Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

Riepilogo

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Abstract

Il reticolo endoplasmatico (ER) contiene il più alto livello di calcio intracellulare, con concentrazioni di circa 5000 volte superiore a livelli citoplasmatici. Stretto controllo sulla ER calcio è un imperativo per ripiegamento proteico, la modifica e il traffico. Perturbazioni ER calcio può provocare l'attivazione della risposta unfolded proteina, un meccanismo di risposta allo stress ER tre poli, e contribuire alla patogenesi di varie malattie. La capacità di monitorare alterazioni ER calcio durante l'insorgenza e la progressione della malattia è importante in linea di principio, ma stimolante in pratica. Metodi attualmente disponibili per monitorare ER calcio, come coloranti e proteine ​​fluorescenti calcio-dipendente, hanno fornito visione dinamica ER calcio nelle cellule, tuttavia questi strumenti non sono adatti per gli studi in vivo. Il nostro laboratorio ha dimostrato che una modifica al carbossi-terminale della luciferasi Gaussia conferisce la secrezione del reporter in risposta aER deplezione di calcio. I metodi per l'utilizzo di una base luciferasi, ER secreta proteina monitoraggio calcio (SERCaMP) in vitro e per applicazioni in vivo sono qui descritti. Questo video mette in evidenza le iniezioni epatiche, manipolazione farmacologica del GLUC-SERCaMP, la raccolta e il trattamento del sangue, e parametri del test per il monitoraggio longitudinale ER calcio.

Introduzione

Il reticolo endoplasmatico (ER) funzioni in molte capacità cellulari tra cui il ripiegamento delle proteine, la secrezione di proteine, lipidi omeostasi, e intracellulare di segnalazione ^1. Centrale alla funzione ER normale è mantenere le concentrazioni di calcio luminali in ~ 5.000 volte quelli trovati nel citoplasma ^2-4. Questo processo intensità energetica è regolata dalla ATPasi sarco / reticolo endoplasmatico calcio (SERCA), una pompa che si muove ioni calcio al pronto soccorso. Passaggio di calcio dalle ER è mediato principalmente dal rianodina (RyR) e trifosfato inositolo (IP3R) recettori. Poiché molti processi ER dipendono calcio, interrompendo il negozio può portare a ER stress e la morte delle cellule.

ER disregolazione del calcio è stata osservata in malattie tra cui cardiomiopatia, diabete, morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e ^5. A causa della natura progressiva di queste malattie, è stato impegnativo per delineare la causa-effetto rerappor- tra la patogenesi e alterazioni del negozio ER calcio. Un certo numero di tecnologie hanno permesso significativi progressi nella nostra comprensione delle dinamiche ER calcio, compresi i coloranti e gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS). Coloranti di calcio a bassa affinità, che aumentano di fluorescenza quando si lega a Ca ^2+, possono essere caricati in cellule per esaminare compartimenti subcellulari con elevate concentrazioni di calcio ^6. GeCIS, quali D1ER e catcher consentire un monitoraggio delle fluttuazioni di calcio con un controllo più preciso della localizzazione subcellulare ^7-9. Recentemente, un'altra classe di GECIS chiamati indicatori di proteine ​​organelli-intrappolato-calcio misura (Cepia) sono stati descritti ^10. Un terzo approccio che combina la genetica e la piccola molecola chimica è mirata-esterasi dye carico (TED), che utilizza un carbossilesterasi geneticamente codificato (mirato al pronto soccorso), con un calcio di colorante a base di ^estere-11.

Mentre il aforapprocci ementioned hanno punti di forza e debolezze intrinseche, possono fornire informazioni preziose dinamiche di calcio ER attraverso misure acuti di fluorescenza. Sono, tuttavia, non è ottimale per gli studi longitudinali spesso necessarie per determinare la progressione della malattia. Con l'obiettivo di escogitare un metodo per monitorare dinamiche di calcio per periodi di tempo prolungati, abbiamo identificato e sviluppato una modifica proteina per creare le proteine ​​secrete calcio ER supervisione (SERCaMPs) ^12.

SERCaMP elude diversi limiti associati con altre metodologie, fornendo un approccio mini-invasivo per interrogare più volte il negozio ER calcio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il peptide ASARTDL carbossiterminale (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-aspartico-leucina) è sufficiente a favorire la ritenzione ER; Tuttavia, in condizioni che causano diminuzioni ER calcio, la sequenza di peptidi non è più in grado di trattenere ER localization e la proteina è secreta ^13. La base della tecnologia SERCaMP è l'appendice di ASARTDL al carbossi-terminale di una proteina secreta (es Gaussia luciferasi o Gluc) tale che la secrezione è innescato dalla deplezione ER calcio, creando così un robusto giornalista di ER calcio disregolazione ^12. L'espressione di GLUC-SERCaMP tramite metodi transgenici permette fluidi biologici tra cui coltura cellulare di medio e di plasma da analizzare per i cambiamenti nell'attività GLUC come indicatore dell'omeostasi ER calcio. Il metodo ha applicazioni per lo studio longitudinale alterazioni progressive nell'archivio calcio ER sia in vitro che in vivo. Il protocollo che segue è scritto come un quadro generale per l'uso di base-GLUC SERCaMP studiare ER calcio omeostasi, ma il protocollo può servire come guida per SERCaMPs giornalista alternative.

Protocollo

1. In vitro: Individuare SERCaMP uscita da una linea cellulare SH-SY5Y stabile

1. Piastra SH-SY5Y-GLUC-ASARTDL (SERCaMP) in coltura trattata piastre a 150.000 cellule per cm ^{2 di superficie.} Per piastre da 96 pozzetti, per esempio, seme 50.000 cellule per pozzetto (Figura 1A). Crescere cellule SH-SY5Y in DMEM (alto glucosio, Glutamax, piruvato) + 10% della crescita bovina di siero + 1x penicillina / streptomicina.
   1. Cellule Passage fino a 15 volte (Figura 1B). Numero più elevato passaggio non è stato testato.
   2. Ritorno a cellule incubatore umidificato a 37 ° C con 5,5% di CO ₂ e incubare durante la notte.
2. Prima del trattamento sperimentale (s), raccogliere un campione di riferimento per ciascun pozzetto con il trasferimento di 5 ml di cultura surnatante in un opaco murato 96 pozzetti. Prima di raccogliere, picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati e agitare per evitare effetti di sfumatura. Sigillare la piastra opaca con un adesivo sfoglio di Ealing e conservare a 4 ° C fino al momento del test enzimatico.
   Nota: Secreted GLUC-SERCaMP è molto stabile nel terreno di coltura. Abbiamo precedentemente riportato circa il 5-10% di attività Gluc è stato perso dopo una incubazione 72 ore a 37 ° C (incubato sulle cellule SH-SY5Y) ^12.
3. Il trattamento di cellule, se lo desideri esaminare ER calcio esaurimento (ad esempio ambientale, farmacologico, manipolazioni genetiche). Evitare l'esposizione a lungo condizioni ambientali (al di fuori dell'incubatore controllata) come variazioni di pH sarà rapidamente verificarsi in CO ₂ atmosferica. Aggiungere HEPES al mezzo di coltura a 20 mM, per stabilizzare il pH ^14, se sono necessarie manipolazioni prolungate. Evitare l'esposizione alla luce durante l'utilizzo HEPES in terreno di coltura ^15.
   1. Controllo positivo: Trattare cellule con 100 tapsigargina nM (Tg) o 50 mM acido ciclopiazonico (CPA) per 4-6 ore per esperimenti in cellule SH-SY5Y. Risposta massima in altre linee cellulari possono richiedere incubazione più lunghi o diverso concenstrazioni di composti.
   2. Controllo negativo: terreno di coltura Raccogliere da cellule SH-SY5Y parentali. Nella nostra esperienza, la luminescenza di fondo per questo dosaggio è inferiore al 0,05% della secrezione basale di cellule stabili SH-SY5Y-GLUC-SERCaMP.
4. Raccogliere e campioni negozio 5 microlitri di media condizionata al timepoints desiderati, come indicato al punto 1.2.
5. Valutare l'attività enzimatica nel medio come indicato nella Sezione 5.
6. Esaminare GLUC intracellulare da immunoblot o dosaggio luminescenza.
   1. Per immunoblot: cellule in tampone RIPA Lisare modificato contenente Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,25% sodio desossicolato, 1 mM EDTA, 1% NP40, e inibitori della proteasi. Separato su gel di SDS-poliacrilammide e trasferimento a membrana PVDF 0.20 micron. Incubare a membrana con GLUC anticorpi (1: 2.000 diluizione) notte a 4 ° C. Eseguire incubazione anticorpi e membrana lavaggi secondarie come da protocollo definito dall'utente per reagente rilevamento di scelta.
   2. Perluminescenza test (Figura 2): eseguire le seguenti operazioni sul ghiaccio:
      1. Rimuovere tutti i media da pozzetti della piastra di coltura tissutale e risciacquare con 200 ml di PBS freddo.
      2. Aggiungere 75 ml di tampone di lisi contenente Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% NP40 e inibitori della proteasi in ciascun pozzetto.
      3. Ruotare la piastra su un agitatore orbitale (120 rpm) a 4 ° C per 20 min.
      4. Pipetta delicatamente il lisato su e giù con una pipetta multicanale, evitando bolle d'aria. Trasferire 5 ml di lisato ad una piastra opaco e valutare luminescenza come indicato nella Sezione 5.

2. In vitro: trasfezione transiente di cellule immortalati con SERCaMP

Nota: Abbiamo osservato che le procedure di trasfezione transiente può indurre stress cellulare e smorzare la conseguente risposta GLUC-SERCaMP. Il seguente metodo è stato sviluppato per minimizzare trasfezione eff riflette nelle cellule SH-SY5Y. Ottimizzazione della procedura (compreso scelta di reagente di trasfezione) per linee cellulari alternati può essere richiesto. Quando possibile, si consiglia di utilizzare le linee cellulari stabili o metodi di trasduzione virale descritti rispettivamente nei punti 1 e 3.

1. Piastra cellule SH-SY5Y in un piatto di 100 mm a 4 x ¹⁰ 6 cellule. Questo piatto sarà sufficiente riseminare circa 300 pozzetti (96 pozzetti) formato seguendo la procedura di trasfezione.
2. Cellule trasfezione con il reagente xfect con 20 mg di DNA plasmidico (codifica GLUC-SERCaMP) e 6 ml di xfect reagente. Scala del DNA e xfect reagente conseguenza per recipienti di coltura più o meno grandi.
3. Cellule tornare a incubatore per 48 ore.
4. Trypsinize cellule e reseed a 96 pozzetti a 60.000 cellule per pozzetto. Seguire le successive fasi descritte nella Sezione 1.

3. In vitro: mediata vettore virale Espressione di GLUC-SERCaMP

tenda "> Nota: virale adeno-associato (AAV) imballaggio vettore ¹⁶ e purificazione ¹² e lentivirus produzione ¹³ sono stati segnalati in precedenza.

1. Titolo GLUC-SERCaMP AAV utilizzando i seguenti primer e sonde: primer forward, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; primer reverse, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Sonda (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 etichettato), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'per la PCR quantitativa.
   1. Preparare la curva standard linearizzazione un plasmide contenente GLUC e purificazione del DNA con uno spin-colonna (ad es Machery-Nagel NucleoSpin Gel e PCR pulizia). Quantificare il DNA separando su un gel di agarosio a fianco di una scala di massa. Preparare 1:10 diluizioni del DNA di 100 pg / ml a 10 fg / ml in PBS. Calcolare le copie / ml di DNA plasmidico Gluc in ciascuna delle concentrazioni in base al peso molecolare del plasmide.
   2. Diluire le scorte AAV in PBS (opportuna diluizione dipenderàparametri di preparazione virale e determinati empiricamente).
   3. Eseguire la reazione PCR in un sistema PCR in tempo reale utilizzando le seguenti condizioni: 95 ° C x 5 min, 94 ° C × 20 sec e 60 ° C × 1 min per 41 cicli. Calcola copie / ml usando la curva standard.
2. Titolo lentivirus con una p24 Lenti-X kit rapida del titolo. Scongelare aliquote lentivirali sul ghiaccio e diluire la proteina p24 di controllo in SH-SY5Y medio.
   1. Diluire il lentivirus tale che cadrà sulla curva standard (ad esempio, 1: 20.000 o 1: 100.000). Il fattore di diluizione necessaria varia in base ai parametri di preparazione lentivirali e deve essere determinato empiricamente. Seguire le istruzioni del produttore per tutte le fasi successive.
3. Cellule piastra a 96 pozzetti. Per le cellule SH-SY5Y, le procedure di placcatura descritte nella sezione 1 possono essere seguite. Per ratto neuroni corticali primarie, le cellule devono essere isolati e seminate su piastre opportunamente rivestite as descritto in precedenza ^16. Mantenere ratto neuroni corticali primarie Neurobasal media integrato con 1x B27 e 500 mM L-glutammina. Effettuare scambi e mezzo di media ogni due giorni.
4. Trasdurre le cellule con il virus. L'obiettivo di trasduzione virale è quello di raggiungere l'espressione di basso livello, come Gaussia luciferasi fornisce segnale più forte.
   1. Cellule SH-SY5Y AAV trasduzione: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire AAV a 6.0 x 10 ⁷ vg / ml in tampone di diluizione AAV (PBS + 0.5mm MgCl _2). Aggiungere 5 ml di AAV diluito (3.0 x ¹⁰ 8 vg; MOI di circa 6.000) per pozzetto di 96 pozzetti (Figura 3A). Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale.
   2. AAV trasduzione di neuroni corticali di ratto primarie: trasdurre 6-8 giorni dopo la placcatura. Diluire AAV a 4,0 x 10 ⁶ vg / ml in tampone di diluizione AAV. Aggiungere 5 ml di AAV diluito (2.0 x ¹⁰ 7 vg; MOI di circa 350) per pozzetto di96 pozzetti (Figura 3B). L'ottimale MOI dovrebbe essere determinata empiricamente per altri tipi di cellule. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti vettore virale.
   3. Trasduzione lentivirali di cellule SH-SY5Y: trasdurre il giorno seguente placcatura. Diluire lentivirus a 20 pg / ml p24 (concentrazione determinato utilizzando kit di titolazione) in soluzione salina bilanciata di Hank. Aggiungere 5μl del virus diluito per bene (100 pg di p24, pari a 1.250.000 particelle lentivirali, o ~ 1.250 IFUs) di una piastra ben 96 contenente 100 ml di volume. Scala di conseguenza per i formati più grandi. Utilizzare il 10% di candeggina per inattivare i rifiuti virale.
5. Raccogliere un campione di pre-trattamento dei media e iniziare le cure sperimentali a 48 ore (SH-SY5Y) o 5-7 giorni (ratto neuroni corticali primarie) dopo trasduzione.

4. In Vivo SERCaMP Assay

Nota: Prima di effettuare qualsiasi procedura sugli animali da essere sicuri di ottenere l'approvazione corretta attraverso il vostro istituto. Tuttiambulatori di sopravvivenza sono da fare in condizioni sterili con anestesia adeguata. Tutte le procedure descritte qui di seguito sono stati approvati e sono in conformità con le linee guida NIH ACUC.

1. Strumenti chirurgici autoclave prima dell'inizio della chirurgia (121 ° C, 30 min sterilizzazione, 20 min tempo di asciugatura). Pulire tutti gli strumenti in un ultrasonicatore immediatamente seguenti tutte le procedure e prima della sterilizzazione in autoclave. Mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza. Per interventi chirurgici che richiedono più animali, pulire strumenti chirurgici con il 70% di alcol, ultrasonicate e tallone sterilizzare tra ratti. Fare riferimento a Materiali Lista per strumenti necessari.
2. Preparare topo per la chirurgia. Qui usiamo maschio Sprague-Dawley (180-200 g).
   1. Anestetizzare ratti utilizzando isoflurano gas per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min) seguita da iniezioni intraperitoneali di xilazina (8 mg / kg) e ketamina (80 mg / kg). Applicare pomata oftalmica per proteggere cornee si secchi. Bchirurgia EGIN una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda o il piede pizzico.
   2. Radere la regione dell'addome leggermente sotto le costole (bassa regione toracica) alla regione addominale metà. Scrub l'area chirurgica tre volte, alternando il 70% di alcol e Betadine macchia. Mettere ratto in posizione supina su area chirurgica sterile con teli chirurgici sterili.
3. Diluire AAV-GLUC-SERCaMP a 7,6 x ¹⁰ 9 VG / ml (concentrazione finale). Mescolare bene invertendo il tubo.
   Nota: Intervallo di concentrazione virale può variare (Figura 4).
   1. Dispensare 105 ml di AAV diluito in un piatto sterile. Usare un ago da 30 gauge per raccogliere il virus in una siringa.
4. Eseguire un intervento chirurgico per esporre il fegato e iniettare AAV-GLUC-SERCaMP.
   1. Prima di effettuare un'incisione nell'addome, applicare bupivacaina 0,25% alla zona di incisione. Usando un bisturi, fare una incisione orizzontale sotto gabbia toracica (approximately 2-3 cm). Blunt sezionare a separare il tessuto connettivo da ipoderma.
   2. Tagliare muscoli addominali, esponendo il lobo destro mediale del fegato.
      Nota: lobi aggiuntivi possono essere iniettati in base all'applicazione finale.
   3. Mettere animale sotto microscopio operatorio e regolare per ottenere il diritto del lobo mediale del fegato nel campo visivo. Iniettare virus nel parenchima del lobo mediale; 3 siti separati, di circa 33 ml per sito.
      Nota: Lasciare l'ago nel tessuto per 5-10 secondi dopo l'iniezione per garantire la consegna di tutto il volume di iniezione.
   4. Suturare il muscolo addominale e la pelle separatamente e aggiungere Neosporin utilizzando cotone dell'applicatore punta. Posizionare ratto in una camera di recupero fino coscienza è recuperato e ratto è in grado di mantenere la posizione eretta. Non lasciare ratto (s) incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa singolarmente fino a quando l'incisione è guarita e le suture sono state rimosse (7-14 giorni).
      Nota: Secondo le linee guida post-chirurgiche NIH, mantenere registrare chirurgico. Annota carta gabbia con procedura, la data, identificatore del test, il peso corporeo, e giorno dell'intervento. Dolore / disagio, la produzione di feci, l'attività, e il cibo e il consumo di acqua devono essere monitorati e registrati chirurgia 3 giorni post. Analgesia post-operatoria è fornito con l'aggiunta di paracetamolo per l'acqua potabile (450 mg / 100 cc), anche se non osserviamo tipicamente segni di dolore o disagio dopo l'intervento.
5. Inizia coda raccolta del sangue 4-7 giorni dopo l'iniezione. Preparare le provette di raccolta del sangue, mediante l'etichettatura e pre-pesatura. Aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml) per ogni provetta.
6. Luogo ratto in camera di isoflurano per 3 minuti (4-5% isoflurano consegnato a 1.000 cc / min). Rimuovere ratto dalla camera e posto nel naso cono (2-3% isoflurano consegnato a 500 cc / min). La raccolta del sangue può iniziare una volta che il ratto è profondamente anestetizzati come dimostrato dalla mancanza di ritiro riflesso seguito coda piNCH.
   1. Utilizzando le forbici sterili punta taglio della coda (1-2 mm) e raccogliere il sangue goccia a goccia nel tubo eparina pre-riempita. Raccogliere il sangue fino volume raggiunge maggiore di 2: 1 rapporto sangue eparina (> 100 ml sangue / 50 ml di eparina). I volumi di raccolta del sangue possono essere regolati in base a disegno sperimentale. Utilizzare un applicatore di cotone umido per applicare la polvere emostatico alla coda per fermare l'emorragia.
   2. Provette di sangue Conservare a 4 ° C se la raccolta di campioni successivi. Pulire forbici con fondello etanolo e tallone sterilizzare tra le collezioni.
   3. Pesare provette per il prelievo e regolare con eparina per ottenere rapporto 2: 1 (sangue: eparina). Questo passaggio normalizzare la quantità di eparina in ciascun campione (Tabella 1).
   4. Tubi centrifugare a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante (plasma) in una nuova provetta e conservare a -80 ° C fino al momento della luciferasi test (sezione 5).
      Nota: Conservazione dei campioni a 4 ° C fino a 72 ore prima del saggio enzimatico ha minimal effetto sulla luminescenza (Figura 5A). Fino a 3 cicli di gelo-disgelo dei campioni di plasma non hanno alcun effetto sulla luminescenza (Figura 5B).
7. Amministrazione tapsigargina (controllo positivo):
   1. Preparare thapsigargin diluendo in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Iniettare tapsigargina a 1 mg / kg ip nel basso addome.
      Nota: tapsigargina aumenta trombina piastrinica indotta coagulazione ¹⁷ e può fare la raccolta di sangue da coda più difficile.
8. Gaussia luciferasi test:
   1. Scongelare i campioni di plasma sul ghiaccio.
      Nota: Per gli studi longitudinali, disgelo e di eseguire test di luminescenza per tutti i campioni tempo di valutazione nella stessa giornata (utilizzando solo la preparazione del sottofondo).
   2. Trasferimento 10 ml di plasma per un piatto di murato opaco e misurare l'attività enzimatica come descritto nel capitolo 5. Eseguire 3-4 repliche tecniche di ogni campione di plasma.
9. Euthanasiun
   Nota: Il vantaggio della tecnologia SERCaMP è la capacità di monitorare longitudinalmente ER calcio. A seconda di parametri sperimentali e le analisi degli endpoint, gli animali devono essere eutanasia con misure adeguate per le analisi degli endpoint e secondo gli orientamenti ACUC istituzionali.

5. Luminescence Assay

1. Preparare soluzioni coelenterazine (CTZ) stock diluendo il composto in metanolo acidificato (30 ml di HCl 10 N a 3 ml di metanolo) a 20 mM. Preparare aliquote monouso e conservare a -80 ° C.
2. Preparare il substrato lavorare il giorno di dosaggio.
   1. Per i saggi in vitro, diluire coelenterazine a 8 micron di PBS, ad esempio, aggiungere 10 ml di 20 mM magazzino CTZ a 25 ml di PBS (Figura 6A, B).
   2. Per i saggi in vivo, diluire coelenterazine a 100 micron di PBS, 500 mm acido ascorbico, 5 mM NaCl.
3. Incubare preparato CTZ per almeno 30 minutia temperatura ambiente prima di iniziare il test.
   Nota: Questo passo è spesso incluso in Gaussia saggi di luciferasi in quanto vi sono segnalazioni di rapido decadimento substrato durante la prima 30 minuti dopo la preparazione. Non abbiamo osservato questo effetto nel nostro sistema (Figura 6C); tuttavia, spesso includiamo la fase di incubazione che abbiamo trovato alcun impatto negativo sul dosaggio.
4. Utilizzare un lettore di piastre che è capace di monitorare bioluminescenza e dotato di un iniettore substrato. Prime le linee con substrato.
   Nota: Il substrato iniziale attraverso le linee possono essere soggette a degrado. Per evitare letture artificialmente bassi per i primi campioni, iniettare 20-30 pozzi vuoti (caricamento di un piatto vuoto sul lettore) prima di misurare campioni sperimentali.
5. Iniettare 100 ml di substrato in bene, agitare velocità media per 5 secondi, e misurare l'emissione di luce. Per il lettore di piastre Biotek Synergy II, integrare l'emissione di luce oltre 0,5 sec (campioni in vitro) e 5 sec (invivo campioni) per la fase di lettura. Ottimizzare i parametri del lettore piastra Per garantire prestazioni ottimali del test.
   Nota: mostre Gaussia luciferasi cinetica flash con rapido decadimento del segnale (rispetto a brillare cinetiche osservate con altri luciferasi). La cinetica d'infiammabilità di GLUC è influenzata dal siero in terreno di coltura cellulare (Figura 7A), mettendo in evidenza l'importanza di controllare per la composizione media tra i campioni. A causa del rapido decadimento della luminescenza dopo l'aggiunta del substrato (cinetica Flash), il tempo tra iniezione e leggere passaggi deve essere uniforme per tutti i campioni. Il lettore di piastre deve essere impostato per iniettare substrato un pozzo, attendere un tempo fisso (ad esempio usiamo un frullato passo 5 sec), e leggiamo che bene. Aggiunta di substrato a un intero piatto prima lettura rappresenta una sfida significativa a meno substrato può essere aggiunto a tutti i pozzetti simultaneamente. Se un iniettore non è disponibile, il problema può essere parzialmente aggirato incubando la piastra per 10 minuti fra il supporto addizione e misurazione (evitando così la parte ripida della curva di decadimento) (Figura 7B).
6. Ripetere l'iniezione, tempo di attesa, e leggere passaggi per ogni pozzetto della piastra.

Risultati

Il metodo GLUC-SERCaMP permette per la valutazione di ER calcio omeostasi campionando fluidi extracellulari. Diversi controlli possono essere inclusi nel disegno sperimentale per migliorare l'interpretazione dei risultati. In primo luogo, l'uso di un reporter costitutivamente secreta (ad esempio GLUC senza il ASARTDL C-terminale o "GLUC-No Tag") può essere impiegato per valutare gli effetti dei trattamenti sperimentali sulla via secretoria (secrezione cellulare globale) e l'espressione de...

Discussione

Questo protocollo evidenzia in vitro e in vivo di utilità Gluc-SERCaMP monitorare deplezione di ER calcio. Anche se la modifica della proteina di generare SERCaMP sembra generalizzare ad altre proteine ​​reporter di ^12, abbiamo scelto Gaussia luciferasi per la sua robustezza (200-1.000 volte maggiore) bioluminescenza rispetto agli altri luciferasi ^18. Dimostriamo rilevabile tapsigargina indotta rilascio GLUC-SERCaMP attraverso un range di dosaggio 100 volte virus GLU...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL tubes	Fisher	02-682-550
10% NP-40 solution	Pierce	28324	for intracellular GLuc assays
1mL luer-lok syringes	Fisher	14-823-30
200uL filter tips	Rainin	RT-L200F
3-0 surgical sutures	Fisher	NC9598192
30g needles	Fisher Scientific	14-821-13A
Adhesive microplate sealing sheets	Thermo	AB-0558
Alcohol prep pads	Fisher	22-246-073
Anesthesia Auto Flow System	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
Animal recovery chamber	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Betadine solution	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Bovine growth serum	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Cotton tipped applicators	Puritan	806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures	WPI	501803
Digital ultrasconic cleaner	Fisher Scientific	FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
DNA mass ladder	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic powder	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Methanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifuge	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR film seal	Fisher	AB0558
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Scalpel blades, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200g	Charles River	Rats	rats ordered at 150-200g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags	National Band and Tag co	1005-1
Sterile surgical drapes	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 plate reader	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Transfection reagent	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX