Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Özet

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Özet

Endoplazmik retikulum (ER) konsantrasyonu yaklaşık sitoplazmik kıyasla daha fazla 5000 misli, hücre içi kalsiyum üst düzeyde bulunmaktadır. ER kalsiyum üzerinde sıkı kontrol protein katlanması, modifikasyonu ve insan ticareti için zorunludur. ER kalsiyum düzensizlikler katlanmamış protein karşılığının bir üç uçlu ER stres tepkisi mekanizmasının aktivasyonu ile sonuçlanan ve hastalıkların çok çeşitli patogenezine katkıda bulunabilir. Hastalık başlangıcı ve ilerlemesi sırasında ER kalsiyum değişiklikleri izleme yeteneği pratikte prensipte önemli, ama zor olduğunu. Kalsiyum bağımlı floresan boyalar ve proteinler gibi izleme ER kalsiyum yönelik güncel yöntemler arasında, ancak bu araçlar, in vivo çalışmalar için uygun değildir, hücrelerde ER kalsiyum dinamiklerinin kazanmasını sağlamıştır. Bizim laboratuvar Gaussia lusiferaz karboksi-terminalinde bir modifikasyon yanıt olarak raportör salgılanmasını sağladığını göstermiştirER kalsiyum tükenmesi. In vitro ve in vivo uygulamaları bir lusiferaz göre, salgılanan ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) kullanmak için yöntemler burada tarif edilmiştir. Bu video ER kalsiyum boyuna izlenmesi için karaciğer enjeksiyonları, glukozit-SERCaMP, kan toplama ve işleme farmakolojik manipülasyon ve tahlil parametrelerini vurgulamaktadır.

Giriş

Endoplazmik retikulum (ER) ¹ sinyalizasyon protein katlanması, protein salgılanması, lipid homeostazı ve intraselüler dahil olmak üzere birçok hücresel kapasitelerde çalışır. Normal ER işlevine Merkez ~ 5000 kez luminal kalsiyum konsantrasyonlarını sitoplazma ^2-4 bulunanlar sürdürmektedir. Bu enerji yoğun bir süreç Sarko / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), ER içine kalsiyum iyonlarını hareket eden bir pompa tarafından düzenlenir. ER kalsiyum bir akış esas olarak riyanodin (RyR) ve inositol trifosfat (IP3R) reseptörleri tarafından aracılık eder. Birçok ER işlemler kalsiyum bağımlı olduğundan, mağaza kesintiye ER stres ve sonuçta hücre ölümüne neden olabilir.

ER, kalsiyum disregülasyon, kardiyomiyopati, diyabet de dahil olmak üzere, Alzheimer hastalıkları gözlenmiştir, ve Parkinson ^5. Bu hastalıkların ilerleyen doğası nedeniyle, bir sebep-sonuç yeniden çizmek için zorlu olmuşturER kalsiyum deposunda patogenezi ve değişiklikler arasında lationship. Teknolojilerin bir dizi boyalar ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) dahil ER kalsiyum dinamikleri, anlayışımızda önemli gelişmeler için izin vermiş. ^Ca2 + bağlandığmda floresanstaki artış, düşük afinite kalsiyum boyalar, kalsiyum ⁶ konsantrasyonu yüksek olan hücre içi bölmelere incelemek için hücrelere yerleştirilebilir. Böyle D1ER ve Catcher olarak geçiş, subsellüler lokalizasyonu ^7-9 daha hassas kontrolü ile kalsiyum dalgalanmaların izlenmesi için izin verir. Son zamanlarda, geçiş bölgesinin bir başka sınıfı olarak adlandırılır kalsiyum ölçüm organel tutulmuş protein göstergeleri (CEPIA) ¹⁰ tarif edilmiştir. Genetik ve birleştiren üçüncü bir yaklaşım küçük moleküllü kimya hedeflenen esteraz boya yükleme bir ester bazlı kalsiyum boya ¹¹ (ER hedeflenen) genetik olarak kodlanmış karboksilesteraz kullanır (TED).

Afor ikenementioned yaklaşımlar da floresan akut ölçümlerle aracılığıyla ER kalsiyum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir, doğal güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bununla birlikte, çoğu zaman, hastalığın ilerlemesini araştırmak için gerekli boyuna çalışmalar için uygun değildir. Zaman genişletilmiş süreler boyunca kalsiyum dinamiklerini izlemek için bir yöntem oluşturulması amacıyla, biz tespit ve salgılanan ER kalsiyum izleme proteinleri (SERCaMPs) ¹² oluşturmak için bir protein modifikasyonu geliştirdi.

SERCaMP defalarca ER kalsiyum deposu sorgulamak için minimal invaziv bir yaklaşım sağlayarak, diğer yöntemlerle ilişkili çeşitli sınırlamalar circumvents. Daha önce karboksi-terminal peptit ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartik asit-leucine) ER-retensiyon teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, ER kalsiyum düşüşler neden olan koşullar altında, peptid dizisi, artık ER localizatio muhafaza edebilmektedirn ve protein ¹³ salgılanır. SERCaMP teknoloji temelinde bir salgılanmış proteininin karboksi-terminalinde salgılanması dolayısıyla ER kalsiyum disregülasyonun ¹² sağlam bir raportör oluşturma ER kalsiyum azalması ile tetiklenir, bu durumda (örneğin, lusiferaz Gaussia veya glukozit) için ASARTDL bir ek alım düzenidir. Transgenik yöntemlerle glukozit-SERCaMP ekspresyonu ER Kalsiyum homeostazında bir göstergesi olarak glukozit aktivitesindeki değişikliklerin analiz edilmesi için hücre kültür aracı ve plazma da dahil olmak üzere, biyolojik sıvıları sağlar. Yöntem, in vitro ve in vivo olarak ER kalsiyum deposunda progresif değişiklikler uzunlamasına çalışma için uygulamalar vardır. Aşağıdaki protokol ER kalsiyum homeostazını incelemek için glukozit merkezli SERCaMP kullanmak için genel bir taslak olarak yazılır, ama protokol alternatif raportör SERCaMPs için bir rehber olarak hizmet verebilir.

Protokol

Vitro Tahlili: 1. Bir Kararlı SH-SY5Y Hücre Line algılama SERCaMP Yayın

1. Levha SH-SY5Y-glukozit-ASARTDL (SERCaMP) doku kültürü içinde yüzey alanının ^cm2 başına 150.000 hücre plakaları işlemden geçirildi. 96 oyuklu plakalar için, örneğin, 50,000 hücre, oyuk başına (Şekil 1A) tohum. DMEM (yüksek glukoz, GlutaMAX, piruvat) +,% 10 büyükbaş hayvan büyüme serumu + 1 x penisilin / streptomisin SH-SY5Y hücreleri büyütün.
   1. 15 kez (Şekil 1B) kadar Passage hücreleri. Yüksek geçit numarası test edilmemiştir.
   2. % 5.5 _CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş inkübatör hücreleri dönün ve gece boyunca inkübe edilir.
2. Deneysel tedavi (ler) önce, iyi bir opak kültür süpernatant 5 ul aktararak her biri için bir temel numune toplamak 96 plaka duvarlı. Toplama önce, hafifçe her tarafta plaka dokunun ve degrade etkileri önlemek için girdap. Yapışkan bir s ile opak plaka Sealenzimatik analiz zamanına kadar 4 ° C'de ealing tabaka ve saklayın.
   Not: Salgılanmış glukozit-SERCaMP hücre kültür ortamı içinde çok kararlıdır. Daha önce glukozit aktivitesinin yaklaşık% 5-10 (SH-SY5Y hücreleri üzerinde inkübe) 37 ° C'de ¹² bir 72 saat inkübe edildikten sonra kaybolur bildirilmiştir.
3. ER kalsiyum tükenmesi incelemek için arzu edildiği gibi (örneğin çevre, farmakolojik, genetik manipülasyonlar) hücreleri davranın. Hızla atmosferik _CO 2 de oluşacak pH değişiklikleri olarak (kontrollü inkübatör dışında) çevre ortama uzun maruz kalmaktan kaçının. Uzun süreli manipülasyonlar gerekli ise, pH değeri ¹⁴ stabilize edilmesi için, 20 mM kültür ortamına HEPES ekleyin. Kültür ortamında ¹⁵ HEPES kullanırken ışığa maruz kalmaktan kaçının.
   1. Pozitif kontrol: SH-SY5Y hücrelerinde deneyler için 4-6 saat boyunca 100 nM thapsigargin (Tg) ya da 50 uM siklopiazonik asit (CPA) ve hücreleri tedavi edin. Diğer hücre hatlarında maksimal tepkisi uzun inkubasyon ya da farklı yoğunlaştırma gerektirebilirBileşiklerin, yerel yönetim bu.
   2. Negatif kontrol: Ebeveyn SH-SY5Y hücrelerinin topla kültür ortamı. Deneyimlerimize göre, bu deneyde arka plan lüminesans stabil SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri bazal salgılama az% 0.05.
4. Adım 1.2'de belirtildiği gibi, istenen zaman noktalarında toplayın ve klimalı ortamın mağaza 5 ul örnekleri.
5. Bölüm 5'te belirtildiği gibi orta enzimatik aktivitesini değerlendirmek.
6. Immunoblot veya lüminesans deneyi ile hücre içi glukozit inceleyin.
   1. 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl,% 0.25 sodyum deoksikolat, 1 mM EDTA,% 1 NP40 içeren değiştirilmiş RIPA tamponunda lize hücreleri ve proteaz inhibitörleri: immünoblot için. 0,20 um PVDF membrana SDS-poliakrilamid jeli ve transfer ayrı. (: 2000 seyreltme 1) gece boyunca 4 ° C'de glukozit antikor ile membran inkübe edin. Seçim tespiti ayıraç için kullanıcı tanımlı protokole göre sekonder antikor inkübasyon ve membran yıkar gerçekleştirin.
   2. Nedeniylelüminesans tahlil (Şekil 2): buz üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
      1. Bir doku kültürü plakasının gözeneklerine tüm orta çıkarın ve soğuk 200 ul PBS ile yıkayın.
      2. Her bir oyuğa 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 1 NP40 ihtiva eden liziz tamponu ve proteaz inhibitörlerinin 75 ul ekle.
      3. 20 dakika boyunca 4 ° C'de bir orbital çalkalayıcı (120 rpm) üzerine plaka döndürün.
      4. Yavaşça yukarı ve çok kanallı pipet kullanarak hava kabarcıkları kaçınarak aşağı lizat pipetle. Opak plaka lizat 5 ul aktarın ve Bölüm 5'te belirtildiği gibi lüminesans değerlendirmek.

İn Vitro Tahlili: 2. SERCaMP ölümsüzleştirilmiş Hücreler geçici transfeksiyonu

Not: geçici transfeksiyon prosedürleri hücresel strese neden olabilir ve daha sonraki glukozit-SERCaMP yanıtı künt olduğunu gözlemledik. Aşağıdaki yaklaşım transfeksiyon eff en aza indirmek için geliştirildi SH-SY5Y hücrelerinde ects. Alternatif hücresi soyları (transfeksiyon reaktifi seçimi de dahil olmak üzere), bu prosedürün optimize edilmesi gerekli olabilir. Mümkün olduğunda, bu sırasıyla Bölüm 1 ve 3 de tarif kararlı hücre kuşaklarının ya da viral transdüksiyon yöntemleri kullanmak tavsiye edilir.

1. 4 x 10 ⁶ hücre, bir 100 mm çanak Levha SH-SY5Y hücreleri. Bu bulaşık transfeksiyon prosedürü izleyerek yaklaşık 300 kuyu (96 oyuklu plaka formatı) tohum yeniden için yeterli olacaktır.
2. Xfect plazmid DNA 20 ug (kodlayan glukozit-SERCaMP) ile reaktif ve Xfect reaktifi 6 ul Transfect hücreleri. Büyük veya daha küçük kültür hazneleri göre ölçekli DNA and Xfect reajanı.
3. 48 saat boyunca inkübatör hücreleri dönün.
4. Hücreleri tripsinize edin ve oyuk başına 60,000 hücre olacak şekilde 96 oyuklu plakalara reseed. Bölüm 1'de özetlenen sonraki adımları izleyin.

İn Vitro Tahlili: 3. Viral vektör aracılı İfade glukozit-SERCaMP

tert "> Not: Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü ambalaj ¹⁶ ve arıtma için ¹² ve lentivirüs üretimi ^13, daha önce rapor edilmiştir.

1. Titer glukozit-SERCaMP AAV aşağıdaki primerler ve problar kullanılarak: ileri primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; ters primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Prob (5'-6-FAM / BHQ-3'-1 etiketli) kantitatif PCR için, 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 '.
   1. Glukozit içeren bir plazmid linnerleştirilmesi ve spin-kolon (örn Machery-Nagel NucleoSpin Jel ve PCR temizleme) kullanılarak DNA'nın saflaştırılması ile standart eğri hazırlayın. Kütle merdiven birlikte bir agaroz jeli üzerinde ayırarak DNA nicelleştirmektedir. PBS içinde 10 fg / ml aralığındadır 100 ug / DNA 1:10 dilüe. Plazmidin molekül ağırlığına dayalı olarak her bir konsantrasyonunda, glukozit plazmid DNA'nın kopya / ml hesaplanır.
   2. PBS AAV stokları seyreltin (uygun seyreltme bağlı olacaktırViral hazırlama parametreleri ve) ampirik olarak belirlenir.
   3. 94 ° C 20 sn ×, 95 ° C x 5 dakika ve 41 çevrim için, 60 ° C x 1 dak:, aşağıdaki koşullar kullanılarak, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde PCR reaksiyonu. Ml standart eğri kullanılarak / kopya hesaplayın.
2. Bir p24 Lenti-X, hızlı titre kiti ile titre lentivirüs. Buz üzerinde lentiviral alikotları çözülme ve SH-SY5Y ortamında p24 proteini kontrol sulandırmak.
   1. Standart eğrinin (: 20,000 ya da 1: 100.000 örneğin 1) düşecek şekilde lentivirüs sulandırmak. Gerekli seyreltme faktörü lentiviral hazırlık parametrelere göre değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Sonraki tüm adımlar için üreticinin talimatlarına uyun.
3. 96 gözlü plakalara plakası hücreleri. SH-SY5Y hücreleri için, Bölüm 1'de belirtilen kaplama prosedürleri takip edilebilir. Fare birincil kortikal nöronlarda için, hücreler izole edilir ve uygun bir şekilde kaplanmış plakalar, bir üzerine ekildi olmalıdırs, daha önce tarif edilen ^16. 1x B27 ve 500 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal sıçan birincil kortikal nöronlar koruyun. Her gün yarım orta alışverişi yapın.
4. Virüs hücreleri nakletmek. Gaussia lusiferaz güçlü bir sinyal sağlar viral transdüksiyon hedefi, düşük düzeyde ekspresyonunu elde etmektir.
   1. AAV transdüksiyon SH-SY5Y hücreleri: kaplama ertesi gün transdüse. AAV seyreltme tamponu (PBS + 0.5mm _MgCl2) 6.0 x 10 ⁷ vg / ul AAV sulandırmak. (, Yaklaşık 6000 arasında MOI 3.0 x 10 ⁸ vg) 96 oyuklu bir plaka (Şekil 3A) oyuk başına seyreltilmiş AAV 5 ul ekleyin. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
   2. Sıçan primer kortikal nöronların AAV transdüksiyon: kaplama sonrası 6-8 gün transduce. AAV seyreltme tamponu 4.0 ^x 10 6 vg / ul AAV sulandırmak. Seyreltilmiş AAV'nin 5 ul ekleyin (2.0 x 10 ⁷ VG, İçişleri Bakanlığı, yaklaşık 350) oyuk başına96 gözenekli bir plaka (Şekil 3B). Optimal MOI diğer hücre tipleri için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
   3. SH-SY5Y hücrelerinin lentiviral transdüksiyon: kaplama ertesi gün transdüse. Hank dengeli tuz çözeltisi içinde (konsantrasyon titerleme kiti kullanılarak belirlenen) 20 pg / ml için, p24 lentivirüs seyreltin. 100 ul hacimde 96 oyuklu bir plakanın (1.250.000 lentiviral parçacıklara eşdeğerdir p24 100 ug, veya ~ 1250 IFUs) oyuk başına seyreltilmiş virüs 5ul ekleyin. Büyük biçimleri için buna göre ölçeklendirin. Viral atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın.
5. Ortamının bir ön-işleme örneği toplamak ve deneysel tedavi 48 saat (SH-SY5Y) ya da transdüksiyon sonra 5-7 gün (sıçan primer kortikal nöronlar) başlar.

Vivo SERCaMP Tahlili 4.

Not: herhangi bir hayvan prosedürleri kurum aracılığıyla uygun onay almak için emin olun gerçekleştirmeden önce. Hepsihayatta kalma ameliyatlar yeterli anestezi ile steril koşullar altında yapılması için vardır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler onaylanmış ve NIH ACUC kurallarına uygundur oylandı.

1. Otoklav cerrahi aletler cerrahi başlatmak için önce (121 ° C, 30 dakika sterilizasyon, 20 dakika kuruma süresi). Hemen tüm prosedürler ve önceki otoklav aşağıdaki bir ultrasonikatör tüm enstrümanları temizleyin. Sağkalım ameliyat sırasında steril koşullar koruyun. Birden hayvanları gerektiren ameliyatlar için,% 70 alkol, ultrasonicate ve boncuk sıçanlarda arasında sterilize ile cerrahi aletler silin. Gerekli aletleri Malzeme Listesine bakınız.
2. Ameliyat için, sıçan hazırlayın. Burada Erkek Sprague-Dawley (180-200 g) kullanın.
   1. Ksilazin (8 mg / kg) ve ketamin (/ kg ile 80 mg), intraperitonal enjeksiyonlar izledi 3 dakika boyunca (4-5% Isoflurane 1000 cc / dakika verilir) gaz izofluran kullanılarak sıçan anestezisi. Kurumasını kornealar korumak için oftalmik merhem sürün. Bkuyruk veya ayak tutam aşağıdaki çekme refleksi eksikliği gösterdiği gibi sıçan kez Eğin cerrahi derin anestezi olduğunu.
   2. Biraz orta karın bölgesine kaburga (düşük göğüs bölge) altında karın bölgesini tıraş. Cerrahi parkı% 70 alkol ve Betadinede fırçalayın alternatif üç kez, fırçalayın. Steril cerrahi örtüler ile steril cerrahi alanda yatar pozisyonda sıçan yerleştirin.
3. 7,6 x 10 ⁹ vg / ml (son konsantrasyon) 'daki AAV-glukozit-SERCaMP seyreltilir. Tersine tüp iyice karıştırın.
   Not: viral konsantrasyon aralığı (Şekil 4) değişebilir.
   1. Pipet steril kap içine seyreltildi AAV 105 ul. Bir şırınga içine virüs toplamak için 30 iğne kullanın.
4. AAV-glukozit-SERCaMP karaciğer ortaya çıkarmak ve enjekte etmek ameliyat.
   1. Önceki karın bir kesi yapmadan, insizyon alanı% 0.25 bupivakain uygulayın. Bir neşter kullanılarak, göğüs kafesinin altında yatay bir kesi (ap yapmakproximately 2-3 cm). Hipodermis gelen bağ dokusu ayırmak için disseke künt.
   2. Karaciğer sağ lobunu medial açığa karın kası kesti.
      Not: Diğer loblar son uygulamaya göre enjekte edilebilir.
   3. Cerrahi mikroskop altında hayvan koyun ve görüş alanında karaciğer sağ lobunu medial almak için ayarlayın. Medial lob parankimi içine virüs enjekte; 3 ayrı siteler, site başına yaklaşık 33 ul.
      Not: Tüm enjeksiyon hacminin teslim edilmesini sağlamak için enjeksiyonu takiben 5-10 saniye dokuda iğne bırakın.
   4. Ayrı ayrı karın kas ve cilt sütür ve pamuk uçlu aplikatör kullanarak Neosporin ekleyin. Bilinç kazanmış ve sıçan dik pozisyonunu koruyabiliyor kadar bir iyileşme odasında sıçan yerleştirin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sıçan (ler) gözetimsiz bırakmayın. Ev tek başına kesi iyileşene kadar ve dikişler (7-14 gün) kaldırılmıştır.
      Not: NIH ameliyat sonrası kurallar gereği, cerrahi kaydını tutmak. Prosedür, tarih, deney tanımlayıcısı, vücut ağırlığı ve cerrahi gününde kafes kartı açıklama. Ağrı / sıkıntı, dışkı üretim, aktivite, gıda ve su tüketimi izlenir ve 3 gün sonrası ameliyat kayıt altına alınmaktadır. Biz genellikle cerrahi sonrası ağrı veya sıkıntı belirtileri gözlemlemek olmamasına rağmen Post-operatif analjezi içme suyu (450 mg / 100 cc) asetaminofen eklenerek sağlanır.
5. 4-7 gün enjeksiyonundan sonra kuyruk kan toplama başlayın. Etiketleme ve ön tartarak kan alma tüpleri hazırlayın. Her tüpe 50 ul heparin (1000 U / ml) eklenir.
6. (1000 cc / dak teslim% 4-5 İsofluranın) 3 dakika boyunca izofluran anestezi odasına yerleştirin sıçan. (500 cc / dak teslim% 2-3 İsofluranın) burun konisi odasından ve yerden sıçan çıkarın. Kuyruk pi aşağıdaki çekme refleksi eksikliği ile gösterildiği gibi kan toplama sıçan derinden uyuşturulduktan sonra başlayabilirnch.
   1. Steril makas kuyruk (1-2 mm) kesilerek ucu kullanarak ve önceden doldurulmuş heparin tüp içine damla damla kan toplamak. Heparin oranı (> 100 ul kan / 50 ul heparin) 1 kan: hacim 2'den büyük ulaşana kadar kan toplayın. Kan alma hacimleri deneysel tasarım dayalı olarak ayarlanabilir. Kanamayı durdurmak için kuyruk kanamayı durdurucu pudra uygulamak için ıslak pamuk aplikatör kullanın.
   2. 4 ° C'de saklayın kan tüpleri sonraki örneklerin toplanması durumunda. Koleksiyonlar arasında sterilize etanol pedi ve boncuk ile makas silin.
   3. Toplama tüpleri tartılır ve 2 elde heparin ile ayarlayın: 1 oranını (kan: heparin). Bu adım, her bir örnek (Tablo 1) 'de heparin miktarını normale olacaktır.
   4. Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de. Lusiferaz deneyi (bölüm 5) zamanına kadar -80 ° C taze tüp ve saklamak için yüzer (plazma) aktarın.
      Not: 72 saat kadar önce, enzimatik deney için 4 ° C'de numunelerin depolama 'ye sahiptirlüminesans (Şekil 5A) üzerinde inimal etkisi. Plazma numunelerinin 3 kadar donma-çözülme döngüsünden lüminesans üzerinde etki göstermemiştir (Şekil 5B) sahiptir.
7. Thapsigargin uygulama (pozitif kontrol):
   1. 2.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar etanol içinde seyreltilerek thapsigargin hazırlayın. Alt karın içine 1 mg / kg ip thapsigargin enjekte edilir.
      Not: thapsigargin trombine bağlı platelet pıhtılaşmasını ¹⁷ artar ve daha zor kuyruk kan alma yapabilir.
8. Gaussia lusiferaz deneyi:
   1. Buz üzerinde plazma örnekleri çözülme.
      Uzunlamasına çalışmalarda, çözülme için ve (alt tabakanın tek hazırlık kullanarak) aynı gün tüm timepoint örnekleri için ışıldama tahlil gerçekleştirin: Not.
   2. Opak duvarlı plaka transfer plazma 10 ul ve kesit her bir plazma numunesinin 5. Çalışma 3-4 teknik çoğaltır tarif edildiği gibi enzimatik aktivitesini ölçmek.
9. Euthanasibir
   Not: SERCaMP teknolojinin avantajı monitör ER kalsiyum uzunlamasına yeteneğidir. Deneysel parametreleri ve son nokta analizleri bağlı hayvanlar son nokta analizleri için uygun ve kurumsal ACUC kurallarına uygun önlemler ötenazi edilmelidir.

5. Lüminesans Deneyi

1. 20 mM (3 ml metanol, 10 N HCI 30 ul) ile asitleştirildi, metanol içinde bir bileşik seyreltilmesiyle coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. -80 ° C tek kullanımlık alikotları ve mağaza hazırlayın.
2. Deney gününde çalışan alt-tabakanın hazırlanması.
   1. In vitro değerlendirmeler için, örneğin, PBS içinde 8 uM koelenterazin seyreltik PBS, 25 ml 20 mM CTZ stokunun 10 ul (Şekil 6A, B).
   2. İn vivo deneyler için, PBS içinde 100 uM, 500 mM askorbik asit, 5 mM NaCl koelenterazin seyreltin.
3. En az 30 dakika süreyle inkübe edin hazırlanan CTZtahlili başlamadan önce oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
   Not: hazırlanması sonra ilk 30 dakika boyunca hızlı bir şekilde alt-tabaka çürüme çalışma vardır Bu adım genellikle Gaussia lusiferaz analizleri dahildir. Bizim sistemde (Şekil 6C) bu etkiyi gözlenen değil; Biz tahlil üzerinde hiçbir olumsuz etkisi bulduk gibi ancak, biz sık sık kuluçka aşamasını içerir.
4. İzleme biyolüminesans edebilen bir alt-tabaka enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak. Substrat ile Başbakan hatları.
   Not: hatları üzerinden, ilk alt-tabaka bozunmaya eğilimli olabilir. Erken örnekleri için yapay olarak düşük okumaları önlemek için deneysel örnekleri ölçümünden önce (okuyucu boş bir levha yüklenmesi) 20-30 boş kuyu enjekte edilir.
5. , Kuyunun içine substrat 100 ul enjekte 5 saniye boyunca orta hız sallamak ve ışık emisyon ölçümü. Biotek Sinerji II plaka okuyucu için, (0.5 sn boyunca (in vitro örnekleri) ve 5 saniye ışık emisyonu entegreokuma adımı için in vivo örnekleri). İdeal tahlil performansı için plaka okuyucu parametrelerini optimize.
   Not: (diğer lusiferazlarm gözlenen kinetik kızdırma karşılaştırıldığında) hızlı sinyal çürümesi ile Gaussia lusiferaz sergiler flaş kinetiği. Glukozit flaş kinetiği örnekleri arasında, orta bileşimin kontrol edilmesinin önemini vurgular hücre kültür ortamı (Şekil 7A) serum etkilenir. Nedeniyle alt tabaka (flaş kinetik) eklendikten sonra lüminesans hızlı çürüme, enjekte ve tüm örnekler için üniform olmalıdır adımları okumak arasında zaman. Plaka okuyucu (biz 5 sn sallamak adımı kullanmak gibi) ve bu iyi okumak sabit bekleme süresi, bir kuyunun alt tabakayı enjekte ayarlanmalıdır. Alt-tabaka, aynı anda tüm oyuklara ilave edilebilir sürece okumadan önce bütün bir plaka alt-tabakanın eklenmesi önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bir enjektör kullanılabilir durumda değilse, sorunu kısmen alt-tabaka addin arasında 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırılarak atlatılabiliryon ve ölçüm (Şekil 7B) (böylece bozulma eğrisinin dik parçası kaçınarak).
6. , Enjeksiyon Tekrar bekleme süresi ve iyi plaka üzerinde her adımları okuyun.

Sonuçlar

Glukozit-SERCaMP yöntemi dışı sıvılar örnekleyerek ER kalsiyum homeostasisin değerlendirilmesi için izin verir. Birkaç kontrol sonuçların yorumlanmasını geliştirmek için deney tasarımı dahil edilebilir. İlk olarak, (C-terminali ASARTDL veya "glukozit-Resim Tag" olmayan, örneğin glukozit) kurucu salgılanmış habercinin kullanılması salgı yoluna (global hücresel sekresyon) ve transgen ekspresyonu üzerindeki deneysel tedavilerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. ...

Tartışmalar

Bu protokol, in vitro vurgular ve glukozit-SERCaMP in vivo programı ER kalsiyum tükenmesi izlemek için. SERCaMP oluşturmak için protein modifikasyonu, diğer raportör protein ¹² genelleme gibi görünüyor olsa da, biz diğer lusiferazlarm ¹⁸ oranla sağlam (200-1,000 kat daha büyük) biyoparlaklık için Gaussia lusiferaz seçti. Primer sıçan kortikal nöronlarında, SH-SY5Y hücrelerinin ve sıçan karaciğer teslim glukozit-SERCaMP virüsünün 100 ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL tubes	Fisher	02-682-550
10% NP-40 solution	Pierce	28324	for intracellular GLuc assays
1mL luer-lok syringes	Fisher	14-823-30
200uL filter tips	Rainin	RT-L200F
3-0 surgical sutures	Fisher	NC9598192
30g needles	Fisher Scientific	14-821-13A
Adhesive microplate sealing sheets	Thermo	AB-0558
Alcohol prep pads	Fisher	22-246-073
Anesthesia Auto Flow System	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
Animal recovery chamber	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Betadine solution	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Bovine growth serum	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Cotton tipped applicators	Puritan	806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures	WPI	501803
Digital ultrasconic cleaner	Fisher Scientific	FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
DNA mass ladder	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic powder	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Methanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifuge	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR film seal	Fisher	AB0558
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Scalpel blades, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200g	Charles River	Rats	rats ordered at 150-200g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags	National Band and Tag co	1005-1
Sterile surgical drapes	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 plate reader	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Transfection reagent	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX