Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Abstract

الشبكة الإندوبلازمية (ER) يحتوي على أعلى مستوى الكالسيوم داخل الخلايا، مع تركيز حوالي 5000 أضعاف أكبر من مستويات هيولية. رقابة مشددة على ER الكالسيوم هي ضرورة حتمية للطي البروتين، وتعديل والاتجار. الاضطرابات إلى ER الكالسيوم يمكن أن يؤدي إلى تنشيط الاستجابة البروتين المطوية، وآلية الاستجابة للضغط النفسي ER ثلاثة الشق، وتسهم في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض. القدرة على رصد التغيرات ER الكالسيوم أثناء ظهور المرض وتطور مهم من حيث المبدأ، ولكن التحدي في الممارسة العملية. وقد وفرت الوسائل المتاحة حاليا لرصد ER الكالسيوم، مثل الأصباغ والبروتينات الفلورية التي تعتمد على الكالسيوم ونظرة ثاقبة ديناميات ER الكالسيوم في الخلايا، ولكن هذه الأدوات ليست مناسبة تماما للدراسات في الجسم الحي. وقد أظهرت مختبرنا أن التعديل إلى محطة-كربوكسي من Gaussia luciferase المراسل يمنح إفراز مراسل استجابة لاستنزاف الكالسيوم ER. ووصف الطرق لاستخدام luciferase المراسل مقرها، ER يفرز البروتين مراقبة الكالسيوم (SERCaMP) لفي التجارب المختبرية وتطبيقات المجراة في هذه الوثيقة. هذا الفيديو يسلط الضوء على حقن الكبد، والتلاعب الدوائية للGLuc-SERCaMP، جمع الدم والتجهيز، والمعلمات فحص لرصد الطولي للER الكالسيوم.

Introduction

الشبكة الإندوبلازمية (ER) وظائف في العديد من القدرات الخلوية بما في ذلك لطي البروتين، وإفراز البروتين، والدهون التوازن، وداخل الخلايا مما يشير إلى 1. المركزية إلى وظيفة ER الطبيعية والحفاظ على تركيزات الكالسيوم اللمعية في ~ 5000 مرات تلك التي وجدت في السيتوبلازم 2-4. وينظم هذه العملية كثيفة الاستهلاك للطاقة من قبل أتباز ساركو / الشبكة الإندوبلازمية الكالسيوم (SERCA)، وهو المضخة التي تتحرك أيونات الكالسيوم في ER. وتوسطت هروب رأس المال من الكالسيوم من ER في المقام الأول من قبل ryanodine (RYR) وثلاثي اينوزيتول (IP3R) مستقبلات. لأن العديد من العمليات ER تعتمد على الكالسيوم، وتعطيل مخزن يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد ER وموت الخلايا في نهاية المطاف.

ER وقد لوحظ التقلبات الكالسيوم في الأمراض بما في ذلك القلب والسكري ومرض الزهايمر، وباركنسون 5. ونظرا لطبيعة التدريجي لهذه الأمراض، فقد كان تحدي لتحديد السبب والنتيجة إعادةlationship بين المرضية والتغييرات في مخزن ER الكالسيوم. وقد سمحت لعدد من التقنيات لتحقيق تقدم كبير في فهمنا للديناميات ER الكالسيوم، بما في ذلك الأصباغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs). الأصباغ الكالسيوم تقارب منخفضة، مما يزيد في مضان عندما يتجهون الى كا 2+، يمكن تحميلها في الخلايا لفحص مقصورات التحت خلوية مع تركيزات عالية من الكالسيوم (6). GECIs، مثل D1ER والماسك تسمح لرصد تقلبات الكالسيوم مع مراقبة أكثر دقة لتوطين التحت خلوية 7-9. وقد وصفت مؤخرا، فئة أخرى من GECIs تسمى مؤشرات البروتين شرك عضية قياس الكالسيوم (CEPIA) 10. وثمة نهج ثالث يجمع بين علم الوراثة والكيمياء جزيء صغير هو استهداف استريز صبغ تحميل (TED)، الذي يستخدم إستيراز الكربوكسيل المشفرة وراثيا (تستهدف ER) مع الصبغة الكالسيوم القائم على استر 11.

في حين أن aforالنهج ementioned لها نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة، فإنها يمكن أن توفر معلومات قيمة حول ديناميات الكالسيوم ER من خلال القياسات الحادة من مضان. فهي، مع ذلك، ليس الأمثل للدراسات طولية غالبا المطلوبة لتحقيق تطور المرض. بهدف ابتكار طريقة لرصد ديناميات الكالسيوم على مدى فترات طويلة من الوقت، حددنا وضعت تعديل البروتين لخلق البروتينات مراقبة يفرز الكالسيوم ER (SERCaMPs) 12.

SERCaMP تلتف العديد من القيود المرتبطة منهجيات أخرى، من خلال توفير نهج مينيملي لاستجواب مرارا وتكرارا على مخزن ER الكالسيوم. لقد أثبتنا سابقا أن الببتيد ASARTDL-كربوكسي محطة (ألانين-سيرين-ألانين، أرجينين، ثريونين-الأسبارتيك حمض ليسين) كافية لتعزيز الاحتفاظ ER؛ ومع ذلك، في ظل الظروف التي تسبب انخفاض في ER الكالسيوم، وتسلسل الببتيد لم يعد قادرا على الاحتفاظ ER localizatioن ويفرز البروتين 13. على أساس من التكنولوجيا SERCaMP هو أطرافهم من ASARTDL إلى كربوكسي-محطة للبروتين يفرز (على سبيل المثال Gaussia luciferase المراسل، أو GLuc) بحيث إفراز يتم تشغيلها بواسطة نضوب ER الكالسيوم، وبالتالي خلق مراسل قوية من ER التقلبات الكالسيوم 12. التعبير عن GLuc-SERCaMP عبر وسائل المعدلة وراثيا يمكن السوائل البيولوجية بما في ذلك زراعة الخلايا المتوسطة والبلازما ليتم تحليلها لإجراء تغييرات في النشاط GLuc كمؤشر على التوازن ER الكالسيوم. طريقة تطبيقات لدراسة طولية من التعديلات التقدمية في مخزن الكالسيوم ER سواء في التجارب المختبرية والحية. يتم كتابة بروتوكول التالية باعتباره المخطط العام لاستخدام SERCaMP استنادا GLuc لدراسة ER الكالسيوم، ولكن البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة دليل للSERCaMPs مراسل بديل.

Protocol

1. في المختبر الفحص: كشف SERCaMP بيان من خط الخلية مستقرة SH-SY5Y

  1. لوحة SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL (SERCaMP) في زراعة الأنسجة تعامل وحات في 150،000 الخلايا لكل سم 2 من مساحة السطح. 96 لوحات جيدة، على سبيل المثال، البذور 50000 خلايا لكل بئر (الشكل 1A). تنمو الخلايا SH-SY5Y في DMEM (الجلوكوز المرتفع، GlutaMAX، البيروفات) + النمو البقري 10٪ مصل + 1X البنسلين / الستربتومايسين.
    1. خلايا مرور ما يصل إلى 15 مرة (الشكل 1B). لم يتم اختباره أعلى عدد مرور.
    2. العودة إلى خلايا حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5.5٪ CO 2 واحتضان بين عشية وضحاها.
  2. قبل العلاج التجريبي (ق)، وجمع عينة خط الأساس لكل بئر من خلال نقل 5 ميكرولتر من ثقافة طاف إلى مبهمة الجدران 96 لوحة جيدا. قبل جمع، اضغط بلطف لوحة على جميع الاطراف ودوامة لتجنب الآثار التدرج. ختم لوحة مبهمة مع الصورة لاصقةورقة إيلينغ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى وقت الفحص الانزيمي.
    ملاحظة: يفرز GLuc-SERCaMP غير مستقرة جدا في مستنبت الخلية. ذكرنا سابقا قد فقدت حوالي 5-10٪ من النشاط GLuc بعد حضانة 72 ساعة على 37 درجة مئوية (حضنت على الخلايا SH-SY5Y) 12.
  3. علاج الخلايا كما المطلوبة لدراسة استنزاف الكالسيوم ER (على سبيل المثال البيئية، الدوائية، التلاعب الجيني). تجنب التعرض الطويل للالبيئة المحيطة (خارج الحاضنة رقابة) كما تغييرات درجة الحموضة سوف تحدث بسرعة في الغلاف الجوي CO 2. إضافة HEPES إلى مستنبت في 20 ملي، لتحقيق الاستقرار في درجة الحموضة 14، إذا كانت هناك حاجة التلاعب فترات طويلة. تجنب التعرض للضوء عند استخدام HEPES في مستنبت 15.
    1. مراقبة إيجابية: علاج الخلايا مع 100 نيوتن متر thapsigargin (تيراغرام) أو 50 ميكرومتر حمض cyclopiazonic (CPA) لمدة 4-6 ساعة لإجراء التجارب في الخلايا SH-SY5Y. الاستجابة القصوى في خطوط الخلايا الأخرى قد تتطلب حضانات أطول أو concen مختلفةtrations من المركبات.
    2. السيطرة السلبية: اجمع مستنبت من خلايا SH-SY5Y الوالدين. في تجربتنا، والتلألؤ الخلفية لهذا الاختبار هو أقل من 0.05٪ من إفراز الخلايا القاعدية من SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP مستقرة.
  4. جمع وتخزين عينات 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة في timepoints المطلوب، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  5. تقييم النشاط الأنزيمي في المتوسط ​​على النحو المبين في المادة 5.
  6. دراسة GLuc داخل الخلايا بواسطة طخة مناعية أو التلألؤ الفحص.
    1. لطخة مناعية: الخلايا ليز في تعديل عازلة RIPA يحتوي على 50 ملي تريس (7.4 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.25٪ deoxycholate الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1٪ NP40، ومثبطات الأنزيم البروتيني. منفصلة على هلام SDS-بولكرلميد ونقل إلى غشاء 0.20 ميكرومتر PVDF. احتضان الغشاء مع GLuc الأضداد (1: 2000 تمييع) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أداء حضانة الأجسام المضادة ويغسل الغشاء الثانوية حسب بروتوكول المعرفة من قبل المستخدم للكشف عن كاشف الاختيار.
    2. لفحص التلألؤ (الشكل 2): تنفيذ الخطوات التالية على الجليد:
      1. إزالة كافة المتوسطة من الآبار من لوحة زراعة الأنسجة وشطف مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
      2. إضافة 75 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ NP40 ومثبطات الأنزيم البروتيني إلى كل بئر.
      3. تدوير لوحة على شاكر المداري (120 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. ماصة بلطف المحللة صعودا وهبوطا باستخدام pipettor الأقنية، وتجنب فقاعات الهواء. نقل 5 ميكرولتر من المحللة إلى لوحة مبهمة وتقييم التلألؤ على النحو المبين في المادة 5.

2. في المختبر الفحص: ترنسفكأيشن عابر من خلايا مخلد مع SERCaMP

ملاحظة: وقد لاحظنا أن الإجراءات ترنسفكأيشن عابرة يمكن أن تحدث الإجهاد الخلوي وفظة اللاحقة الاستجابة GLuc-SERCaMP. وقد تم تطوير هذا النهج التالي للتقليل من ترنسفكأيشن ممثل المؤسسة النظام الأوروبي في الخلايا SH-SY5Y. قد تكون هناك حاجة تعظيم الاستفادة من هذا الإجراء (بما في ذلك اختيار ترنسفكأيشن الكاشف) للخطوط الخلايا البديلة. عندما يكون ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام خطوط الخلايا مستقرة أو أساليب تنبيغ الفيروسية المبينة في المادتين 1 و 3 على التوالي.

  1. لوحة الخلايا SH-SY5Y في صحن 100 ملم في 4 × 10 6 خلايا. وهذا الطبق يكون كافيا لإعادة البذور حوالي 300 بئر (96 شكل لوحة جيدا) بعد إجراء ترنسفكأيشن.
  2. خلايا Transfect مع Xfect كاشف استخدام 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (ترميز GLuc-SERCaMP) و 6 ميكرولتر من Xfect كاشف. DNA على نطاق وXfect كاشف وفقا للسفن الثقافة أكبر أو أصغر.
  3. العودة الخلايا الحاضنة لمدة 48 ساعة.
  4. يعرض للتريبسين الخلايا وRESEED إلى 96 لوحات جيدة في 60000 خلايا لكل بئر. اتبع الخطوات التالية المبينة في الفرع 1.

3. في المختبر الفحص: الفيروسية التعبير بوساطة ناقلات من GLuc-SERCaMP

خيمة "> ملاحظة: الفيروسية الغدة المصاحب (AAV) التعبئة والتغليف ناقلات 16 و 12 و تنقية الفيروسة البطيئة إنتاج 13 تم الإبلاغ سابقا.

  1. عيار GLuc-SERCaMP AAV باستخدام بادئات وتحقيقات التالية: التمهيدي إلى الأمام، 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3؛ التمهيدي العكسي، 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3؛ مسبار (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 المسمى)، 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 "لالكمي PCR.
    1. إعداد منحنى قياسي قبل linearizing البلازميد التي تحتوي على GLuc وتنقية باستخدام الحمض النووي تدور عمود (على سبيل المثال Machery-ناجل NucleoSpin جل وPCR تنظيف). Quantitate الحمض النووي عن طريق فصل على هلام الاغاروز جنبا إلى جنب مع سلم الشامل. إعداد 1:10 التخفيفات من الحمض النووي من 100 غ / مل إلى 10 FG / مل في برنامج تلفزيوني. حساب نسخة / مل من الحمض النووي البلازميد GLuc في كل من تركيزات على أساس الوزن الجزيئي للالبلازميد.
    2. تمييع الأسهم AAV في برنامج تلفزيوني (التخفيف المناسبة سوف تعتمد علىالمعلمات من إعداد الفيروسي وتحدد تجريبيا).
    3. تشغيل تفاعل PCR في نظام الوقت الحقيقي PCR باستخدام الشروط التالية: 95 ° C × 5 دقائق، 94 ° C × 20 ثانية، و 60 ° C × 1 دقيقة لمدة 41 دورات. حساب نسخ / مل باستخدام المنحنى القياسي.
  2. عيار الفيروسة البطيئة مع P24 LENTI-X عيار السريع عدة. ذوبان الجليد قسامات lentiviral على الجليد ويخفف من البروتين P24 التحكم في SH-SY5Y المتوسطة.
    1. تمييع الفيروسة البطيئة مثل أنه سوف تقع على منحنى القياسية (على سبيل المثال 1: 20000 أو 1: 100،000). فإن عامل التخفيف المطلوبة تختلف بناء على معايير إعداد lentiviral ويجب أن تحدد تجريبيا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لجميع الخطوات اللاحقة.
  3. لوحة الخلايا إلى 96 لوحات جيدة. لخلايا SH-SY5Y، يمكن اتباع الإجراءات الطلاء المبينة في الفرع 1. لالجرذ الخلايا العصبية القشرية الأولية، والخلايا ينبغي عزل والمصنفة على لوحات مغلفة بشكل مناسب لالصورة الموصوفة سابقا 16. الحفاظ على الخلايا العصبية القشرية الأولية الفئران في Neurobasal المتوسطة تستكمل مع 1X B27 و 500 ميكرومتر L-الجلوتامين. أداء البورصات متوسطة نصف كل يوم.
  4. تنبيغ الخلايا مع فيروس. هدف تنبيغ الفيروسية هو تحقيق انخفاض مستوى التعبير، كما يوفر Gaussia luciferase المراسل إشارة قوية.
    1. AAV تنبيغ الخلايا SH-SY5Y: تنبيغ في اليوم التالي الطلاء. تمييع AAV إلى 6.0 × 10 7 VG / ميكرولتر في AAV تخفيف العازلة (PBS + 0.5MM MgCl 2). إضافة 5 ميكرولتر من AAV المخفف (3.0 × 10 8 VG؛ وزارة الداخلية ما يقرب من 6000) لكل بئر من 96 لوحة جيدا (الشكل 3A). استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات ناقلات فيروسية.
    2. AAV تنبيغ الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية: تنبيغ 6-8 أيام بعد الطلاء. تمييع AAV إلى 4.0 × 10 6 VG / ميكرولتر العازلة في AAV التخفيف. إضافة 5 ميكرولتر من AAV المخفف (2.0 × 10 7 VG؛ وزارة الداخلية ما يقرب من 350) لكل بئر من96 لوحة جيدا (الشكل 3B). وزارة الداخلية الأمثل ينبغي أن تحدد تجريبيا لأنواع الخلايا الأخرى. استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات ناقلات فيروسية.
    3. تنبيغ Lentiviral الخلايا SH-SY5Y: تنبيغ في اليوم التالي الطلاء. تمييع الفيروسة البطيئة إلى 20 جزء من الغرام / ميكرولتر P24 (تحديد تركيز باستخدام عدة titering) في محلول ملحي متوازن هانك. إضافة 5μl من الفيروس المخفف لكل بئر (100 خريج من P24، أي ما يعادل 1،250،000 الجسيمات lentiviral، أو ~ 1250 تعليمات الاستخدام) من 96 لوحة جيدا تحتوي على 100 حجم ميكرولتر. حجم وفقا لصيغ أكبر. استخدام التبييض 10٪ لتعطيل النفايات الفيروسية.
  5. جمع عينة قبل المعالجة المتوسطة وتبدأ العلاجات التجريبية 48 ساعة (SH-SY5Y) أو 5-7 أيام (الفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية) بعد تنبيغ.

4. في فيفو SERCaMP الفحص

ملاحظة: قبل القيام بأي إجراءات الحيوان يجب التأكد من الحصول على الموافقة اللازمة من خلال مؤسستكم. كلجراحات البقاء على قيد الحياة إلى أن يتم تحت ظروف معقمة مع التخدير المناسب. وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة أدناه وهي في الامتثال للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة ACUC.

  1. الأدوات الجراحية الأوتوكلاف قبل بدء الجراحة (121 ° C، 30 دقيقة التعقيم، 20 دقيقة وقت جاف). تنظيف جميع الأدوات في ultrasonicator التالية كافة الإجراءات وقبل التعقيم على الفور. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة البقاء على قيد الحياة. لعملية جراحية تتطلب الحيوانات متعددة، يمسح الأدوات الجراحية مع الكحول 70٪، ultrasonicate وحبة تعقيم بين الفئران. الرجوع إلى قائمة المواد للأدوات اللازمة.
  2. إعداد الفئران لإجراء عملية جراحية. نحن هنا استخدام الذكور سبراغ داولي (180-200 ز).
    1. تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين الغاز لمدة 3 دقائق (4-5٪ الأيزوفلورين تسليمها في 1000 سم مكعب / دقيقة)، يليه الحقن داخل الصفاق من زيلازين (8 ملغ / كلغ) والكيتامين (80 ملغ / كلغ). تطبيق مرهم للعين لحماية القرنيات من الجفاف. Bجراحة egin بمجرد أن الفئران هي تخدير عميق كما يتضح من عدم الانسحاب لا ارادي التالية الذيل أو قرصة القدم.
    2. حلق منطقة البطن أقل قليلا من أضلاعه (منخفض المنطقة الصدرية) إلى المنطقة منتصف البطن. فرك المنطقة الجراحية ثلاث مرات، بالتناوب الكحول 70٪ وBetadine فرك. وضع الفئران في موقف ضعيف على منطقة العمليات الجراحية المعقمة مع الستائر الجراحية المعقمة.
  3. تمييع AAV-GLuc-SERCaMP إلى 7.6 × 10 9 VG / مل (تركيز النهائي). مزيج جيد من قبل قلب الأنبوب.
    ملاحظة: مجموعة من تركيز الفيروس يمكن أن تختلف (الشكل 4).
    1. الماصة 105 ميكرولتر من AAV المخفف في طبق العقيمة. استخدام إبرة عيار 30 لجمع الفيروس إلى حقنة.
  4. إجراء عمليات جراحية لفضح الكبد وحقن AAV-GLuc-SERCaMP.
    1. قبل إجراء شق في البطن، وتطبيق 0.25٪ بوبيفكين إلى منطقة شق. باستخدام مشرط، وجعل شق أفقي تحت القفص الصدري (ا ف بتقريبية 2-3 سم). بلانت تشريح لفصل النسيج الضام من اللحمة.
    2. قطع عضلات البطن، وفضح الفص الأيمن من الكبد وسطي.
      ملاحظة: قد يتم حقنه فصوص إضافية بناء على طلب نهاية.
    3. وضع الحيوان تحت المجهر الجراحي وضبط للحصول على الفص الأيمن من الكبد وسطي في مجال الرؤية. حقن الفيروس إلى حمة من الفص وسطي. 3 مواقع منفصلة، ​​ما يقرب من 33 ميكرولتر في الموقع.
      ملاحظة: ترك الإبرة في النسيج لمدة 5-10 ثانية بعد الحقن لضمان تسليم حجم الحقن بأكمله.
    4. خياطة عضلات البطن والجلد على حدة وإضافة Neosporin استخدام القطن يميل قضيب. وضع الفئران في غرفة الإنعاش حتى استعاد وعيه والفئران غير قادرة على الحفاظ على وضع مستقيم. لا تترك الجرذان (ق) غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. منزل منفردة حتى شفى شق وتم إزالة الغرز (7-14 يوما).
      ملاحظة: كما في المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية بعد الجراحة، والحفاظ على سجل الجراحية. علق بطاقة قفص مع الإجراء والتاريخ ومعرف التجربة، ووزن الجسم، ويوم من الجراحة. ألم / الشدة والإنتاج البراز، والنشاط، والمواد الغذائية واستهلاك المياه والتي يتعين رصدها وتسجيلها جراحة 3 أيام لما بعد. يتم توفير تسكين الألم بعد العمليات الجراحية عن طريق إضافة اسيتامينوفين لمياه الشرب (450 ملغ / 100 سم مكعب) على الرغم من أننا لا نلاحظ عادة علامات الألم أو الضيق بعد الجراحة.
  5. بدء جمع الدم الذيل بعد 4-7 أيام الحقن. إعداد أنابيب جمع الدم عن طريق وضع العلامات وقبل وزنها. إضافة 50 ميكرولتر الهيبارين (1000 U / مل) إلى كل أنبوب.
  6. مكان الفئران في غرفة التخدير الأيزوفلورين لمدة 3 دقائق (4-5٪ الأيزوفلورين تسليمها في 1000 سم مكعب / دقيقة). إزالة الفئران من غرفة ومكان في مخروط الأنف (2-3٪ الأيزوفلورين ألقاها في 500 سم مكعب / دقيقة). جمع الدم يمكن أن تبدأ بمجرد تخدير الفئران عميقا كما يتبين من عدم الانسحاب لا ارادي التالية ذيل بيNCH.
    1. باستخدام مقص العقيمة قطع طرف الذيل (1-2 ملم) وجمع الدم قطرة من الحكمة في شغل ما قبل أنبوب الهيبارين. جمع الدم حتى تصل إلى حجم أكبر من 2: 1 الدم إلى نسبة الهيبارين (> 100 ميكرولتر الدم / 50 ميكرولتر الهيبارين). يمكن تعديل مجلدات جمع الدم على أساس التصميم التجريبي. استخدام قضيب من القطن مبللة لتطبيق مسحوق قابض على الذيل لوقف النزيف.
    2. أنابيب تخزين الدم عند 4 درجات مئوية إذا جمع عينات لاحقة. مسح مقص مع لوحة الإيثانول وحبة تعقيم بين المجموعات.
    3. تزن أنابيب جمع وضبط مع الهيبارين للحصول على نسبة 2: 1 (الدم: الهيبارين). وهذه الخطوة تطبيع كمية الهيبارين في كل عينة (الجدول 1).
    4. أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل طاف (البلازما) إلى أنبوب جديد وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى وقت فحص luciferase المراسل (القسم 5).
      ملاحظة: تخزين العينات في 4 درجات مئوية تصل إلى 72 ساعة قبل الفحص الانزيمي ديه متأثير inimal على التلألؤ (الشكل 5A). تصل إلى 3 دورات تجميد أذاب عينات البلازما لها أي تأثير على التلألؤ (الشكل 5B).
  7. إدارة Thapsigargin (مراقبة إيجابية):
    1. إعداد thapsigargin عن طريق تمييع في الإيثانول إلى تركيز النهائي من 2.5 ملغ / مل. حقن thapsigargin في 1 ملغ / كغ الملكية الفكرية في أسفل البطن.
      ملاحظة: Thapsigargin يزيد الناجمة عن تخثر الصفائح الدموية الثرومبين 17 ويمكن أن تجعل جمع الدم من ذيل أكثر صعوبة.
  8. Gaussia luciferase الفحص:
    1. ذوبان الجليد في عينات البلازما على الجليد.
      ملاحظة: للحصول على الدراسات الطولية، وذوبان الجليد وأداء التلألؤ فحص لجميع العينات timepoint في نفس اليوم (باستخدام إعداد واحد من الركيزة).
    2. نقل 10 ميكرولتر من البلازما إلى لوحة المسورة مبهمة وقياس النشاط الأنزيمي كما هو موضح في القسم 5. تشغيل 3-4 مكررات التقنية لكل عينة البلازما.
  9. Euthanasiل
    ملاحظة: الاستفادة من التكنولوجيا SERCaMP هي القدرة على طوليا رصد ER الكالسيوم. اعتمادا على المعلمات التجريبية ونقطة النهاية التحليلات والحيوانات إلى أن يتم التخلص عن طريق اتخاذ تدابير مناسبة لنقطة النهاية التحليلات وفقا للمبادئ التوجيهية ACUC المؤسسية.

5. التلألؤ الفحص

  1. إعداد الحلول coelenterazine (CTZ) الأسهم عن طريق تمييع مجمع في الميثانول المحمض (30 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك إلى 3 مل من الميثانول) إلى 20 ملم. إعداد قسامات تستخدم مرة واحدة وتخزينها في -80 ° C.
  2. إعداد الركيزة العمل في يوم الفحص.
    1. لفحوصات في المختبر، وتمييع coelenterazine إلى 8 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني، على سبيل المثال إضافة 10 ميكرولتر من 20 ملي CTZ الأسهم إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني (الشكل 6A، B).
    2. لفي الجسم الحي المقايسات، وتمييع coelenterazine إلى 100 ​​ميكرومتر في برنامج تلفزيوني، 500 ملي حمض الاسكوربيك، 5 ملي كلوريد الصوديوم.
  3. احتضان استعداد CTZ لمدة 30 دقيقة على الأقلفي درجة حرارة الغرفة قبل البدء في الفحص.
    ملاحظة: غالبا ما تتضمن هذه الخطوة في Gaussia المقايسات luciferase المراسل كما أن هناك تقارير تسوس الركيزة السريع في أول دقيقة 30 بعد إعداد. لم نلحظ هذا التأثير في نظامنا (الشكل 6C)؛ ومع ذلك، فإننا غالبا ما تشمل الخطوة الحضانة كما وجدنا أي تأثير سلبي على الفحص.
  4. استخدام قارئ لوحة قادرة على رصد تلألؤ بيولوجي ومجهزة حاقن الركيزة. رئيس الخطوط مع الركيزة.
    ملاحظة: الركيزة الأولى من خلال خطوط يمكن أن يكون عرضة للتدهور. لتجنب قراءات منخفضة بشكل مصطنع لعينات مبكرة، وضخ 20-30 آبار فارغة (تحميل لوحة فارغة على القارئ) قبل قياس العينات التجريبية.
  5. ضخ 100 ميكرولتر من الركيزة إلى جيدا، يهز سرعة متوسطة لمدة 5 ثوان، وقياس انبعاث الضوء. لوحة القارئ BIOTEK التآزر II، دمج انبعاث الضوء خلال 0.5 ثانية (في المختبر عينات) و 5 ثانية (فيفيفو عينات) لقراءة الخطوة. تحسين المعلمات قارئ لوحة لأداء الاختبار المثالي.
    ملاحظة: المعارض Gaussia luciferase المراسل حركية فلاش مع تسوس إشارة السريع (مقارنة مع توهج حركية لاحظ مع luciferases أخرى). ويتأثر حركية مضة من GLuc بواسطة المصل في مستنبت الخلية (الشكل 7A)، وتسليط الضوء على أهمية السيطرة على تكوين المتوسط ​​عبر العينات. بسبب تسوس السريع من التألق بعد إضافة الركيزة (حركية فلاش)، والوقت بين حقن وقراءة خطوات يجب أن تكون موحدة لجميع العينات. يجب تعيين قارئ لوحة لحقن الركيزة إلى بئر، وانتظر الوقت المحدد (على سبيل المثال نستخدم خطوة هزة 5 ثانية)، وقراءة ذلك جيدا. مضيفا الركيزة لوحة كاملة قبل القراءة يشكل تحديا كبيرا ما لم يمكن إضافة الركيزة لجميع الآبار في وقت واحد. إذا حاقن غير متوفر، قضية يمكن التحايل جزئيا التي يحتضنها لوحة لمدة 10 دقيقة بين الركيزة عدينشوئها والقياس (وبالتالي تجنب الجزء الحاد في منحنى الاضمحلال) (الشكل 7B).
  6. تكرار الحقن، ووقت الانتظار، وقراءة خطوات لكل بئر على طبق من ذهب.

