Prematüre Modelleme Ensefalopati Sıçanlarda İçi amniyotik Lipopolisakkarid ile Prenatal Hipoksi-iskemi kullanma

Özet

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Özet

Prematüre Ensefalopati (EOP) en ileri öteleme hedefleri belirleyin. Erken doğum ile ilişkili anormallikleri merkezi sinir sistemini (MSS) kapsayan bir terimdir ve erken doğum ile ilişkili beyin hasarı için yeni tedavi stratejileri ortaya çıkarmak, ÇOP'un preklinik modelleri benzer mekanizmalar içermelidir Prenatal küresel yaralanma insanlarda görülen ve anne-plasental-fetal sistemin birden fazla bileşen içerir. İdeal olarak, modeller, olgun hayvan fonksiyonel açıklarının benzer spektrumunu üretmek ve patofizyoloji birden yönlerini özetlemek gerekir. Erken erken doğum patojen kaynaklı iltihap ile bağlantılı insan plasental perfüzyon sistemik bozuklukları, plasental underperfusion ve / veya koryoamniyonit taklit etmek için, içi amniyotik lipopolisakarit (LPS) ile bir araya prenatal geçici sistemik hipoksi, iskemi (TSHI) içindeki bir model geliştirmiştir. Hamile Sprague Dawley sıçanlarda, TSHI uterin arter tıkanıklığı o yoluylan embriyonik gün 18 (E18) fetusta MSS hasarı artan ilişkili bir kademeli plasental underperfusion kusur neden olur. Intra-amniyotik LPS enjeksiyonu ile kombine edildiğinde, plasental inflamasyon artar ve MSS hasar ilişkili beyaz cevher, yürüme ve manyetik rezonans görüntüleme bulguları ile karmaşıklaşır. Prenatal TSHI ve TSHI + LPS prenatal hakaret nöronlar, oligodendrositler ve akson, Plaka yapısı kaybı ve son derece doğan çocuklarda gözlenen taklit yetişkin hayvanlarda fonksiyonel açıklarının kaybına neden intrauterin hakaret recapitulating içeren bir ÇOP'un modeli kriterlerine çeşitli karşılamak erken. Ayrıca, bu model farklı yaralanma türlerine neden olduğu inflamasyonun diseksiyon sağlar.

Giriş

37 hafta tahmini gebelik yaşı ¹ önce Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan bebeklerin% 12'nin üzerinde olan, prematürite perinatal beyin hasarı (PBI) kalıcı sakatlık önemli bir nedenidir. PBI prematürite, prematüre olarak da adlandırılır ensefalopati (EOP), tüm merkezi sinir sistemi (CNS) etkilemektedir. MSS yaralanması genellikle in utero başlar ve koriyoamniyonit ve hipoksi ve sepsis gibi doğum sonrası komplikasyonlar da dahil olmak üzere doğum öncesi süreçler tarafından şiddetlenir. Sistemik hakaret gelen PBI nöro-gelişimsel sürecini değiştirir ve duygusal regülasyonu, bellek ve yürütücü işlev ^1,2 etkileyen serebral palsi, epilepsi, bilişsel gecikme ve çok sayıda nöropsikiyatrik bozukluklara yol açar. Çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, sınırlı bir anlayış erken doğumdan itibaren MSS yaralanma hücresel ve moleküler sonuçları preterm doğan çocuklarda nörolojik sekel çokluk çevirmek nasıl kalır. Bilgi hind bu eksikliğiGerçek zamanlı MSS yaralanma şiddetinin tanı ve gelişmekte olan müdahalelerin haberdar dozaj ers. Ayrıca, bu savunmasız hasta popülasyonu için yaşa uygun tedavi stratejileri zor kalır.

Rahim içi iltihabı, aşırı prematüre çok yaygın olan ve ³ karmaşık bir fetal-maternal-plasental inflamatuar dizisini içerir. Intrauterin enfeksiyon genellikle subklinik olduğunu. Akut inflamasyon veya histolojik koryoamniyonit ile uyumlu Belirli plasental bulgular, fetal enflamatuar yanıtın önemli belirleyicileri ve erken doğum ^3-5 ile ilişkili beyin hasarı ile tesadüf. Nitekim, fetal inflamatuvar yanıt erken doğumdan itibaren uzun vadeli sonuçları için farklı klinik etkileri vardır. Gebelik yaşı (SGA) ya da kim enfeksiyon deneyim için küçük bebekler nörolojik defisit ^3,4 ile son derece açıktır. Koryoamniyonit tipik patolojik tanı takip erken doğum olduğunu ^{6,7 ve histolojik inceleme çok erken 4 doğan bebeklerin gelen plasenta% 70 iltihabın belirtileri ortaya koymaktadır. Dahası, korioamnionit iki yıl 8'de bilişsel bozukluğu ile ilişkilidir. Son derece erken doğan bebeklerin plasentada maternal vasküler underperfusion kanıtı da çocukluk 9 serebral palsi ile ilişkilidir. Korioamnionit ve plasental perfüzyon defektlerinin sinerjik etkisi de yaş 10,11 iki yıl bu hasta popülasyonunda anormal nörolojik sonuçların oldukça yüksek risk gösterilmiştir.}

Patojen kaynaklı inflamasyon ile ilişkili insan sistemik plasental perfüzyon defektleri ve koryoamniyonit taklit etmek, sıçanlarda içi amniyotik lipopolisakarit (LPS) ile kombine prenatal geçici sistemik hipoksi-iskemi (TSHI) bir model geliştirdi. Amacımız, intrauterin iltihabı dahil yalnız sıçanlarda ^12-16 TSHI bizim modeli adapte olduerken doğum ile ilgili CNS yaralanma preklinik modelleme kolaylaştırmak için. TSHI başına oligodendroglial soyu hücreleri, kortikal nöronlar kalıcı zarar ortaya koymuştur, prenatal beyin hasarı ¹⁶ ile uyumlu bir yaralanma kademeli kalıp giden aşamalı iskemik aralıklı, hücre ölümü artışı ve pro-enflamatuar sitokin seviyelerinin yüksek. Onlar ^17-19 yaş olarak bu modelin iskemik bileşenlerine değişiklikler de sıçanlarda hafıza kodlama, kısa ve uzun süreli hafıza ve hafif kas-iskelet değişiklikler eksiklikler göstermiştir. Gerçekten de, daha önce TSHI + LPS kombinasyonu oligodendrosit ve nöronal kaybın, aksonal yaralanma, enflamasyon ve fonksiyonel hücre anormallikleri dahil olmak üzere, ²⁰ EOP patofizyolojik işaretlerinden, tekrarlar olduğunu göstermiştir.

Protokol

Kurumsal Bakım ve Kullanım Komiteleri hem Boston Çocuk Hastanesi'nde ve New Mexico Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi, tüm deneysel prosedürleri onayladı.

NOT: Ön işlem, mühür başlamadan, sterilize ve tüm cerrahi aletler ve cerrahi örtüler otoklav. Buna ek olarak,% 0.125 bipivucaine ve 0.1 mg / kg dahil olmak üzere, buprenorfin, steril şişeler içinde post-operatif ilaç hazırlanması. Ayrıca steril lipopolisakarit (LPS) bir çözelti hazırlamak: 0,04 mg / ml LPS (0111: B4) Evan mavisi seyreltik ihtiva eden steril tuzlu su içinde.

1. Anestezi

1. % 3 izofluran dengeli bir% 70 azot ve% 30 oksijen karışımı ile embriyonik gün 18 (E18) hamile Sprague Dawley sıçan anestezi neden.
2. Indüksiyon odasından sıçan çıkarın ve 37 ° C'de set dökümlü cerrahi dolaşan su battaniye sıçan sırtüstü yerleştirin. Burun konisi anestezi aktarın ve isoflura azaltmak% 2 ne düzeyde.
3. Yavaşça kornea kurumasını önlemek için her gözün oftalmik merhem uygulayın. İşlem sırasında sürekli sıcaklık, solunum hızı ve hayvan kalp atışlarının izlenmesi. Anne fizyolojisi prosedür boyunca sabit kalması gerekir.

2. Cerrahi Hazırlık ve Scrub

1. Kullanımı küçük hayvan kesme alt karın bölgesindeki bütün tüylerden. Meme nicklemek veya canlı doğmuş yavruların gelecekteki hemşirelik için rahatsız edici olabilir jilet döküntü üreten önlemek için dikkatli bir dikdörtgen desen Tıraş.
2. Steril pamuklu çubukla povidon iyot ve% 70 etanol fırçalayın uygulama değiştirerek karın cildi hazırlayın. Povidon-iyot ve% 70 etanol her moda alternatif 3x uygulanan olacak şekilde fırçalayın tekrarlayın. Kurumaya bırakın.
3. Ayak-tutam refleksinin yokluğu yoluyla anestezi derinliği onaylayın. Ağrı refleksi uyaranların yokluğunda,% 1 izofluran seviyesini azaltır.
4. Steril cerrahi havlu kullanarak,hayvan asmak. Onlar rahim boynuzları kan akışını engellediği değil iken absorbe sulama sıvı miktarını maksimize şekilde uygun bir açıyla perdeler yerleştirmek için özen gösterin.

3. Abdominal Laparotomi

1. Bir neşter kullanılarak hazırlanan karın derisinde 3 cm'lik orta hat kesi yapmak. Açık açık makas ile karın fasya deri tabakasını incelemek. Forseps ve cerrahi makas kullanarak, karın fasya tabakası yükseltmek ve periton boşluğuna erişmek için avasküler linea alba bir kesi yapmak.
2. Kesi dış cerrahi gazlı bez yerleştirin ve steril tuzlu su ile nemlendirin. Karın künt forseps ve dış basınç kullanarak, yavaşça periton boşluğuna gelen rahim boynuzları kaldırmak ve nemlendirilmiş gazlı bez üzerine yerleştirin.
3. Dikkatle dolanması önlemek ve bağırsak ile temasa geçin. Fetusun bireysel amnion kesesi arasındaki tek kas dokusu ile temasa geçerek forseps kullanarak düzenleyin.Açığa ve künt diseksiyon ile 4 uterin arterler izole.
   NOT: Bakım rahim arterleri incelemek için alınmalıdır. Ortam doku ve damarları kendilerini son derece hassastır. Anne gemilere hasar kanamaya yol ve ciddi vakalarda, fetal ve maternal ölüm olabilir.

Anevrizma Klipleri 4. Yerleştirme

1. Her uterin arter üzerinde bir sıçan 30 G anevrizma klibi yerleştirin. Bireysel plasenta rahim dahil gemilerin proksimal ve distal bakliyat ve koyulaşması dahil kan akışının durması emin olun. Maruz boynuzları ve gazlı bez ile tüm cerrahi alanı kapsayacak ve steril tuzlu su ile yıkayın. Sulama yaklaşık her 10 dk ile nemli alan tutmaya özen gösterin.
2. 60 dakika sonra, gazlı bez kaldırmak ve alanını sulamak. Rahim boynuzları ve damarlar yeterince başarılı klip kaldırılması için ıslatılmış olduğundan emin olun. Yavaşça forseps kullanarak her anevrizma klibi kaldırın. Gemiye travma ve maint sebebiyet vermemek özen gösterinçıkarılması sırasında ain doku bütünlüğü.
3. İyice amnion kesesi gelen gazlı bez herhangi bir sokak Konuları kaldırmak için özen, rahim boynuzları ve alanını sulamak.

Amniyon Sacs için Lipopolisakarit 5. Enjeksiyon

1. Her amniyon kesesi dibinde, sadece plasental plaka ön amniyon sıvısına seyreltilmiş Evan mavi boya ile LPS (4 ug / kese) 100 ul enjekte edilir. Stabilize ve enjeksiyon için en uygun pozisyona her amniyotik kese döndürmek için künt forseps kullanın. Seyreltik Evan mavi boya uygun şırınga yerleştirme ve enjeksiyon teyit yararlı bir kontrast ajandır.
   NOT: intra-amniyotik enjeksiyonlar için ekli 8 mm 31 G iğne ile Yalnızca bir ultra-ince 0.3 ml insülin şırınga. Daha büyük göstergesi iğneler kullanılarak kronik amniyotik sıvı kaybı, fetal ölüm ve gebelik reabzorpsiyonunda neden olacaktır. Şırınga çıkartılması üzerine amniyotik sıvı sızıntı küçük miktarlarda mitig olabiliramniyon kesesi doğrudan basınç ile bir-. Bazı sıçan fetus oligohidramnios bir ölçüde tolere edebilir. Ancak, büyük göstergesi iğne veya kronik sıvı sızıntısı ile sonuçlanan kazayla ponksiyonu, fetal kayıp ve ciddi vakalarda sonuçları, komşu gebelik kaybı ile delinerek akut amniyotik sıvı kaybı.
2. Boynuzları steril serum fizyolojik ile 3x uterus yıkayın.

6. laparotomi Kapanış

1. Forseps kullanarak, dikkatli periton boşluğuna rahim boynuzları geri dönün. Amnion kesesi ve orta hat kesi arasında yeterli boşluk sağlanması, çalışan 3-0 ipek sütür kullanılarak muskulofasyal katman kenarlarını yeniden yaklaşmaktadır. Kas kesi kapatırken amnion kesesi yerleştirme farkında olun. Içine veya kese ile sütür için değil dikkatli olun.
2. Cilt katmanı kapatarak, bir çalışan 3-0 ipek sütür kullanılarak, cilt tabakası yeniden yaklaşmaktadır.
   NOT: laparotomi izin devamlı sütür iki kat kapalı olmalıdırCilt ve gebelik artan kas genişleme. Sürekli dikişler eşit olarak dağıtılmış yara gerginliği için izin verir. Birden knot rahatsız edici ve kolayca anestezi kurtarma üzerine sıçan tarafından çiğnenmiş edilebilir Kesilen sütür az arzu edilir. Cerrahi zımba arzu edilmez. Cerrahi knot kuyrukları çok kısa (<3 mm) kesilmelidir.
3. Bir 26 G iğne kullanılarak% 0.125 bupivakain deri altından yaklaşık yara kenarlarının 1 ml enjekte edilir. Ense de kg buprenorfin subkutan 0.1 mg tek doz / yönetmek.
4. Izofluran ve havlu kuru sıçan gerekirse kapatın. Temiz ev kafeste yerleştirin ve anestezi ayilmanizi. Hipotermik hale gelmez sıçan olun.

7. Ameliyat Sonrası Kurtarma ve Bakım

1. Yavrular (yaklaşık E22 veya E23) doğarlar kadar günlük sonra 72 saat boyunca siçana her 8-12 saat Monitör ve. Buprenorfın q8-12 saat / 72 saat ek doz yönetmek veya IACUC tarafından belirlenen prn.
2. Ağrı, rahatsızlık, vajinal kanama ya da cerrahi sitesinden kanama belirtileri için sıçanları izleyin. Sütürler ve kesi kontrol edin ve sıçan çiğneme veya erken kendi sütür kaldırarak görmediğinden emin olmak için özen gösterin. Derece nadir olmasına rağmen, onların sütürler tehlikeye sıçanlar yara açılma riski altındadır.
   NOT: Bazen sıçanlar yatak ya da gıda dışı maddelerin aşırı miktarda yemek olabilir, buprenorfın yönetiminin bir yan etkisi olarak, pika denir. Çok nadir olmakla birlikte, sıçanlar pika ve potansiyel sonraki barsak tıkanıklığı için izlenmesi gerekir.

8. Doku İşleme ve Cryosectioning

1. , Hematoksilen (H & E) doğum sonrası beyin boyanması için hazırlık doğum sonrası gün 2 (P2) üzerine evlerine kafes yavrular kaldırmak için. Cerrahi makas hafifçe sıçan yavrular başını kesmek ve kullanma kafatası beyin kaldırmak.
2. Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit 7 ml içeren 15 ml konik bir tüp içinde düzeltme beyin bırakın(PBS). 4 ° C 'de beyin yerleştirin ve 72 saat boyunca sabitlemek.
3. 72 saat sonra,% 30 sukroz ihtiva eden bir steril PBS çözeltisi beyinleri transferi (w / v) ve 4 ° C 'geri dönün.
   NOT: beyinleri sukroz çözeltisi damla kez onlar bir kriyostat üzerinde kesitli hazırdır.
4. Hızla beynini dondurma ve dondurulmuş koronal kesitlerin edinimi için kriyostat tokmak monte. 20 mikron dondurulmuş koronal bölümleri kesmek ve slaytlar monte. Emin olun bölümler seri toplanır.
5. Slaytlar gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. -20 ° C'de de kayar.

9. Hematoksilen & Eosin Boyama

1. Oda sıcaklığına slayt monte donmuş bölümleri ve sıcak atın.
   NOT: Tüm çözümler taze hazırlayın.
2. 2 saat boyunca 50 ° C'ye kadar bir slayt sıcak grubu yerleştirin kayar.
3. Transfer boyama raf kayar. Dip _(GKD 2 O) çifte damıtılmış deiyonize su içinde 10x slaytlar.
4. 5 dakika boyunca% 100 hematoksilin slaytlar inkübe edin. Tihematoksilin beni mor boyama derecesine bağlı olarak optimize edilebilir.
5. Dip slaytlar musluk _H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle _{2 O} temiz musluk H bekletilir.
6. Dip (250 mi,% 70 etanol + 1 mi konsantre hidroklorik asit) asidi alkol içinde 15x kayar.
7. Dip slaytlar musluk _H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle _{2 O} temiz musluk H bekletilir.
8. 2 dakika için% 1 lityum karbonat inkübe edin.
9. Dip slaytlar musluk _H 2 O 4x ve 1 dakika süreyle _{2 O} temiz musluk H bekletilir.
10. 1 dakika boyunca% 95 etanol içinde inkübe edin.
11. Dip slaytlar% 100 Eosin içinde 7x. Eosin batırma sayısı pembe boyama derecesine bağlı olarak modifiye edilebilir.
12. Dip slaytlar% 95 etanol içinde 5 kata.
13. % 95 etanol taze değişiklik Lamı 5x.
14. 1 dakika boyunca% 100 etanol içinde slaytlar inkübe edin.
15. 1 dakika boyunca% 100 etanol içinde taze değişiklik slaytlar inkübe edin.
16. 15 dakika% 100 ksilen slaytlar inkübe edin.
    NOT: Ksilen adımlar veBir çeker ocak içinde gerçekleşmelidir coverslipping.
17. 15 dakika boyunca ksilen taze değişiklikler slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
18. Permount ile lamel ve davlumbaz kurumaya bırakın.
19. Görüntü bir ışık mikroskobu ile kayar.

Sonuçlar

E18 de TSHI + LPS'yi ardından, hematoksilen ve eozin boyama önemli histopatolojik plasenta hem anormallikler (Şekil 1) ve beyinde (Şekil 2) ortaya koymaktadır. E19 ve E21 üzerine incelenen plasenta desidua ve labirent boyunca mikro kanama ve nekroz ile fena halde ödemli bulunmaktadır. Önemli inflamatuar infiltrasyon ve artan damarlanma da görülmektedir. P2 incelenen beyinleri ventrikülomegali ortaya yanı sıra beyaz cevher ve Plaka yapısı nöron kaybı Shams göre. Da...

Tartışmalar

Prematüre Ensefalopati nedeniyle yaralanma mekanizmaları örtüşen etiyolojiler, nörogelişimsel zamanla, insan beyin ağ oluşumu karışıklık, karmaşık etkileşim hayvanlarda modellenmesi zordur ve MSS farklı fenotipleri insan erken doğmuş bebeklerde tezahür hakaretler. EOP hücre tipine özel güvenlik ile ilişkilidir (örneğin, olgunlaşmamış oligodendrositler) ^21, hem de çok çeşitli gelişimsel olarak düzenlenmiş yolları (örneğin, Plaka yapısı, membran taşıy?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Surgical gloves	Biogel	40870
OR Towels	Cardinal Health	287000-008	Sterile
PDI Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers	Kent Scientific Corp.	CL8787
Betadine surgical scrub	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	00023-0312
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Scissors	Roboz	RS-6808
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	F.S.T.	14002-16
Syringe	BD	309628	1 ml
Needle	BD	305122	25G 5/8
Needle	BD	305128	30G 1
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures	Ethicon	1684G	Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides	VWR	48311-703
Hematoxylin	Leica	3801521	Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin	Leica	3801601	Surgipath Eosin
Xylenes	Fisherbrand	X3S-4	Histological Grade
Permount	Fisherbrand	SP15-100
Coverglass	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium Coverglass