АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Аннотация

Эндоплазматическая сеть (ЭР) содержит высокий уровень внутриклеточного кальция, с концентрацией примерно 5000 раз больше, чем цитоплазматических уровней. Жесткий контроль над ER кальция необходимо для сворачивания белка, модификации и торговли людьми. Возмущение в ER кальция может привести к активации разложенном ответ белка, тройного механизма в ответ ER стресс и способствуют патогенезу в различных заболеваний. Возможность отслеживать изменения ЭР кальция во время начала заболевания и прогрессирования принципиально важно, но сложно на практике. В настоящее время доступны методы мониторинга ER кальция, такие как кальций-зависимых флуоресцентных красителей и белков, предоставили понимание динамики ЭР кальция в клетках, однако эти инструменты не подходят для исследований в естественных условиях. Наша лаборатория продемонстрировала, что модификация карбокси-конца Gaussia люциферазы дает секрецию репортера в ответ наЭР истощение кальция. Методы с использованием люциферазы основе, секретируемый белок ЭР мониторинг кальция (SERCaMP) для ин витро и ин виво приложений описаны здесь. Это видео подчеркивается печени инъекции, фармакологической манипуляции Gluc-SERCaMP, сбора и обработки крови и параметры анализа для продольной мониторинга ER кальция.

Введение

Эндоплазматическая сеть (ER), функции во многих клеточных мощностей в том числе сворачивания белка, секреции белка, липидов гомеостаза, и внутриклеточная сигнализация 1. Центральное место в нормальной функции ER является поддержание просвета концентрации кальция на ~ 5000 раз те нашли в цитоплазме 2-4. Этот интенсивный энергетический процесс регулируется АТФ-азы Сарко / эндоплазматическая сеть кальция (SERCA), насос, который перемещает ионы кальция в ER. Истечение кальция из ER опосредовано главным образом Рианодин (RyR) и инозитолтрифосфата (IP3R) рецепторов. Потому что многие процессы ER зависит от кальция, нарушая магазин может привести к ER стресса и возможной смерти клеток.

ЭР нарушение регуляции кальция наблюдается при заболеваниях, включая кардиомиопатия, диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и 5. Благодаря прогрессивной природы этих заболеваний, она была сложной, чтобы очертить причинно-следственную Reвисимостью между патогенеза и изменений в магазине ER кальция. Ряд технологий позволили значительные успехи в нашем понимании динамики ЭР кальция, в том числе красителей и генетически кодируемых показателей кальция (GECIs). Низкое сродство красители кальция, который увеличение флуоресценции при связывании с Ca 2+, могут быть загружены в клетках изучить субклеточных компартментах с высокими концентрациями кальция 6. GECIs, такие как D1ER и ловец позволяют для мониторинга колебаний кальция с более точным контролем субклеточном локализации 7-9. Недавно другой класс GECIs называемые кальциевые измерения органелл захваченных показатели белка (Cepia) были описаны 10. Третий подход, сочетающий генетики и химии малая молекула является мишенью-эстеразы краситель нагрузка (TED), который использует генетически закодированный карбоксилэстеразы (ориентированы на ER) с эфира на основе красителя кальция 11.

В то время как A дляementioned подходы присущи сильные и слабые стороны, они могут предоставить ценную информацию в динамике кальция ER через острых измерений флуоресценции. Они, однако, не является оптимальным для продольных исследований часто, необходимых для расследования прогрессирование заболевания. С целью разработки способа контролировать динамику кальция в течение длительного периода времени, мы определили и разработали модификацию белка для создания белков, секретируемых ER кальция мониторинга (SERCaMPs) 12.

SERCaMP обходит несколько ограничений, связанных с другими методиками, обеспечивая минимально инвазивной подход многократно опросить магазин ЭР кальция. Ранее нами было показано, что карбокси-концевой пептид ASARTDL (аланин-серин-аланин-аргинин-треонин-аспарагиновой кислоты-лейцин) достаточно для содействия сохранению ER; Однако, в условиях, которые вызывают снижение в ЭР кальция, последовательность пептида больше не в состоянии сохранить ER localizatioп и белок секретируется 13. Основой технологии является SERCaMP придатком ASARTDL к карбокси-конца секретируемого белка (например, Gaussia люциферазы, или Gluc), что секреция вызвано истощением ER кальция, тем самым создавая надежную корреспонденту ER нарушения регуляции кальция 12. Выражение Gluc-SERCaMP помощью трансгенных методов позволяет биологических жидкостей, включая среду для культивирования клеток и плазмы анализируемого изменений в Gluc деятельности как индикатор гомеостаза ER кальция. Метод имеет приложения для продольного исследования прогрессивных изменений в ER магазине кальция в пробирке и в естественных условиях. Следующий протокол записывается в виде общих чертах для использования Gluc основе SERCaMP учиться ER гомеостаз кальция, но протокол может служить в качестве руководства для альтернативных репортеров SERCaMPs.

протокол

1. In Vitro анализе: Обнаружение SERCaMP выпуска из клеточной линии Стабильный SH-SY5Y

  1. Пластина SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) в тканевой культуре обрабатывают пластин при 150000 клеток на см 2 площади поверхности. Для 96-луночных планшетах, например, семена 50000 клеток на лунку (фиг.1А). Растут SH-SY5Y, в DMEM (высокая глюкоза, GlutaMAX, пируват) + 10% роста бычьего сывороточного + 1x пенициллина / стрептомицина.
    1. Прохождение клетки до 15 раз (рис. 1В) Большее число проход не был протестирован.
    2. Возврат клетки увлажненном инкубаторе при 37 ° С с 5,5% CO 2 и инкубировать в течение ночи.
  2. Перед экспериментальной обработкой (ов), собирают базовый образец для каждой лунки путем передачи 5 мкл супернатанта культуры с непрозрачной стеной 96-луночный планшет. Перед сбором, мягко постучите по планшету со всех сторон и водоворот, чтобы избежать градиентные эффекты. Уплотнение непрозрачную пластину с клейкой сИлинга лист и хранят при температуре 4 ° С до времени ферментативного анализа.
    Примечание: секретируемый Gluc-SERCaMP очень стабилен в среду для культивирования клеток. Ранее сообщалось примерно 5-10% Gluc активности было потеряно после 72 ч инкубации при 37 ° C (инкубируют на SH-SY5Y, 12).
  3. Лечить клетки, как желательно, чтобы изучить истощение кальция ER (например, экологические, фармакологического, генетические манипуляции). Избегать длительного воздействия окружающей среды (за пределами контролируемой инкубаторе) в качестве изменения рН будет происходить быстро при атмосферном CO 2. Добавить HEPES к культуральной среде при 20 мМ, рН для стабилизации 14, если требуются длительные манипуляции. Избегайте воздействия света при использовании HEPES в культуральной среде 15.
    1. Положительный контроль: Лечить клеток с 100 нМ тапсигаргин (ТГ) или 50 мкМ cyclopiazonic кислоты (CPA) в течение 4-6 ч для экспериментов в SH-SY5Y клеток. Максимальный отклик в других клеточных линий может требовать более длительного инкубации или различными концентрациях соединений.
    2. Отрицательный контроль: Сбор культуры из родительских SH-SY5Y клеток. По нашему опыту, фон свечения для этого анализа составляет менее 0,05% от базисной секреции стабильных клеток SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP.
  4. Сбор и образцы магазин 5 мкл кондиционированной среды в требуемых временных точках, как описано в шаге 1.2.
  5. Оценка ферментативной активности в среде, как описано в разделе 5.
  6. Изучите внутриклеточный Gluc по иммуноблот или люминесценции анализа.
    1. Для иммуноблот: лизировать клетки в буфере RIPA модифицированной, содержащем 50 мМ Трис (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 0,25% дезоксихолат натрия, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40 и ингибиторы протеаз. Отдельные на SDS-полиакриламидном геле и передачи 0,20 мкм PVDF мембрану. Инкубируйте мембраны с Gluc антитела (1: 2000 разведение) ночи при 4 ° С. Выполните вторичные антитела инкубации и мембранные моет согласно протоколу определяемых пользователем для обнаружения реагента выбора.
    2. Длялюминесценции анализ (рис 2): выполните следующие действия на льду:
      1. Удалить все среды из скважин планшета для культуры ткани и промыть 200 мкл холодного PBS.
      2. Добавить 75 мкл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1% NP40 и ингибиторы протеаз в каждую лунку.
      3. Поверните пластину на орбитальном шейкере (120 оборотов в минуту) при 4 ° С в течение 20 мин.
      4. Аккуратно пипетки лизат вверх и вниз с помощью многоканальной пипетки, избегая пузырьков воздуха. Перевести 5 мкл лизата с непрозрачной пластины и оценить свечение, как указано в разделе 5.

2. Экстракорпоральное анализе: Переходные Трансфекцию иммортализованных клеток с SERCaMP

Примечание: Мы заметили, что переходные процедуры трансфекции может вызвать клеточный стресс и тупой ответ последующее Gluc-SERCaMP. Следующий подход был разработан, чтобы минимизировать трансфекции эфф ECTS в SH-SY5Y клеток. Оптимизация этой процедуры (включая выбор реагента для трансфекции) для альтернативных клеточных линий может потребоваться. Когда это возможно, рекомендуется использовать устойчивые клеточные линии или вирусными методы трансдукции, изложенные в разделах 1 и 3 соответственно.

  1. Пластинчатые SH-SY5Y клетки в 100 мм блюдо на 4 х 10 6 клеток. Это блюдо будет достаточно, чтобы вновь семян около 300 скважин (96 формата также пластины) следующие процедуры трансфекции.
  2. Трансфекции клеток с использованием реактива Xfect 20 мкг плазмидной ДНК (кодирующей Gluc-SERCaMP) и 6 мкл реагента. Xfect Масштаб ДНК и Xfect реагент, соответственно, для больших или меньших сосудов для культивирования.
  3. Вернуться клетки инкубатора в течение 48 часов.
  4. Trypsinize клеток и повторное заполнение в 96-луночные планшеты при 60000 клеток на лунку. Следуйте последующие шаги, описанные в разделе 1.

3. In Vitro анализе: вирусный вектор-опосредованной Выражение Gluc-SERCaMP

палатка "> Примечание: аденоассоциированные вирусной (AAV) вектора упаковка 16 и 12 и очистки лентивирус производство 13 были ранее.

  1. Титр Gluc-SERCaMP AAV с помощью следующих праймеров и зондов: прямой праймер, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; Обратный праймер, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Зонд (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 помечены), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'для количественной ПЦР.
    1. Подготовьте стандартный кривой линеаризуя плазмиды, содержащей Gluc и очистки ДНК, используя спин-колонку (например Machery-Нагель NucleoSpin гель и ПЦР очистки). Количественного определения ДНК, отделяя на агарозном геле вместе массового лестницы. Приготовьте 1:10 разбавление ДНК из 100 пг / мл до 10 мкг / мл в PBS. Расчет копий / мл Gluc плазмидной ДНК в каждой из концентраций, основанных на молекулярной массе плазмиды.
    2. Развести акции AAV в PBS (соответствующее разведение будет зависеть отПараметры вирусного препарата и определяется опытным путем).
    3. Запуск реакции ПЦР в режиме реального времени системы ПЦР с использованием следующих условий: 95 ° C × 5 мин, 94 ° С × 20 сек, и 60 ° С × 1 мин в течение 41 циклов. Рассчитать копии / мл с использованием стандартной кривой.
  2. Титр лентивирус с р24 Ленти-X быстрого набора титра. Оттепель лентивирусные аликвот на льду и разбавить управления белка р24 в SH-SY5Y среды.
    1. Развести лентивирус таким образом, что она будет падать на стандартной кривой (например, 1: 20000 или 1: 100000). Коэффициент разбавления требуется будет варьироваться в зависимости от параметров лентивирусных подготовки и должно быть определено опытным путем. Следуйте инструкциям производителя для всех последующих шагов.
  3. Пластина клеток в 96-луночных планшетах. Для SH-SY5Y, процедуры обшивки, изложенные в разделе 1, можно следовать. Для крыс первичных корковых нейронов, клетки должны быть изолированы и высевают на пластины, покрытые соответствующимс ранее описано 16. Поддержание крыс первичные корковых нейронов в Neurobasal среде с добавлением 1x B27 и 500 мкМ L-глутамина. Выполните половиной обменов среднего каждый день.
  4. Трансдукции клеток с вирусом. Цель вирусный трансдукции является достижение выражение низкого уровня, а Gaussia люциферазы обеспечивает надежную сигнал.
    1. AAV трансдукции SH-SY5Y клетки: трансдукции на следующий день после посева. Развести AAV до 6,0 х 10 7 VG / мкл в разбавления AAV буфера (PBS + 0,5 мМ MgCl 2). Добавьте 5 мкл разбавленного AAV (3,0 х 10 8 В.; МВД приблизительно 6000) на лунку 96-луночного планшета (рис 3А). Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусного вектора отходов.
    2. AAV трансдукции крыс первичных корковых нейронов: преобразовывать 6-8 дней после посева. Развести AAV до 4,0 х 10 6 В.Г. / мкл в буфере для разведения AAV. Добавьте 5 мкл разбавленного AAV (2,0 х 10 7 В.; МВД приблизительно 350) в лунку96-луночный планшет (3В). Оптимальное МВД должны быть определены эмпирически для других типов клеток. Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусного вектора отходов.
    3. Лентивирусов трансдукция SH-SY5Y ячеек: трансдукции на следующий день после посева. Развести лентивирус 20 пг / мкл p24 (концентрация определяется с помощью титрование комплект) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса. Добавить 5 мкл разбавленного вируса на лунку (100 мкг p24, эквивалентна 1.250.000 лентивирусов частиц, или ~ 1250 IFUs) из 96-луночного планшета, содержащего 100 мкл объем. Масштаб, соответственно, для больших форматов. Используйте 10% отбеливатель для инактивации вирусной отходов.
  5. Сбор предварительной обработки образца среды и начать Экспериментальное лечение 48 ч (SH-SY5Y) или 5-7 дней (крысы первичных корковых нейронов) после трансдукции.

4. В Vivo SERCaMP анализе

Примечание: Перед проведением любых процедурах животных быть уверены, чтобы получить правильную одобрение через учреждения. Всеоперации выживания должно быть сделано в стерильных условиях с адекватной анестезии. Все процедуры, описанные ниже, были утверждены и находятся в соответствии с руководящими принципами NIH ACUC.

  1. Автоклав хирургические инструменты до начала операции (121 ° С, 30 мин стерилизации, 20 мин время высыхания). Очистите все инструменты в ультразвукового дезинтегратора сразу же после всех процедур и перед автоклавированием. Поддержание стерильных условий во время операции выживания. Для операций, требующих нескольких животных, протрите хирургических инструментов с 70% -ным спиртом, ultrasonicate и шарик стерилизации между крысами. Обратитесь к Список материалов для необходимых инструментов.
  2. Подготовка к операции крысу. Здесь мы используем мужчина Спрэг Dawley (180-200 г).
    1. Обезболить крысах с использованием газа изофлуран в течение 3 мин (4-5% изофлуран доставляется при 1000 куб.см / мин) с последующим внутрибрюшинных инъекций ксилазина (8 мг / кг) и кетамина (80 мг / кг). Применить глазной мази для защиты роговицы от высыхания. ВEgin хирургия когда-то крысы глубоко под наркозом, как показано отсутствием вывода рефлекса следующей хвост или ноги крайнем случае.
    2. Бритье область живота чуть ниже ребер (низкий грудной области) в середине брюшной полости. Скраб хирургической области три раза, чередуя 70% спирта и Betadine скраба. Поместите крысу в положении лежа на спине на стерильный хирургический участок с стерильных хирургических салфеток.
  3. Развести AAV-Gluc-SERCaMP 7,6 х 10 9 В. / мл (конечная концентрация). Все хорошо перемешать путем обращения трубку.
    Примечание: Диапазон концентрации вируса может варьироваться (рисунок 4).
    1. Внесите 105 мкл разбавленного AAV в стерильную чашку. Использование 30-иглы для сбора вируса в шприц.
  4. Выполните операцию по разоблачению печень и придать AAV-Gluc-SERCaMP.
    1. До принятия разрез в брюшной полости, применяются 0,25% бупивакаин в области разреза. Использование скальпеля, сделать горизонтальную разрез ниже грудной клетки (APзительно 2-3 см). Блант рассекать отделить соединительную ткань гиподермы от.
    2. Вырезать брюшной мышцы, обнажая правую медиальной доли печени.
      Примечание: дополнительные лепестки могут быть введены на основании конечного применения.
    3. Поместите животное под операционным микроскопом и настроить, чтобы получить правильный медиальной доли печени в поле зрения. Внедрить вирус в паренхиме медиальной доли; 3 отдельные участки, примерно 33 мкл на сайте.
      Примечание: Оставьте иглу в ткани на 5-10 сек после инъекции, чтобы обеспечить доставку всего объема впрыска.
    4. Шовный брюшной мышцы и кожу отдельно и добавить Neosporin помощью ватной палочки. Поместите крысу в камеру регенерации до сознания не восстановили и крысы в ​​состоянии поддерживать вертикальное положение. Не оставляйте крысу (ы) без присмотра, пока он не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины лежачее положение. Дом в одиночку, пока разрез зажила и швы были удалены (7-14 дней).
      Примечание: В соответствии с NIH послеоперационных рекомендаций, поддерживать хирургического запись. Аннотации клетки карты с процедурой, дату, идентификатор эксперимента, вес тела, и день операции. Боль / недостаточность, производство кала, активность и питание и потребление воды будут контролироваться и регистрироваться 3 сутки после операции. Послеоперационный обезболивание обеспечивается добавлением ацетаминофена в питьевую воду (450 мг / 100 см), хотя мы не наблюдаем, как правило, признаки боли или дистресса следующие операции.
  5. Начало хвост сбора крови 4-7 дней после инъекции. Подготовка сбора крови труб путем маркировки и предварительно взвешивания. Добавить 50 мкл гепарина (1000 ед / мл) в каждую пробирку.
  6. Место крысы в ​​ИФ анестезии камеры в течение 3 мин (4-5% Isoflurane поставляемого в 1000 куб.см / мин). Удалить крысу из камеры и места в носовой конус (2-3% Isoflurane поставляемого в 500 куб.см / мин). Сбор крови может начаться после того, как крыса глубоко под наркозом, как показано отсутствием вывода рефлекса после хвост пиNCH.
    1. Использование стерильных ножниц вырезать кончиком хвоста (1-2 мм) и собрать кровь по каплям в предварительно заполненный гепарина трубки. Соберите кровь, пока объем не достигнет больше, чем 2: 1 соотношение кровь гепарин (> 100 мкл крови / мкл гепарина 50). Объемы сбора крови может быть скорректирован на основе эксперимента. Используйте влажную хлопчатобумажную аппликатор, чтобы применить кровоостанавливающим порошок в хвост, чтобы остановить кровотечение.
    2. Трубки хранения крови при 4 ° С, если собирать последующие образцы. Протрите ножницы с этанолом площадку и шарик стерилизовать между коллекциями.
    3. Взвесьте сбора трубы и отрегулируйте с гепарином, чтобы получить 2: 1 соотношение (кровь: гепарин). Этот шаг нормализовать количество гепарина в каждой пробе (таблица 1).
    4. Пробирки центрифужные при 2000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Перенесите супернатант (плазмы) в чистую пробирку и хранить при температуре -80 ° С до момента анализа люциферазы (раздел 5).
      Примечание: Хранение образцов при 4 ° С до 72 ч до анализа ферментативной имеет тinimal влияние на люминесценции (рис 5А). До 3 замораживания-оттаивания цикла образцов плазмы не оказывают никакого влияния на люминесценции (рис 5B).
  7. Тапсигаргин администрация (положительный контроль):
    1. Подготовьте тапсигаргин разбавлением в этаноле до конечной концентрации 2,5 мг / мл. Вводите тапсигаргин на 1 мг / кг внутрибрюшинно в нижней части живота.
      Примечание: тапсигаргин увеличивает тромбина-индуцированной тромбоцитов коагуляция 17 и может сделать забор крови из хвоста более сложной.
  8. Gaussia люциферазы анализа:
    1. Оттепель образцы плазмы на льду.
      Примечание: Для продольных исследований, оттепели и выполнять люминесценции анализа для всех образцов временной точке в тот же день (с помощью одного препарата субстрата).
    2. Передача 10 мкл плазмы непрозрачной стеной пластины и измерить ферментативную активность, как описано в разделе 5. Выполнить 3-4 повторов технические каждого образца плазмы.
  9. Euthanasi
    Примечание: Преимущество технологии SERCaMP является возможность продольно-монитор ER кальция. В зависимости от параметров эксперимента и конечной анализирует, животные должны быть умерщвлены с помощью мер, подходящих для конечной анализирует и в соответствии с ведомственным руководящим принципам ACUC.

5. Люминесценция Анализ

  1. Подготовьте коэлентеразин (CTZ) растворы путем разбавления соединения в подкисленный метанол (30 мкл 10 н HCl до 3 мл метанола) до 20 мм. Подготовьте отдельные аликвоты использовать и хранить при температуре -80 ° C.
  2. Подготовьте рабочую подложку в день анализа.
    1. Для анализов в пробирке, разбавленных коэлентеразином до 8 мкм в PBS, например, добавить 10 мкл 20 мМ CTZ складе 25 мл PBS (фиг.6А, В).
    2. Для анализов в естественных условиях, разбавленные коэлентеразином до 100 мкм в PBS, 500 мМ аскорбиновой кислоты, 5 мМ NaCl.
  3. Выдержите подготовленную ЧТЗ, по крайней мере 30 минпри комнатной температуре до начала анализа.
    Примечание: Этот шаг часто входит в Gaussia люциферазных анализов, поскольку есть сообщения о быстрого распада субстрата во время первых 30 мин после приготовления. Мы не наблюдали этот эффект в нашей системе (рис 6C); Однако, мы часто включают в себя стадию инкубации, как мы не нашли никакого отрицательного влияния на анализ.
  4. Использование планшет-ридера, который способен мониторинга биолюминесценции и оснащен подложки инжектора. Премьер линии с подложкой.
    Примечание: Исходный субстрат через линии могут быть склонны к деградации. Чтобы избежать искусственно низкие показания для начала образцов, вводят 20-30 пустые колодцы (Загрузка пустую тарелку на читателя) до измерения экспериментальных образцов.
  5. Вводите 100 мкл субстрата в хорошо встряхните среднюю скорость в течение 5 сек, и измерить излучение света. Для читателя пластины Биотек Синергия II, интегрировать излучение света над 0,5 сек (образцы в пробирке) и 5 сек (вVIVO образцов) для стадии чтения. Оптимизация параметров ридере для идеального проведения анализа.
    Примечание: Gaussia люциферазные экспонаты флеш кинетика с быстрым распадом сигнала (по сравнению с светиться кинетики наблюдаемые с другими люцифераз). Вспышка кинетика Gluc влияют сыворотки в клеточной культуральной среде (рис 7А), подчеркивая важность контроля за состава среды через образцов. Из-за быстрого распада люминесценции после добавления субстрата (флеш кинетики), время между внедрить и прочитайте шаги должны быть едиными для всех образцов. Читатель пластина должна быть установлена, чтобы придать подложки хорошо, подождите определенное время (например, мы используем дрожания шаг 5 сек), и читать, что хорошо. Добавление подложки ко всему пластины перед чтением представляет собой значительную проблему, если субстрат не может быть добавлен во все лунки одновременно. Если инжектор не доступен, проблема может быть частично обойдена путем инкубации тарелку в течение 10 мин между подложкой дополниния и измерения (при этом избегая крутой части кривой затухания) (рис 7б).
  6. Повторите инъекции, время ожидания, и прочитайте шаги для каждого колодца на тарелку.

Результаты

Метод Gluc-SERCaMP позволяет для оценки ER кальциевого гомеостаза путем отбора проб внеклеточной жидкости. Несколько элементов управления могут быть включены в экспериментальной конструкции до повышения интерпретацию результатов. Во-первых, использование конститутивно секретируемый реп?...

Обсуждение

Этот протокол подчеркивает в пробирке и в естественных условиях полезности Gluc-SERCaMP контролировать истощение ER кальция. Хотя модификации белков для создания SERCaMP появляется обобщить с другими репортеров белков 12, мы выбрали Gaussia люциферазы для прочной (200-1000 раз большей) ?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mL tubesFisher 02-682-550
10% NP-40 solution Pierce28324for intracellular GLuc assays
1mL luer-lok syringesFisher14-823-30
200uL filter tipsRaininRT-L200F
3-0 surgical suturesFisherNC9598192
30g needlesFisher Scientific14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheetsThermoAB-0558
Alcohol prep padsFisher22-246-073
Anesthesia Auto Flow SystemE-Z AnesthesiaEZ-AF9000
Animal recovery chamberLyon VetICU-912-004
B27 supplementLife Technologies17504-044
Betadine solutionFisherNC9386574
BleachCloroxn/a
Bovine growth serumThermoSH30541.03
Coelenterazine, NativeRegis Technologies1-361204-200
Cotton tipped applicatorsPuritan806-WC
Cutting needles 3/8 circle suturesWPI501803
Digital ultrasconic cleanerFisher ScientificFS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvateLife Technologies10569-010
DNA mass ladderLife Technologies10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)Nanolight321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)New England BiolabsE8023S1:2000 (WB)
Germinator 500CellPoint ScientificDS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)Fisher07-200-589
Hank's balanced salt solutionLife Technologies14175-095
HeparinAllmedtech63323-276-02
IsofluraneButler Schein29404
KetamineHenry Schein995-2949
Kwik Stop Styptic powderButler Schein5867
L-glutamineSigmaG8540
MethanolFishera452-4
Microfuge 22R CentrifugeBekman Colter368831
NeosporinFisher19-898-143
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nikon StereoscopeNikonSMZ745T
Nucleospin Gel and PCR CleanupMachery-Nagel740609
P200 pipetRaininL-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kitClontech632200
PCR film sealFisherAB0558
Penicillin/streptomycinLife Technologies15140-122
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
ReFresh Charcoal Filter canisterE-Z AnesthesiaEZ-258
Scalpel blades, #10Fine Science tools Inc10010-00
SD rats 150-200gCharles RiverRatsrats ordered at 150-200g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tagsNational Band and Tag co1005-1
Sterile surgical drapesBraintree ScientificSP-MPS
Synergy 2 plate readerBioTekn/a
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
ThapsigarginSigmaT9033harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mixLife TechnologiesK4975-00
Xfect Transfection reagentClontech631318
XylazineValley Vet468RX

Ссылки

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

103SERCaMPERManfGaussia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены