Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

Resumo

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Resumo

Encefalopatia da prematuridade (final do período) é um termo que engloba o sistema nervoso central (CNS) anormalidades associadas à prematuridade. Para melhores objetivos translacionais antecedência e descobrir novas estratégias terapêuticas para a lesão cerebral associada ao nascimento prematuro, modelos pré-clínicos de EoP deve incluir mecanismos semelhantes de lesões pré-natal mundial observada em humanos e envolvem múltiplos componentes do sistema materno-fetal-placentária. Idealmente, os modelos devem produzir um espectro semelhante de déficits funcionais no animal maduro e recapitular vários aspectos da fisiopatologia. Para imitar os defeitos humanos sistêmicas da placenta de perfusão, subperfusão placentária e / ou chorioamnionitis associadas com a inflamação induzida por patógeno em parto prematuro cedo, foi desenvolvido um modelo de pré-natal transitória sistêmica a hipóxia-isquemia (tshi) combinado com lipopolissacarídeo intra-amniótica (LPS). Em grávidas ratos Sprague Dawley, tshi via oclusão da artéria uterina on dia embrionário 18 (E18) induz um defeito subperfusão placentária graduada associada com o aumento da lesão do SNC do feto. Quando combinado com injeções de LPS intra-amniótica, inflamação da placenta é aumentada e danos CNS é agravado com a matéria, da marcha e de imagem brancos anormalidades associadas. Pré-natal tshi e tshi + LPS insultos pré-natal atender vários dos critérios de um modelo EoP incluindo recapitulando o insulto intra-uterina, causando perda de neurônios, oligodendrócitos e axônios, perda de subplate e déficits funcionais em animais adultos que imitam aqueles observados em crianças nascidas extremamente prematuro. Além disso, este modelo permite a dissecção da inflamação induzida por tipos de lesões divergentes.

Introdução

Com mais de 12% das crianças nascidas nos Estados Unidos antes da idade gestacional de 37 semanas estimada ^1, lesão cerebral perinatal (PBI) da prematuridade é uma importante causa de incapacidade permanente. PBI da prematuridade, encefalopatia também denominado de prematuridade (EOP), afecta todo o sistema nervoso central (SNC). Lesão CNS muitas vezes começa no útero, e é agravada por processos de pré-natal, incluindo chorioamnionitis e complicações pós-natais, como hipóxia e sepse. PBI de insultos sistêmicos altera neurodesenvolvimento e leva à paralisia cerebral, epilepsia, atraso cognitivo e inúmeros transtornos neuropsiquiátricos afetando regulação emocional, memória e função executiva ^1,2. Embora muito progresso tenha sido feito, uma compreensão limitada de como continua a ser as conseqüências celulares e moleculares da lesão CNS desde o nascimento prematuro traduzir para o grande número de sequelas neurológicas em crianças que nascem prematuros. Esta falta de conhecimento traseiraers diagnóstico em tempo real do CNS gravidade da lesão e dosagem informado das intervenções emergentes. Além disso, as estratégias terapêuticas adequadas à idade para essa população vulnerável paciente ainda imperceptíveis.

Inflamação intra-uterino é muito comum na prematuridade extrema e envolve uma cascata inflamatória materno-fetal-placentária complexo ^3. Infecção intra-uterina é frequentemente subclínica. Achados placentários específicos consistentes com inflamação aguda, ou corioamnionite histológica, são os principais determinantes da resposta inflamatória fetal e são coincidentes com lesão cerebral associada com o nascimento pré-termo ^3-5. Na verdade, a resposta inflamatória fetal tem implicações clínicas distintas para resultados a longo prazo desde o nascimento prematuro. Os bebês que são pequenos para a idade gestacional (PIG) ​​ou que experimentam infecção são excepcionalmente vulneráveis ​​aos déficits neurológicos ^3,4. Corioamnionite é um diagnóstico patológico típico após o nascimento prematuro ^{6,7, e exame histológico revela sinais de inflamação em 70% das placentas de recém-nascidos muito prematuros 4. Além disso, corioamnionite é associado à disfunção cognitiva em dois anos 8. Evidência de subperfusão vascular materno na placenta de recém-nascidos prematuros extremos também está associada com paralisia cerebral na infância 9. O impacto sinérgico de corioamnionite e placentários defeitos de perfusão é bem ilustrado pelo notavelmente alto risco de resultados neurológicos anormais nessa população de pacientes aos dois anos de idade 10,11.}

Para imitar defeitos sistêmicos humanos placentária de perfusão e chorioamnionitis associadas com a inflamação induzida por patógeno, foi desenvolvido um modelo de pré-natal transitória sistêmica a hipóxia-isquemia (tshi) combinado com lipopolissacarídeo intra-amniótica (LPS) em ratos. Nosso objetivo foi adaptar o nosso modelo de tshi sozinho em ratos ^12-16 para incluir a inflamação intra-uterina,para facilitar a modelagem pré-clínico de lesão do SNC associada com o nascimento prematuro. Tshi sozinho revelou perda persistente de células da linhagem oligodendrogliais, neurônios corticais, aumento da morte celular, e níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, com intervalos de isquemia progressivas que levam a um padrão de lesão classificada consistente com lesão cerebral pré-natal ^16. Modificações isquémicos os componentes deste modelo também demonstraram défices de codificação da memória, a memória de curto e longo prazo e alterações músculo-esqueléticas leves em ratos com a idade ^17-19. Na verdade, nós já demonstraram que a combinação de tshi + LPS recapitula as características fisiopatológicas da EoP, incluindo oligodendrócitos e perda neuronal, lesão axonal, inflamação celular e anormalidades funcionais ^20.

Protocolo

Cuidado Institucional e Comissões Use no hospital de ambos Boston Children ea Universidade do Novo México Centro de Ciências da Saúde aprovou todos os procedimentos experimentais.

NOTA: Antes de iniciar o procedimento, selo, esterilizar e autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e campos cirúrgicos. Além disso, preparar medicamentos pós-operatórios em frascos esterilizados, incluindo 0,125% bipivucaine e 0,1 mg / kg de buprenorfina. Também preparar a solução de lipopolissacarídeo (LPS) de forma estéril: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) em solução salina estéril contendo diluir corante azul de Evan.

1. Anestesia

1. Induzir a anestesia em um dia embrionário 18 (E18) grávida de ratos Sprague Dawley com uma mistura de 3% de isoflurano equilibrado de nitrogênio 70% e 30% de oxigênio.
2. Remover rato a partir da câmara de indução e colocar o rato na posição supina drapeado cirúrgica cobertor de circulação de água regulado a 37 ° C. Transferir para anestesia nariz cone e reduzir isofluranível ne a 2%.
3. Gentilmente aplicar pomada oftálmica a cada olho para evitar o ressecamento da córnea. Durante o procedimento de monitorar continuamente a temperatura, taxa de respiração e batimentos cardíacos do animal. Fisiologia materna deveria permanecer estável durante todo o procedimento.

2. Prep Cirúrgica e Scrub

1. Usando pequenas tesouras remover todos os pêlos na região abdominal inferior. Barbear em um padrão retangular com cuidado para evitar entalhar os mamilos ou a geração de erupção de barbear que pode ser irritante para o futuro dos cuidados de filhotes nascidos vivos.
2. Prepare a pele abdominal através da aplicação de iodopovidona e 70% de etanol matagal alternando com cotonetes estéreis. Repita o matagal tal que iodopovidona e 70% de etanol são cada aplicada 3x de maneira alternada. Deixe secar.
3. Confirme profundidade da anestesia via ausência de toe-pitada reflexo. Na ausência do reflexo à dor e estímulos, reduzir o nível de isoflurano a 1%.
4. Usando toalhas cirúrgicos estéreis,armar o animal. Tenha cuidado para colocar as cortinas em um ângulo adequado de tal forma que eles maximizar a quantidade de fluido de irrigação que absorvem enquanto não obstruindo o fluxo sanguíneo para os cornos uterinos.

3. Abdominal Laparotomia

1. Usando um bisturi de fazer uma incisão na linha média de 3 cm de pele abdominal preparado. Sem rodeios dissecar a camada de pele da fáscia abdominal com uma tesoura. Usando fórceps e tesouras cirúrgicas, elevar a camada fascial abdominal e fazer uma incisão da linea alba avascular a ganhar acesso à cavidade peritoneal.
2. Coloque gaze cirúrgica no exterior da incisão e humedecer com solução salina estéril. Utilizando uma pinça sem corte e pressão externa sobre o abdômen, remova cuidadosamente os cornos uterinos da cavidade peritoneal e organizar na gaze umedecida.
3. Evitar cuidadosamente emaranhamento e entre em contato com o intestino. Organizar fetos usando uma pinça, contactando somente o tecido muscular entre sacos amniótico individuais.Expor e isolar as artérias uterinas 4 utilizando dissecção romba.
   NOTA: É preciso ter cuidado para dissecar as artérias uterinas. Tecido circundante e navios próprios são extremamente delicada. Danos aos vasos maternos pode causar sangramento e, em casos graves, morte fetal e materna.

4. Colocação de aneurisma Clipes

1. Coloque um clipe de aneurisma rato G 30 em cada artéria uterina. Assegurar a cessação do fluxo sanguíneo, incluindo proximais e distais impulsos, e escurecimento dos vasos uterinos incluindo placentas individuais. Cubra as pontas expostas e toda campo cirúrgico com gaze e irrigar com solução salina estéril. Tome cuidado para manter o campo úmido com irrigação aproximadamente a cada 10 min.
2. Depois de 60 minutos, retire a gaze e irrigar o campo. Certifique-se de que os cornos uterinos e as embarcações estão devidamente umedecido para remoção clipe bem sucedido. Remova cuidadosamente cada clipe de aneurisma com a pinça. Tome cuidado para não causar trauma para o navio, e maintintegridade do tecido ain durante a remoção.
3. Completamente irrigar os cornos uterinos e campo, tendo o cuidado de remover quaisquer fios soltos de gaze dos sacos amniótico.

5. A injeção de lipopolissacarídeo para amniótico Sacs

1. Na base de cada indivíduo saco amniótico, imediatamente anterior à placa placentária, injectar 100 ul de LPS (4 mg / SAC) com corante azul de Evan em diluída para o fluido amniótico. Use uma pinça sem corte para estabilizar e girar cada saco amniótico para uma posição ideal para injecção. Corante azul de Evan diluído é um agente de contraste que é útil para confirmar a colocação de seringa adequada e injeção.
   NOTA: Use apenas um ultra-fino seringa de 0,3 ml de insulina com anexado 8 milímetros 31 G agulha para as injeções intra-amniótica. Usando agulhas de calibre maiores resultará na perda de líquido amniótico crônica, morte fetal e reabsorção da gravidez. Pequenas quantidades de fuga de líquido amniótico após a remoção da seringa pode ser mitigciado por pressão direta para o saco amniótico. Alguns fetos de ratos pode tolerar um grau de oligohydramnios. No entanto, a perda de líquido amniótico aguda de punção com agulhas de calibre grandes, ou punção acidental, resultando em vazamento de fluido crônica, resulta em perda fetal e, em casos graves, perda de gravidezes vizinhos.
2. Irrigar o cornos uterinos 3x com solução salina estéril.

6. Fechando a Laparotomia

1. Utilizando uma pinça, voltar cuidadosamente os cornos uterinos para a cavidade peritoneal. Garantindo um espaço adequado entre os sacos amniótico ea incisão na linha média, re-aproximar as bordas da camada musculofascial usando uma sutura de seda 3-0 em execução. Esteja ciente da colocação dos sacos amniótico ao fechar a incisão muscular. Tenha cuidado para não suturar em ou através de um saco.
2. Re-aproximar a camada de pele, utilizando uma sutura de seda 3-0 execução, o fechamento da camada de pele.
   NOTA: A laparotomia deve ser fechada em duas camadas de sutura contínua para permitirpara a pele e expansão muscular com o aumento da gestação. Suturas contínuas permitir a tensão ferida uniformemente distribuída. Suturas interrompidas são menos desejado como vários nós são irritantes e podem ser facilmente mastigado pelo rato em cima de recuperação da anestesia. Grampos cirúrgicos não são desejados. Caudas dos nós cirúrgicos deve ser cortado muito curto (<3 mm).
3. Injectar 1 mL de 0.125% de bupivacaína por via subcutânea em torno de bordas da ferida usando uma agulha 26 G. Administrar uma dose de 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea na nuca do pescoço.
4. Desligue o isoflurano e toalha rato seco, se necessário. Coloque na gaiola casa limpa e monitorar a recuperação da anestesia. Certifique-rato não se torne hipotérmica.

7. Recuperação Pós-Operatória e Cuidados

1. Monitorar o rato cada 8-12 horas para 72 horas e em seguida diariamente até filhotes nascem (aproximadamente E22 ou E23). Administrar doses adicionais de buprenorfina q8-12 h / 72 h ou prn como ditado pelo IACUC.
2. Monitorar ratos para sinais de dor, desconforto, sangramento vaginal ou sangramento do sítio cirúrgico. Inspecionar as suturas e incisão e tomar cuidado para garantir rato não está mastigando ou remover suas suturas prematuramente. Embora excepcionalmente raro, os ratos que comprometem suas suturas estão em risco de deiscência da ferida.
   NOTA: Ocasionalmente ratos podem ingerir quantidades excessivas de cama ou não alimentares, denominado pica, como um efeito colateral da administração buprenorfina. Embora muito raro, os ratos devem ser monitorados para pica e obstrução do intestino potencial subseqüente.

8. Tissue Processing e cryosectioning

1. Para se preparar para Hematoxilina e Eosina (H & E) coloração do cérebro pós-natal, remover os filhotes de sua gaiola de origem no dia 2 pós-natal (P2). Usando uma tesoura cirúrgica decapitar filhotes de ratos e retire cuidadosamente o cérebro do crânio.
2. Gota correcção cérebro em um tubo de 15 ml contendo 7 ml de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato(PBS). Coloque cérebro a 4 ° C e fixar durante 72 h.
3. Após 72 horas, transferir os cérebros a uma solução de PBS estéril contendo 30% de sacarose (w / v) e voltar a 4 ° C.
   NOTA: Uma vez que os cérebros cair na solução de sacarose eles estão prontos para ser seccionado em um criostato.
4. Rapidamente congelar cérebros e montar no pilão cryostat para aquisição de cortes coronais congeladas. Cortar 20 mm cortes coronais congeladas e montagem em lâminas. Garantir seções são recolhidas em série.
5. Permitir que as lâminas secar à temperatura ambiente durante a noite. Loja desliza a -20 ° C.

9. Hematoxilina & eosina

1. Tome slides montado cortes congelados e quente à temperatura ambiente.
   NOTA: Prepare todas as soluções fresco.
2. Colocar as lâminas em conjunto uma lâmina de aquecedor para 50 ° C durante 2 h.
3. Transferir as lâminas para um suporte de coloração. Dip desliza 10x em água deionizada bidestilada _(ddH2O).
4. Incubar as lâminas em hematoxilina 100% para 5 min. Time em hematoxilina pode ser otimizada dependendo do grau de coloração roxa.
5. Dip slides em 4x torneira H _{2 O,} e deixe descansar em limpo torneira _H2O para 1 min.
6. Dip slides para 15x ácido em álcool (250 ml etanol a 70% + 1 ml de ácido clorídrico concentrado).
7. Dip slides em 4x torneira H _{2 O,} e deixe descansar em limpo torneira _H2O para 1 min.
8. Incubar em 1% de carbonato de lítio durante 2 min.
9. Dip slides em 4x torneira H _{2 O,} e deixe descansar em limpo torneira _H2O para 1 min.
10. Incubar em etanol a 95% durante 1 min.
11. Dip slides 7x em 100% Eosina. Número de mergulhos em Eosina pode ser modificado dependendo do grau de coloração rosa.
12. Dip slides 5x em etanol a 95%.
13. 5x Dip slides em uma nova mudança de etanol a 95%.
14. Incubar as lâminas em etanol a 100% durante 1 min.
15. Incubar as lâminas em uma nova mudança de etanol a 100% durante 1 min.
16. Incubar as lâminas em 100% de xileno para 15 min.
    NOTA: Os passos xileno elamínulas deve ocorrer em um exaustor.
17. Incubar as lâminas em novas mudanças de xileno para 15 min.
18. Lamela com Permount e deixe secar no exaustor.
19. Imagem slides com um microscópio de luz.

Resultados

Seguindo tshi + LPS em E18, hematoxilina e eosina revela anormalidades histopatológicas significativas, tanto na placenta (Figura 1) e no cérebro (Figura 2). Placentas examinadas em E19 e E21 são grosseiramente edematosa com micro-hemorragia e necrose em toda a decídua e labirinto. Também se observa infiltrado inflamatório significativo e aumento da vascularização. Cérebros examinados em P2 revelar ventriculomegalia, bem como a substância branca e perda subplate neurônio em c...

Discussão

Encefalopatia da prematuridade é difícil de modelar em animais por causa da complexa interação de etiologias, curso do tempo do desenvolvimento neurológico, complexidade da formação da rede cerebral humano, sobrepondo mecanismos de lesão, e os diversos fenótipos de CNS insulta manifesto em prematuros humanos. EoP está associada com as vulnerabilidades no tipo específico de célula (isto é, oligodendrócitos imaturos) ^21, bem como diversas vias desenvolvente reguladas (isto é sub...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Surgical gloves	Biogel	40870
OR Towels	Cardinal Health	287000-008	Sterile
PDI Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers	Kent Scientific Corp.	CL8787
Betadine surgical scrub	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	00023-0312
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Scissors	Roboz	RS-6808
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	F.S.T.	14002-16
Syringe	BD	309628	1 ml
Needle	BD	305122	25G 5/8
Needle	BD	305128	30G 1
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures	Ethicon	1684G	Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides	VWR	48311-703
Hematoxylin	Leica	3801521	Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin	Leica	3801601	Surgipath Eosin
Xylenes	Fisherbrand	X3S-4	Histological Grade
Permount	Fisherbrand	SP15-100
Coverglass	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium Coverglass