). إصابة الجهاز العصبي المركزي غالبا ما يبدأ في الرحم، وتزداد سوءا بسبب عمليات ما قبل الولادة بما في ذلك شريوأمنيونيتيس ومضاعفات ما بعد الولادة مثل نقص الأكسجين وتعفن الدم. PBI من الشتائم النظامية يغير من النمو العصبي ويؤدي إلى الشلل الدماغي، الصرع، التأخر المعرفي والعديد من الاضطرابات العصبية والنفسية التي تؤثر على التنظيم العاطفي والذاكرة وظيفة تنفيذية ^1،2. على الرغم من إحراز تقدم كبير، لا يزال هناك فهم محدود لكيفية العواقب الخلوية والجزيئية من إصابة الجهاز العصبي المركزي من الولادة المبكرة تترجم إلى العديد من عقابيل عصبية في الأطفال الذين يولدون قبل الأوان. هذا النقص في المعرفة هندالمتطلبات البيئية في الوقت الحقيقي تشخيص CNS شدة الإصابة والجرعات علم التدخلات الناشئة. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال الاستراتيجيات العلاجية المناسبة للفئة العمرية لهذه الفئة من السكان المعرضين للخطر المريض بعيد المنال.

التهاب داخل الرحم هو شائع جدا في الخداج الشديد وينطوي على سلسلة التهابات الجنين-الأم والمشيمة معقدة ^3. العدوى داخل الرحم غالبا ما يكون تحت الإكلينيكي. النتائج المشيمة محددة تتفق مع التهاب حاد، أو شريوأمنيونيتيس] نسيجية، هي المحددات الرئيسية للاستجابة التهابية الجنين وهي تتزامن مع إصابات الدماغ المرتبطة الولادة المبكرة ^3-5. والواقع أن الاستجابة الالتهابية الجنين لها آثار إكلينيكية واضحة المعالم لتحقيق نتائج على المدى الطويل من الولادة المبكرة. الرضع الذين صغير بالنسبة لسن الحمل (SGA) أو الذين يعانون من عدوى معرضون بشكل استثنائي إلى عجز عصبي ^3،4. شريوأمنيونيتيس هي الولادة قبل الأوان التشخيص المرضي النموذجية التالية ^{6،7، والفحص النسيجي يكشف عن علامات الالتهاب في 70٪ من مشيمة من مواليد الخدج جدا (4). وعلاوة على ذلك، يرتبط شريوأمنيونيتيس مع الضعف الادراكي في عامين 8. ويرتبط دليل على underperfusion الأوعية الدموية الأمهات في المشيمة من الأطفال الذين يولدون قبل الأوان للغاية أيضا مع الشلل الدماغي في مرحلة الطفولة 9. تأثير التآزر من شريوأمنيونيتيس والمشيمة العيوب نضح ويتضح جيدا من خطر ارتفاع ملحوظ في نتائج عصبية غير طبيعية في هذه الفئة من السكان المريض في الثانية من العمر 10،11.}

لتقليد النظامية عيوب المشيمة نضح الإنسان وشريوأمنيونيتيس المرتبطة الناجم عن العوامل المسببة للأمراض الالتهاب، وضعنا نموذجا للما قبل الولادة عابرة النظامية نقص الأكسجة نقص التروية (TSHI) جنبا إلى جنب مع lipopolysaccharide في داخل الأمنيوسي (LPS) في الفئران. كان هدفنا على التكيف نموذجنا للTSHI وحدها في الفئران ^12-16 لتشمل التهاب داخل الرحم،لتسهيل النمذجة قبل السريرية للإصابة الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الولادة المبكرة. TSHI كشفت وحده الخسارة المستمرة لخلايا النسب oligodendroglial، العصبونات القشرية، وزيادة موت الخلايا، ورفع مستويات خلوى الموالية للالتهابات، مع فترات الدماغية تقدمية مما أدى إلى نمط متدرج الإصابة بما يتفق مع إصابات الدماغ قبل الولادة ^16. وقد أثبتت تعديلات على مكونات الدماغية من هذا النموذج أيضا العجز في ترميز الذاكرة، قصيرة والذاكرة طويلة المدى والتعديلات العضلات والعظام خفيفة في الفئران مع تقدمهم في السن ^17-19. في الواقع، لقد أثبتنا سابقا أن الجمع بين TSHI + LPS يلخص بصمات المرضية من EOP، بما في ذلك دبقية قليلة التغصن وفقدان الخلايا العصبية، والإصابة محور عصبي، التهاب الخلوية والتشوهات الوظيفية ^20.

Protocol

وافق الرعاية المؤسسية واللجان استخدم في مستشفى بوسطن للأطفال على حد سواء وجامعة مركز العلوم الصحية ولاية نيو مكسيكو جميع الإجراءات التجريبية.

ملاحظة: قبل البدء في الإجراء، وختم، وتعقيم الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والستائر الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، تعد الأدوية اللاحقة للعمليات الجراحية في قارورة معقمة بما في ذلك 0.125٪ bipivucaine و 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين. إعداد أيضا حل lipopolysaccharide في (LPS) sterilely: 0.04 ملغ / مل LPS (0111: B4) في المياه المالحة العقيمة التي تحتوي على تمييع صبغة زرقاء ايفان.

1. التخدير

1. حمل التخدير في يوم 18 (E18) حامل الفئران سبراغ داولي الجنينية بمزيج من 3٪ الأيزوفلورين متوازن 70٪ نيتروجين و 30٪ أكسجين.
2. إزالة الفئران من غرفة تحريض ووضع مستلق على الفئران رايات الجراحية بطانية المياه المنتشرة التي حددت في 37 ° C. نقل التخدير لمخروط الأنف وتقليل isofluraمستوى ني إلى 2٪.
3. بلطف تطبيق مرهم للعين إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. أثناء إجراء رصد مستمر في درجة الحرارة ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب من الحيوان. وينبغي أن يظل علم وظائف الأعضاء الأمهات مستقر في جميع أنحاء الداخلي.

2. الجراحية الإعدادية وفرك

1. باستخدام كليبرز الحيوانات الصغيرة إزالة كل الشعر في منطقة البطن السفلى. يحلق في نمط مستطيلة مع الحرص على تجنب الخدش الحلمات أو توليد الحلاقة طفح التي يمكن أن تكون مزعجة للتمريض في المستقبل من الجراء ولدت حية.
2. إعداد جلد البطن بالتناوب تطبيق بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول فرك مع قطعة قطن معقمة. تكرار فرك بحيث بوفيدون اليود و 70٪ من الإيثانول هي كل تطبيق 3X بالتناوب في الموضة. اسمحوا الجافة.
3. تأكيد عمق التخدير عن طريق عدم وجود إصبع القدم قرصة المنعكس. في غياب رد الفعل والمحفزات للألم والحد من مستوى الأيزوفلورين إلى 1٪.
4. استخدام المناشف الجراحية المعقمة،ثنى الحيوان. احرص على وضع الستائر في زاوية مناسبة بحيث أنها تعظيم كمية السائل الري أنها تمتص في حين عدم عرقلة تدفق الدم إلى الرحم قرون.

3. البطن البطن

1. باستخدام مشرط جعل شق خط الوسط 3 سم في جلد البطن المعدة. بصراحة تشريح طبقة الجلد من اللفافة البطن مع مقص. باستخدام ملقط ومقص جراحي، رفع طبقة اللفافي البطن وإجراء شق في ألبا اوعائي الخط للوصول إلى التجويف البريتوني.
2. وضع الشاش الجراحي على السطح الخارجي من شق وبلل بمحلول ملحي معقم. باستخدام الملقط حادة والضغوط الخارجية على البطن، إزالة بلطف قرون الرحم من التجويف البريتوني وترتيب على شاش مبلل.
3. تجنب بعناية التشابك والاتصال مع الأمعاء. ترتيب الأجنة باستخدام ملقط عن طريق الاتصال الأنسجة العضلية فقط بين الحويصلات الذي يحيط بالجنين الفردية.فضح وعزل شرايين الرحم 4 باستخدام تشريح حادة.
   يجب الحرص على تشريح شرايين الرحم: ملاحظة. الأنسجة المحيطة والأوعية أنفسهم حساسة للغاية. تلف الأوعية الأمهات يمكن أن يسبب النزيف، وفي الحالات الشديدة، وفاة الجنين والأم.

4. التنسيب من تمدد الأوعية الدموية كليب

1. وضع فأر 30 G كليب تمدد الأوعية الدموية في كل الشريان الرحمي. ضمان وقف تدفق الدم، بما في ذلك الداني والقاصي البقول، وسواد من السفن الرحم بما في ذلك مشيمة الفردية. تغطية قرون المكشوفة والجراحي الميداني كامل مع الشاش وري بمحلول ملحي معقم. احرص على إبقاء مجال رطبة مع الري تقريبا كل 10 دقيقة.
2. بعد 60 دقيقة، وإزالة الشاش ولري الحقل. ضمان قرون الرحم والأوعية وترطيبها بشكل كاف لإزالة مقطع ناجحة. بلطف إزالة كل مقطع تمدد الأوعية الدموية باستخدام ملقط. الحرص على عدم تسبب صدمة للسفينة، وصيانةسلامة الأنسجة العين أثناء الإزالة.
3. تماما ري قرون الرحم والميدان، مع الحرص على إزالة أي المواضيع الضالة من الشاش من الحويصلات الذي يحيط بالجنين.

5. حقن lipopolysaccharide في الدخول إلى الأمنيوسي الحويصلات

1. عند قاعدة كل الكيس السلوي الفردية، فقط الأمامي لوحة المشيمة، وضخ 100 ميكرولتر من LPS (4 ميكروغرام / كيس) مع صبغة زرقاء المخفف ايفان في لالسائل الذي يحيط بالجنين. استخدام الملقط حادة لتحقيق الاستقرار وتناوب كل الكيس السلوي في لموقف الأمثل للحقن. صبغة زرقاء مخفف ايفان هو عامل تباين التي هي مفيدة في تأكيد موضع الحقنة المناسبة والحقن.
   ملاحظة: لا تستخدم إلا لغاية في الدقة حقنة الأنسولين مع 0.3 مل تعلق 8 ملم 31 G إبرة لحقن داخل الأمنيوسي. وذلك باستخدام إبر عيار أكبر تؤدي إلى فقدان السائل الذي يحيط بالجنين المزمنة، وفاة الجنين واستيعابهم من الحمل. كميات صغيرة من تسرب السائل الذي يحيط بالجنين على إزالة حقنة يمكن أن يكون mitigATED بواسطة الضغط المباشر على الكيس السلوي. بعض الأجنة الفئران قد تحمل قدرا من قلة السائل السلوي. ومع ذلك، فقد السوائل الذي يحيط بالجنين الحادة من ثقب مع الإبر كبيرة قياس، أو ثقب عرضي مما أدى إلى تسرب السوائل المزمن، والنتائج في فقدان الجنين، وفي الحالات الشديدة، وفقدان الحمل المجاورة.
2. لري الرحم قرون 3X بمحلول ملحي معقم.

6. إغلاق البطن

1. باستخدام ملقط، والعودة بعناية قرون الرحم إلى التجويف البريتوني. ضمان مساحة كافية بين الحويصلات الذي يحيط بالجنين وشق خط الوسط، وإعادة تقريب-حواف طبقة عضلي لفافي باستخدام تشغيل خياطة 3-0 الحرير. يكون على بينة من وضع الحويصلات الذي يحيط بالجنين في حين إغلاق شق العضلات. أن يكون حريصا على عدم خياطة داخل أو من خلال الكيس.
2. إعادة تقريب طبقة الجلد، وذلك باستخدام تشغيل خياطة 3-0 الحرير، وإغلاق طبقة الجلد.
   ملاحظة: يجب إغلاق البطن في طبقتين من خيوط مستمرة للسماح للللبشرة وتوسيع العضلات مع زيادة الحمل. خيوط مستمرة تسمح لتوزيعها بالتساوي التوتر الجرح. هي أقل المطلوب الغرز توقف كما عقدة متعددة هي مزعجة ويمكن أن تمضغ بسهولة عن طريق الفئران على التعافي من التخدير. لم يتم المطلوب الدبابيس الجراحية. يجب أن تقطع ذيول عقدة جراحية قصيرة جدا (<3 مم).
3. حقن 1 مل من 0.125٪ بوبيفكين تحت الجلد حواف الجرح حول باستخدام إبرة 26 G. إدارة جرعة واحدة من 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد في مؤخر العنق.
4. إيقاف الأيزوفلورين والفئران الجاف منشفة الضرورة. وضع في قفص نظيف المنزل ورصد الانتعاش من التخدير. ضمان الفئران لا يصبح منخفض الحرارة.

7. ما بعد الجراحة والعناية الانتعاش

1. مراقبة الفئران كل 8-12 ساعة لمدة 72 ساعة وبعد ذلك يوميا حتى ولدت الجراء (حوالي E22 أو E23). إدارة جرعات إضافية من البوبرينورفين q8-12 ساعة / 72 ساعة أو PRN وفقا لما تمليه IACUC.
2. مراقبة الفئران لعلامات الألم، وعدم الراحة، والنزيف المهبلي أو نزيف من موقع الجراحية. تفقد الغرز وشق والحرص على ضمان الفئران لا مضغ أو إزالة الغرز قبل الأوان. وإن كان نادرا للغاية، الفئران التي تضر الغرز هم في خطر لتفزر الجرح.
   ملاحظة: أحيانا الفئران قد استوعب كميات كبيرة من الفراش أو المواد غير الغذائية، ووصف بيكا، كأثر جانبي للإدارة البوبرينورفين. على الرغم من النادر جدا، يجب مراقبة الفئران لبيكا والمحتملة لاحقة انسداد الأمعاء.

8. معالجة الأنسجة وCryosectioning

1. للتحضير لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ من الدماغ بعد الولادة، وإزالة الجراء من قفص المنزل على بعد الولادة يوم 2 (P2). باستخدام مقص جراحي قطع رأس الفئران الوليدة وبلطف إزالة الدماغ من الجمجمة.
2. إسقاط الإصلاح المخ في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي 7 مل من 4٪ لامتصاص العرق في الفوسفات مخزنة المالحة(PBS). وضع الدماغ في 4 درجات مئوية، وإصلاح لمدة 72 ساعة.
3. بعد 72 ساعة، نقل أدمغة إلى حل PBS العقيمة التي تحتوي على 30٪ سكروز (ث / ت) والعودة إلى 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: بمجرد إسقاط العقول في حل السكروز هم على استعداد ليكون مقطوع على ناظم البرد.
4. بسرعة تجميد العقول وجبل على مدقة ناظم البرد لاقتناء أقسام الاكليلية المجمدة. قطع 20 ميكرون أقسام الاكليلية المجمدة وجبل على الشرائح. يتم جمع ضمان أقسام متسلسل.
5. تسمح الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. متجر الشرائح في -20 درجة مئوية.

9. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ

1. خذ الشريحة التي شنت أقسام المجمدة ودافئة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إعداد جميع الحلول الطازجة.
2. مكان الشرائح على شريحة دفئا مجموعة إلى 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
3. نقل الشرائح إلى رف تلطيخ. تراجع الشرائح 10X في الماء منزوع الأيونات المزدوج المقطر ([ده ₂ O).
4. احتضان الشرائح في 100٪ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. منظمة الشفافية الدوليةلي في الهيماتوكسيلين يمكن أن يكون الأمثل اعتمادا على درجة من تلطيخ الأرجواني.
5. تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H ₂ O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H _{2 O} لمدة 1 دقيقة.
6. تراجع الشرائح 15X في الكحول الحمضية (250 مل 70٪ من الإيثانول + 1 مل تتركز حمض الهيدروكلوريك).
7. تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H ₂ O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H _{2 O} لمدة 1 دقيقة.
8. احتضان في 1٪ كربونات الليثيوم لمدة 2 دقيقة.
9. تراجع الشرائح 4X في الاستفادة من H ₂ O، واسمحوا الوقوف في نظيفة الصنبور H _{2 O} لمدة 1 دقيقة.
10. احتضان في 95٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
11. تراجع الشرائح 7X في 100٪ يوزين. عدد من الانخفاضات في يوزين يمكن تعديل اعتمادا على درجة من تلطيخ الوردي.
12. تراجع الشرائح 5X في 95٪ من الإيثانول.
13. 5X شريحة تراجع في التغيير جديدة من 95٪ من الإيثانول.
14. احتضان الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة.
15. احتضان الشرائح في التغيير جديدة من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة.
16. احتضان الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: الخطوات الزيلين وcoverslipping ينبغي أن يحدث في غطاء الدخان.
17. احتضان الشرائح في تغييرات جديدة من الزيلين لمدة 15 دقيقة.
18. ساترة مع Permount واسمحوا الجافة في غطاء الدخان.
19. صورة الشرائح مع المجهر الضوئي.

النتائج

بعد TSHI + LPS في E18، الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ يكشف تشوهات كبيرة في أنسجة كل من المشيمة (الشكل 1) والدماغ (الشكل 2). مشيمة فحص على E19 E21 هي وذمي بشكل صارخ مع نزيف الصغير، ونخر في جميع أنحاء الساقط والمتاهة. ويلاحظ أيضا ارتشاح التهابي كبير وزيادة في الأوعي?...

Discussion

التهاب الدماغ الخداج من الصعب نموذج في الحيوانات بسبب التفاعل المعقد بين مسببات، دوام النمو العصبي، تعقيد تشكيل شبكة الدماغي البشري، وتداخل آليات الإصابة، والظواهر المتنوعة للCNS شتائم اضحة في الخدج الإنسان. ويرتبط EOP مع نقاط الضعف المحددة الخلية من نوع (أي قليل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Surgical gloves	Biogel	40870
OR Towels	Cardinal Health	287000-008	Sterile
PDI Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers	Kent Scientific Corp.	CL8787
Betadine surgical scrub	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	00023-0312
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Scissors	Roboz	RS-6808
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	F.S.T.	14002-16
Syringe	BD	309628	1 ml
Needle	BD	305122	25G 5/8
Needle	BD	305128	30G 1
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures	Ethicon	1684G	Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides	VWR	48311-703
Hematoxylin	Leica	3801521	Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin	Leica	3801601	Surgipath Eosin
Xylenes	Fisherbrand	X3S-4	Histological Grade
Permount	Fisherbrand	SP15-100
Coverglass	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium Coverglass