Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

Resumen

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Resumen

Encefalopatía del prematuro (EOP) es un término que abarca el sistema nervioso central (SNC) anormalidades asociadas con el parto prematuro. Para mejores objetivos de traslación antelación y descubrir nuevas estrategias terapéuticas para la lesión cerebral asociada con el parto prematuro, modelos preclínicos de EOP deben incluir mecanismos similares de lesión mundial prenatal observado en los seres humanos y la participación de múltiples componentes del sistema materno-placentaria-fetal. Idealmente, los modelos deben producir un espectro similar de déficit funcional en el animal maduro y recapitular los múltiples aspectos de la fisiopatología. Para imitar los defectos humanos sistémicas placentarios perfusión, hipoperfusión placentaria y / o corioamnionitis asociados con la inflamación inducida por patógenos en el parto prematuro temprano, hemos desarrollado un modelo de prenatal transitoria hipoxia-isquemia sistémica (Tshi) combinado con lipopolisacárido intra-amniótica (LPS). En embarazadas ratas Sprague Dawley, Tshi través de oclusión de la arteria uterina on día embrionario 18 (E18) induce un defecto hipoperfusión placentaria graduada asociada con el aumento de daño en el SNC en el feto. Cuando se combina con inyecciones de LPS intra-amniótico, la placenta se incrementa la inflamación y daño en el SNC se ve agravado con la materia, de la marcha y de imagen anomalías blancos asociados. Prenatal Tshi y Tshi + LPS insultos prenatales cumplen varios de los criterios de un modelo de EOP incluyendo recapitulando el insulto intrauterino, causando la pérdida de neuronas, oligodendrocitos y los axones, la pérdida de la placa de conexión, y los déficits funcionales en animales adultos que imitan a los observados en los niños nacidos extremadamente prematuro. Además, este modelo permite la disección de la inflamación inducida por los tipos de lesiones divergentes.

Introducción

Con más del 12% de los bebés nacidos en los Estados Unidos antes de la edad de las 37 semanas de gestación estimada ^1, lesión cerebral perinatal (PBI) de la prematuridad es una causa importante de discapacidad permanente. PBI de la prematuridad, la encefalopatía también denominado del prematuro (EOP), afecta a todo el sistema nervioso central (SNC). Lesión del SNC a menudo comienza en el útero, y se ve exacerbada por procesos prenatales incluyendo corioamnionitis y las complicaciones postnatales tales como la hipoxia y sepsis. PBI de insultos sistémicos altera el desarrollo neurológico y conduce a la parálisis cerebral, epilepsia, retraso cognitivo y numerosos trastornos neuropsiquiátricos que afecta a la regulación emocional, la memoria y la función ejecutiva ^1,2. Aunque se ha avanzado mucho, una comprensión limitada sigue siendo cómo las consecuencias celulares y moleculares de la lesión del SNC desde el nacimiento prematuro se traducen en la multitud de secuelas neurológicas en los niños que nacen prematuros. Esta falta de conocimiento traserares diagnóstico en tiempo real de la gravedad de la lesión del SNC y la dosificación informado de las intervenciones emergentes. Además, las estrategias terapéuticas apropiadas a su edad para esta población de pacientes vulnerables siguen siendo difícil de alcanzar.

Inflamación intrauterina es muy común en la prematuridad extrema e implica una compleja cascada inflamatoria fetal-materno-placentaria ^3. La infección intrauterina suele ser subclínica. Hallazgos placentarios específicos consistentes con la inflamación aguda o corioamnionitis histológica, son los principales determinantes de la respuesta inflamatoria fetal y son coincidentes con lesión cerebral asociada con el parto prematuro ^3-5. De hecho, la respuesta inflamatoria fetal tiene implicaciones clínicas distintas de resultados a largo plazo desde el nacimiento prematuro. Los bebés que son pequeños para la edad gestacional (PEG) o que experimentar la infección son excepcionalmente vulnerables a los déficit neurológico ^3,4. La corioamnionitis es un diagnóstico típico patológica tras el parto prematuro ^{6,7, y el examen histológico revela signos de inflamación en el 70% de las placentas de los bebés nacidos muy prematuros 4. Además, la corioamnionitis se asocia con deterioro cognitivo a los dos años de 8. La evidencia de hipoperfusión vascular materna en la placenta de los recién nacidos extremadamente prematuros también se asocia con parálisis cerebral en la infancia 9. El impacto sinérgico de defectos de perfusión corioamnionitis y la placenta está bien ilustrado por el notable alto riesgo de resultados neurológicos anormales en esta población de pacientes a los dos años de 10,11 años.}

Para imitar los defectos de perfusión placentaria sistémicos humanos y corioamnionitis asociados con la inflamación inducida por patógenos, hemos desarrollado un modelo de prenatal transitoria hipoxia-isquemia sistémica (Tshi) combinado con lipopolisacárido intra-amniótica (LPS) en ratas. Nuestro objetivo era adaptar nuestro modelo de Tshi solo en ratas ^12-16 para incluir la inflamación intrauterina,para facilitar el modelado preclínica de lesión del SNC asociado con el parto prematuro. Tshi solo ha revelado pérdida persistente de células del linaje oligodendroglial, las neuronas corticales, el aumento de la muerte celular, y niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias, con intervalos de isquemia progresiva que conduce a un patrón graduada de la lesión consistente con lesión cerebral prenatal ^16. Las modificaciones a los componentes isquémicos de este modelo han demostrado también déficits en la codificación de la memoria, y la memoria a corto a largo plazo y alteraciones musculoesqueléticas leves en ratas, ya que ^{17-19 de} envejecen. De hecho, hemos demostrado previamente que la combinación de Tshi + LPS recapitula las características fisiopatológicas de la EOP, incluyendo los oligodendrocitos y la pérdida neuronal, lesión axonal, la inflamación celular y las anormalidades funcionales ^20.

Protocolo

Atención Institucional y el empleo Comités en el Hospital de Niños de Boston, tanto y la Universidad de Nuevo Centro de Ciencias de Salud de Nuevo México aprobó todos los procedimientos experimentales.

NOTA: Antes de comenzar el procedimiento, el sello, esterilizar y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y paños quirúrgicos. Además, preparar medicamentos post-operatorios en viales estériles incluyendo 0,125% bipivucaine y 0,1 mg / kg de buprenorfina. También hay que preparar la solución de lipopolisacárido (LPS) de forma estéril: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) en solución salina estéril que contiene diluir colorante azul de Evan.

1. Anestesia

1. Inducir la anestesia en un día embrionario 18 (E18) de ratas Sprague Dawley embarazada con una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado 70% de nitrógeno y 30% de oxígeno.
2. Retire la rata de la cámara de inducción y coloque la supina rata en quirúrgico envuelto manta de agua que circula a 37 ° C. Traslado anestesia para cono de la nariz y reducir isofluranivel ne a 2%.
3. Aplique suavemente pomada oftálmica a cada ojo para prevenir la sequedad de la córnea. Durante el procedimiento de monitorear continuamente la temperatura, la tasa de respiración y la frecuencia cardiaca del animal. Fisiología materna debe permanecer estable durante todo el procedimiento.

2. Preparación quirúrgica y Scrub

1. Usando pequeñas tijeras de animales eliminan todo el pelo en la región abdominal inferior. Afeitarse en un patrón rectangular con cuidado para evitar mellar los pezones o la generación de erupción de afeitar que puede ser irritante para el futuro de la enfermería de los cachorros nacidos vivos.
2. Preparar la piel abdominal por la alternancia de aplicación de povidona yodada y el 70% de etanol frote con hisopos de algodón estériles. Repita el matorral de tal manera que la povidona yodada y etanol 70% son cada aplicado 3x de forma alterna. Deje que se seque.
3. Confirme la profundidad de la anestesia a través de ausencia de reflejo toe-pinch. En ausencia de reflejo y estímulos de dolor, reducir el nivel de isoflurano al 1%.
4. El uso de toallas quirúrgicos estériles,cuelgue el animal. Tenga cuidado de colocar las cortinas en un ángulo apropiado de tal manera que maximizan la cantidad de fluido de irrigación que absorben mientras que no obstruye el flujo de sangre a los cuernos uterinos.

3. La laparotomía abdominal

1. Con un bisturí hacer una incisión en la línea media de 3 cm en la piel abdominal preparada. Sin rodeos diseccionar la capa de piel de la fascia abdominal con tijeras. Usando fórceps y tijeras quirúrgicas, elevar la capa fascial abdominal y hacer una incisión de la línea alba avascular para obtener acceso a la cavidad peritoneal.
2. Coloque gasa quirúrgica en el exterior de la incisión y humedecer con solución salina estéril. Con unas pinzas romas y presión externa sobre el abdomen, retire con cuidado los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal y organizar en la gasa humedecida.
3. Evitar con cuidado el enredo y el contacto con los intestinos. Organizar fetos utilizando pinzas contactando sólo el tejido muscular en entre sacos amnióticos individuales.Exponer y aislar a las 4 arterias uterinas mediante disección roma.
   NOTA: Se debe tener cuidado para diseccionar las arterias uterinas. Tejido circundante y los vasos mismos son extremadamente delicada. El daño a los vasos maternos puede causar sangrado, y en casos severos, muerte fetal y materna.

4. Colocación de los clips de aneurismas

1. Coloque una G clip de aneurisma de la rata 30 en cada arteria uterina. Asegurar la cesación del flujo de sangre, incluyendo proximal y pulsos distales, y oscurecimiento de los vasos uterinos incluyendo placentas individuales. Cubra los cuernos a la vista y campo quirúrgico entero con una gasa y regar con solución salina estéril. Tenga cuidado de mantener el terreno húmedo con riego aproximadamente cada 10 min.
2. Después de 60 minutos, retire la gasa y el riego del campo. Asegúrese de que los cuernos uterinos y los vasos se humedecen de manera adecuada para la eliminación de clip de éxito. Retire con cuidado cada clip de aneurisma utilizando fórceps. Tenga cuidado de no causar traumatismos en el recipiente, y maintain la integridad del tejido durante la extracción.
3. Completamente regar los cuernos uterinos y el campo, teniendo cuidado de eliminar cualquier hilo callejeros de gasa de las bolsas amnióticas.

5. La inyección de lipopolisacárido para amniótico Sacs

1. En la base de cada saco amniótico individual, justo anterior a la placa de la placenta, inyecte 100 l de LPS (4 mg / saco) con colorante azul diluido de Evan en el líquido amniótico. El uso de fórceps romos para estabilizar y girar cada saco amniótico para una posición óptima para la inyección. Colorante azul de Diluir Evan es un agente de contraste que es útil para confirmar la colocación correcta de la jeringa e inyección.
   NOTA: Utilice sólo un ultra-fino jeringa 0,3 ml de insulina con el adjunto 8 mm 31 G de agujas para las inyecciones intra-amniótica. El uso de grandes agujas de calibre dará lugar a la pérdida de líquido amniótico crónica, muerte fetal y reabsorción del embarazo. Pequeñas cantidades de fuga de líquido amniótico tras la retirada de la jeringa pueden ser mitiglización creada por presión directa en el saco amniótico. Algunos fetos de rata pueden tolerar un grado de oligohidramnios. Sin embargo, la pérdida de líquido amniótico aguda de la punción con grandes agujas de calibre, o punción accidental que resulta en pérdida de líquido crónica, los resultados en la pérdida fetal y en los casos graves, pérdida de embarazos vecinos.
2. Riegue el útero cuernos 3x con solución salina estéril.

6. Cierre de la laparotomía

1. Con unas pinzas, devuelva cuidadosamente los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal. Garantizar un espacio adecuado entre los sacos amnióticos y la incisión en la línea media, volver a aproximar los bordes de la capa musculofascial utilizando una sutura de seda 3-0 en funcionamiento. Sea consciente de la colocación de los sacos amnióticos mientras se cierra la incisión muscular. Tenga cuidado de no suturar hacia oa través de un saco.
2. Re-aproximar la capa de piel, utilizando una sutura de seda 3-0 en funcionamiento, el cierre de la capa de la piel.
   NOTA: La laparotomía debe ser cerrado en dos capas de suturas continuas que permitanpara la piel y la expansión muscular con el aumento de la gestación. Suturas continuas permiten la tensión de la herida uniformemente distribuida. Suturas interrumpidas son menos deseables como múltiples nudos son irritantes y pueden ser fácilmente masticadas por la rata tras recuperarse de la anestesia. Grapas quirúrgicas no son deseados. Las colas de los nudos quirúrgicos se deben cortar muy corto (<3 mm).
3. Se inyecta 1 ml de 0,125% por vía subcutánea bupivacaína bordes alrededor de la herida utilizando una aguja de 26 G. Administrar una dosis de 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea en la nuca del cuello.
4. Apague el isoflurano y toalla rata seca como sea necesario. Colocar en jaula limpia y seguimiento de la recuperación de la anestesia. Asegurar la rata no se convierta en hipotermia.

7. Recuperación postoperatoria y Cuidado

1. Supervisar la rata cada 8 a 12 horas durante 72 horas y luego todos los días hasta las crías nacen (aproximadamente E22 o E23). Administrar dosis adicionales de q8-12 buprenorfina hr / 72 hr o prn según lo dictado por el IACUC.
2. Monitorear las ratas para detectar signos de dolor, malestar, sangrado vaginal o sangrado de la zona quirúrgica. Inspeccione las suturas y la incisión y tener cuidado de asegurarse rata no está masticando o retirar sus suturas prematuramente. Aunque excepcionalmente raro, las ratas que comprometen sus suturas están en riesgo de dehiscencia de la herida.
   NOTA: De vez en cuando las ratas pueden ingerir cantidades excesivas de ropa de cama o artículos no alimentarios, llamado pica, como un efecto secundario de la administración de buprenorfina. Aunque es muy poco común, las ratas deben ser monitorizados para la pica y el potencial de obstrucción intestinal posterior.

8. Procesamiento de tejidos y cryosectioning

1. Para prepararse para hematoxilina y eosina (H & E) tinción del cerebro postnatal, retirar las crías de su jaula en postnatal día 2 (P2). Con unas tijeras quirúrgicas decapitan crías de ratas y suavemente retire el cerebro del cráneo.
2. Caída de corrección cerebro en un tubo cónico de 15 ml que contiene 7 ml de 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino(PBS). Coloque cerebro a 4 ° C y fijar durante 72 horas.
3. Después de 72 horas, transferir cerebros para una solución estéril que contiene 30% PBS sacarosa (w / v) y volver a 4 ° C.
   NOTA: Una vez que el cerebro caen en la solución de sacarosa que están listos para ser seccionado en un criostato.
4. Rápidamente congelar cerebros y montar en una maja criostato para la adquisición de secciones coronales congeladas. Cortar 20 micras secciones coronales congeladas y montar en las diapositivas. Asegurar secciones se recogen en serie.
5. Permitir que las diapositivas se sequen a temperatura ambiente durante la noche. Tienda desliza a -20 ° C.

9. hematoxilina y eosina tinción

1. Tome diapositivas montadas secciones congeladas y caliente a temperatura ambiente.
   NOTA: Preparar todas las soluciones fresco.
2. Colocar los portaobjetos en una diapositiva conjunto más caliente a 50 ° C durante 2 horas.
3. Transferencia desliza a un estante de tinción. Dip desliza 10x en agua desionizada doblemente destilada _(ddH2O).
4. Incubar los portaobjetos en 100% hematoxilina durante 5 min. Timí en hematoxilina se puede optimizar dependiendo del grado de coloración púrpura.
5. Diapositivas Dip 4x en grifo _H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo _H2O durante 1 min.
6. Dip desliza 15x en alcohol ácido (250 ml 70% de etanol + 1 ml de ácido clorhídrico concentrado).
7. Diapositivas Dip 4x en grifo _H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo _H2O durante 1 min.
8. Incubar en 1% de carbonato de litio durante 2 min.
9. Diapositivas Dip 4x en grifo _H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo _H2O durante 1 min.
10. Incubar en etanol 95% durante 1 min.
11. Diapositivas Dip 7x en el 100% Eosina. Número de caídas en Eosina puede ser modificado en función del grado de coloración rosada.
12. Diapositivas Dip 5x en etanol al 95%.
13. 5x diapositivas inmersión en un nuevo cambio de etanol al 95%.
14. Incubar los portaobjetos en etanol al 100% durante 1 min.
15. Incubar los portaobjetos en un nuevo cambio de etanol 100% durante 1 min.
16. Incubar los portaobjetos en 100% xileno durante 15 min.
    NOTA: Los pasos de xileno ycubrición debe ocurrir en una campana de humos.
17. Incubar los portaobjetos en cambios frescas de xileno durante 15 min.
18. Cubreobjetos con Permount y dejar secar en campana de humos.
19. Imagen desliza con un microscopio óptico.

Resultados

Siguiendo Tshi + LPS a E18, hematoxilina y eosina revela anomalías significativas histopatológicos en tanto la placenta (Figura 1) y en el cerebro (Figura 2). Placentas examinadas en E19 y E21 son groseramente edematosa con micro-hemorragia y necrosis en toda la decidua y laberinto. También se observa infiltrado inflamatorio importante y aumento de la vascularización. Los cerebros examinados en P2 revelan ventrículomegalia, así como la materia blanca y la pérdida de neuronas sobr...

Discusión

Encefalopatía del prematuro es difícil de modelar en los animales debido a la compleja interacción de causas, evolución en el tiempo del desarrollo neurológico, complejidad de la formación de la red cerebral humana, mecanismos de lesión se superponen, y los diversos fenotipos de SNC insulta manifiesta en los recién nacidos prematuros humanos. EOP se asocia con vulnerabilidades específicas de tipo celular (es decir, los oligodendrocitos inmaduros) ^21, así como diversos caminos regulados por ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Surgical gloves	Biogel	40870
OR Towels	Cardinal Health	287000-008	Sterile
PDI Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers	Kent Scientific Corp.	CL8787
Betadine surgical scrub	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	00023-0312
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Scissors	Roboz	RS-6808
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	F.S.T.	14002-16
Syringe	BD	309628	1 ml
Needle	BD	305122	25G 5/8
Needle	BD	305128	30G 1
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures	Ethicon	1684G	Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides	VWR	48311-703
Hematoxylin	Leica	3801521	Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin	Leica	3801601	Surgipath Eosin
Xylenes	Fisherbrand	X3S-4	Histological Grade
Permount	Fisherbrand	SP15-100
Coverglass	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium Coverglass