النتائج

يسمح أسلوب GLuc-SERCaMP لتقييم ER الكالسيوم عن طريق أخذ عينات السوائل خارج الخلية. يمكن إدراج عدة عناصر تحكم في التصميم التجريبي لتعزيز تفسير النتائج. أولا، استخدام مراسل يفرز بشكل جوهري (على سبيل المثال GLuc دون ASARTDL C-محطة أو "GLuc رقم بطاقة") يمكن استخدامها لتقييم آث?...

Discussion

هذا البروتوكول يبرز في المختبر والمرافق الحيوية لGLuc-SERCaMP لمراقبة استنزاف ER الكالسيوم. على الرغم من أن التعديل البروتين لتوليد SERCaMP يبدو أن التعميم على البروتينات مراسل الأخرى 12، اخترنا Gaussia luciferase المراسل لمن القوي (200-1،000 أكبر أضعاف) تلألؤ بيولوجي...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mL tubesFisher 02-682-550
10% NP-40 solution Pierce28324for intracellular GLuc assays
1mL luer-lok syringesFisher14-823-30
200uL filter tipsRaininRT-L200F
3-0 surgical suturesFisherNC9598192
30g needlesFisher Scientific14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheetsThermoAB-0558
Alcohol prep padsFisher22-246-073
Anesthesia Auto Flow SystemE-Z AnesthesiaEZ-AF9000
Animal recovery chamberLyon VetICU-912-004
B27 supplementLife Technologies17504-044
Betadine solutionFisherNC9386574
BleachCloroxn/a
Bovine growth serumThermoSH30541.03
Coelenterazine, NativeRegis Technologies1-361204-200
Cotton tipped applicatorsPuritan806-WC
Cutting needles 3/8 circle suturesWPI501803
Digital ultrasconic cleanerFisher ScientificFS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvateLife Technologies10569-010
DNA mass ladderLife Technologies10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)Nanolight321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)New England BiolabsE8023S1:2000 (WB)
Germinator 500CellPoint ScientificDS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)Fisher07-200-589
Hank's balanced salt solutionLife Technologies14175-095
HeparinAllmedtech63323-276-02
IsofluraneButler Schein29404
KetamineHenry Schein995-2949
Kwik Stop Styptic powderButler Schein5867
L-glutamineSigmaG8540
MethanolFishera452-4
Microfuge 22R CentrifugeBekman Colter368831
NeosporinFisher19-898-143
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nikon StereoscopeNikonSMZ745T
Nucleospin Gel and PCR CleanupMachery-Nagel740609
P200 pipetRaininL-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kitClontech632200
PCR film sealFisherAB0558
Penicillin/streptomycinLife Technologies15140-122
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
ReFresh Charcoal Filter canisterE-Z AnesthesiaEZ-258
Scalpel blades, #10Fine Science tools Inc10010-00
SD rats 150-200gCharles RiverRatsrats ordered at 150-200g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tagsNational Band and Tag co1005-1
Sterile surgical drapesBraintree ScientificSP-MPS
Synergy 2 plate readerBioTekn/a
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
ThapsigarginSigmaT9033harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mixLife TechnologiesK4975-00
Xfect Transfection reagentClontech631318
XylazineValley Vet468RX

References

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103 SERCaMP ER Gaussia luciferase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved