كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Summary

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Abstract

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.

By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Introduction

تراكم داخل الخلايا تاو amyloids يعرف tauopathies مثل مرض الزهايمر. في مراحل المرض المبكرة، يتم ترجمة الأمراض عموما إلى مناطق منفصلة من الدماغ، ولكن مع تطور المرض، والأمراض ينتشر دائما على طول الشبكات العصبية متميزة ^1-5. وتشير الأدلة المتراكمة الانتشار العابر للمن المجاميع البروتين السامة راء هذه الأمراض (إعادة النظر في ^10/6). في هذا النموذج، يتم الافراج بذور proteopathic (على سبيل المثال، تاو) من الخلايا المانحة، وتدخل الخلايا المجاورة، وتحويل البروتين تاو الأصلي في شكل تتجمع عبر قالب تغيير متعلق بتكوين ^11-15. وقد تم تطوير هذا الفحص الموصوفة هنا للكشف عن حساسية هذا النشاط البذر. وهو متوافق مع المؤتلف البروتين والعينات البيولوجية وتمكن الكمي لمستويات دقيقة من النشاط البذر proteopathic ^16.

خلايا كلوة 293T التي تعبر عن ثابت تاو تكرار دomain (RD) التي تحتوي على طفرة P301S الأمراض المرتبطة تنصهر فيها إما CFP أو YFP (يشار إليها فيما يلي باسم خلايا تاو-RD-CFP / YFP) بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي مستقر من النشاط البذر. في غياب البذور proteopathic، الخلايا تحافظ تاو كما مونومر القابلة للذوبان، وليس لها أي الحنق خلفية ملموس. امتصاص عفوية أو بوساطة الحويصلية تنبيغ من بذور تاو في الخلايا، ولكن النتائج في RD-CFP وRD-YFP التجميع، التي تنتج إشارة الحنق أن يقاس داخل الخلايا واحدة عن طريق التدفق الخلوي.

تم هندستها مكونات عديدة من هذا الاختبار لتعزيز الحساسية والحد من التقلبات. وقد تم اختيار 1 RD-CFP / YFP نسبة التعبير، كما أنه يوفر إشارة الأمثل:: خط خلية وحيدة النسيلة مع 1 الضوضاء. لزيادة حساسية، وتستخدم الدهون الفوسفاتية لتقديم البذور مباشرة في الخلايا (على الرغم من أن دراسة الآليات البيولوجية للامتصاص، وهذا يمكن أن يتم حذف). وأخيرا، التدفق الخلوي المراقبين الحنق على مستوى السكان وخلية واحدة مستوى، خلافا لغيرها من فحوصات البروتين التجميع. وقياس النتيجة النهائية، والكثافة الحنق متكاملة، كمي للغاية ويمثل على حد سواء لعدد من الخلايا مع التجميع، والدرجة التي حدث التجميع داخل كل خلية. كل هذه المعلمات الأمثل تعزيز حساسية وضمان التكاثر.

كان يعمل هذا النظام مؤخرا في دراسة شاملة في المعدلة وراثيا P301S الفئران tauopathy ¹⁷ التي قيمت بداية الزمني وتطور تاو النشاط البذر نسبة إلى أخرى تاو تستخدم عادة علامات مرضية (على سبيل المثال، MC1، AT8، PG5، وThioflavinS). النشاط البذر هو إلى حد بعيد أقرب وأقوى علامة من تاو أمراض تقييمها، وذلك قبل الكشف النسيجي بنسبة 6 أسابيع على الأقل. يبدو النشاط البذر في 1.5 شهر ويزيد تدريجيا مع التقدم في السن، مما يشير إلى دور المسببة للبذور proteopathic في بداية و / أو تقدم من التنكس العصبي ^16.

e_content "> الكميات الدقيقة لمستويات دقيقة من المواد البذور من العينات البيولوجية يمكن أن تسهل الدراسات التي ترصد تطور المرض في وقت مبكر. بتقصير مدة المحاكمة وتمكين استخدام الحيوانات الأصغر سنا، وهذا يمكن أن يزيد من كفاءة ودقة التجارب على الحيوانات قبل السريرية. على سبيل المثال، في وP301S الماوس سبق وصفها، يمكن أن يتم تسليم مركبات الرصاص في وقت مبكر من 4-6 أسابيع (مباشرة قبل أو في بداية النشاط البذر)، ورصدت لفعالية 2-4 أسابيع في وقت لاحق. الفحص يجب تحديد بدقة أي تخفيضات في البذر النشاط. الحنق التدفق الخلوي ويمكن اختبارها في المختبر فحص التطبيقات كذلك. على سبيل المثال، الكواشف مكافحة تاو (على سبيل المثال، والأجسام المضادة، والجزيئات الصغيرة، وغيرها) بسرعة لقدرتها على منع البذر تحريض مباشرة في الثقافة، وذلك باستخدام إما تاو المؤتلف المجاميع أو لست] المستمدة من الدماغ كمصدر البذور (الشكل 5). مع هذا الإعداد، بعد الانتهاء من إعداد المواد البذور، وهو رئيس سابقملصقة يأخذ ثلاثة أيام فقط لإكمال، بما في ذلك تحليل البيانات. وبالتالي يمكن تحديد الكميات السريع النشاط البذر proteopathic تسهيل العديد من الدراسات من التنكس العصبي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يؤكد هذا البروتوكول استخدام الحنق قياس التدفق الخلوي للكشف عن النشاط البذر من العينات البيولوجية الماوس. كما أنه متوافق مع الألياف المؤتلف والعينات البيولوجية البشرية. تم تنفيذ القتل الرحيم الماوس والدماغ الحصاد وفقا للإجراءات المعتمدة IACUC.

1. استخراج الدماغ

1. وبعد التخدير العميق مع isoflurane (2٪)، يروي ماوس مع PBS الجليد الباردة التي تحتوي على 0.03٪ الهيبارين، واستخراج الدماغ التالية تفاصيل وصفها في غيج وآخرون ¹⁸
2. وضع الأنسجة المستخرجة في-قنينة البرد، والمفاجئة تجميد بالوضع في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، وتجميد الأنسجة على الثلج الجاف. مرة واحدة المجمدة، ونقل الأنسجة ل-80 ° C وتخزينها لفترة طويلة من الزمن، إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: هذا البروتوكول هو متوافق مع الخليط الدماغ كله أو مناطق الدماغ تشريح الصغرى. رؤية Hagihara آخرون لمفصل بروتوكول الدقيقة تشريح ^19.

2. إعداد البيولوجية البذور المواد

1. إعداد العازلة تجانس عن طريق إذابة مثبطات الأنزيم البروتيني (EDTA الحرة) في 1X TBS (1 قرص لكل 10 مل). دوامة بقوة، ومتجر على الجليد. يجب أن تكون مثبطات الأنزيم البروتيني EDTA مجانا من أجل الحفاظ على جهاز الاستشعار البيولوجي بقاء الخلية.
2. تزن أنسجة المخ المجمدة في وزن القارب القابل للتصرف، ونقل إلى 5 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة الجليد الباردة عازلة التجانس مثل أن الحل النهائي هو 10٪ الوزن / الحجم. تخزين مؤقتا على الجليد. سوف كتلة الأنسجة وتجانس لاحقا حجم العازلة تختلف تبعا لحجم الدماغ و / أو المناطق المستخدمة. هنا، يتم تعليق لhemibrain الماوس الكبار وزنها 0.2 غرام في 2 مل 10٪ ث / حل المجلد.
3. عينات نقل إلى غرفة باردة، وضبط sonicator التحقيق إلى الإعدادات المناسبة. لجنة التحقيق صوتنة مع أومني Ruptor (كما هو موضح هنا)، تعيين قوة إلى 20٪، وهو ما يعادل حوالي 75 W. استخدام وضع النبض لضمان العينات لا يتم اوفإيه ساخنة خلال صوتنة. ضبط بولسير إلى 30٪، أي ما يعادل حوالي 500 مللي ثانية.
4. تنظيف غيض من sonicator التحقيق من قبل الشطف بالماء، الأيزوبروبانول، والماء مرة أخرى، محو التحقيق في ما بين كل حل. تكون على يقين من شطف ومسح كلا الجانبين والجزء السفلي من التحقيق مع مختبر مناديل.
5. العمل مع عينة واحدة في وقت واحد، غمر تلميح التحقيق في المخزن المؤقت التجانس، وبدء sonicator. باستخدام إعدادات الطاقة وبولسير المذكورة أعلاه، وتقديم 25 مجموع البقول. تأكد من أن الأنسجة تماما في تعليق. كن حذرا لتجنب الرغوة من العينة خلال هذه الخطوة.
   ملاحظة: عينات عرضة للرغوة إذا أ) إجمالي حجم منخفض أو ب) ارتفاع درجة حرارة تصل جناسة. مع هذه الأداة محددة، لا يصوتن مع كميات أقل من 250 ميكرولتر. لضمان البقاء عينات المبردة، قد يتم تخزين أنابيب على الجليد خلال هذه الخطوة.
6. تنظيف التحقيق من قبل القضاء بعيدا المحللة المتبقية، ثم تقديم 10 البقول إلى س الكأسالمياه النظيفة و. شطف الجانبين والجزء السفلي من التحقيق مع الماء، الأيزوبروبانول، والماء مرة أخرى (كما في الخطوة 2.4)، ومحو تجف بين كل خطوة. لتجنب التلوث، وشطفها جيدا التحقيق في ما بين العينات.
   ملاحظة: مع المجاميع تاو، لم نجد أن طرق تنظيف أكثر صرامة ضرورية لمنع تلوث عينة إلى عينة. amyloids الآخرين، ومع ذلك، قد يحتاجون إلى رعاية إضافية التي وصفت على نطاق واسع في الأدب ^20،21.
7. متجر الخليط على الجليد حتى يتم معالجة كافة العينات.
8. تدور الخليط في 21300 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
9. طاف لنقل أنبوب نظيفة، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. تجاهل بيليه. قسامة وطاف، ومخزن لست] في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى. تجنب تجميد / الذوبان دورات من الخليط، ومع ذلك، وهذا يقلل من كفاءة البذر.

3. خلايا Replating جهاز الاستشعار البيولوجي

ملاحظة:استخدام أربعة خطوط الخلايا لهذا الاختبار: كلوة 293T (خلية خط رقم 1)، RD-P301S-CFP (خلية خط 2 #)، RD-P301S-YFP (خلية خط # 3)، وRD-P301S-CFP / YFP ( خط الخلية رقم 4). الرجاء الرجوع الجدول رقم 1 لمساهمة كل سطر الخلية إلى الفحص.

1. في بيئة معقمة، والثقافة، نضح المتوسطة. شطف الخلايا مع PBS الدافئ، ونضح. يعرض للتريبسين الخلايا (3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪)) لمدة 3 دقائق، يطفئ مع ثقافة الحارة المتوسطة (9 مل من DMEM، و 10٪ FBS، 1٪ القلم / بكتيريا، 1٪ GlutaMax)، ونقل على الفور الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل.
2. خلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح المتوسطة، وبيليه الخلية resuspend في المتوسط ​​الدافئة الثقافة.
3. باستخدام عدادة الكريات، وتحديد كثافة الخلية لكل خط الخلية. وتختلف كثافة الخلايا اعتمادا على confluency في وقت الحصاد وحجم إعادة تعليق. Resuspend الخلايا التي تحصد من طبق 10 سم في 90٪ confluency في 10 مل وسائل الإعلام، لكثافة الخلايا لتكون ما يقرب من 1 مليون خلية / مل.
4. صنعمزيج الرئيسي للخلايا + وسائل الإعلام بحيث كل بئر من 96 لوحة جيدا سيتضمن 35،000 الخلايا في 130 ميكرولتر وسائل الاعلام (على سبيل المثال، لجعل مزيج الرئيسي ل 100 بئرا، و resuspend 3.5 مليون الخلايا في 13 مل سائل الإعلام). تعديل عدد الخلايا لتتناسب مع التصاميم والجداول الزمنية التجريبية الفردية. لعلاج الخلايا ~ 18 ساعة بعد الطلاء، إضافة 35،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 96-جيدا.
5. باستخدام الماصة متعدد القنوات، ماصة ببطء 130 ميكرولتر من مزيج الرئيسي تعليق خلية في كل بئر من مسطحة القاع، زراعة الأنسجة المعالجة 96 لوحة جيدا. بينما طلي، ضع طرف الماصة في وسط البئر، وليس لمس الجزء السفلي من لوحة.
   ملاحظة: على الرغم من الطلاء شكل يمكن تعديلها، مما ن = 4 آبار لكل من خطوط الخلايا 1-3 في لوحة يوصى. محجوز ما تبقى من لوحة (ن = 84) لخط الخلية رقم 4 (خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي).
6. السماح للخلايا لتسوية من خلال ترك لوحة دون عائق لمدة 10 دقيقة في RT. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، و&# 8805؛ الرطوبة النسبية 80٪.

4. خلايا علاج

ملاحظة: في اليوم التالي، عندما خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تاو هي 60-65٪ متموجة، وإعداد مجمعات تنبيغ البذور على النحو التالي:

1. في أنبوب واحد، والجمع بين ترنسفكأيشن الكاشف، مثل Lipofectamine، مع وسائل الاعلام خفض المصل، مثل غروب MEM، لجعل مزيج الرئيسي. لكل بئر، إضافة 1.25 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن و 8.75 ميكرولتر وسائل الاعلام خفض المصل. أنبوب نفض الغبار برفق لمزج، لفترة وجيزة تدور باستمرار، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
2. في أنبوب آخر، والجمع بين المواد البذور (قسامة من المحللة من الخطوة 2.9) مع وسائل الاعلام خفض المصل.
   ملاحظة: حجم المواد البذور تختلف وفقا لتجربة فردية. عند اختيار حجم البذور، وتأخذ بعين الاعتبار: فرة من البذور في عينة والسمية المحتملة. يمكن الخليط الخام تكون سامة للخلايا. على هذا النحو، استخدم أدنى حجم ممكن لرصد تأثير المطلوب. أحجام التداول في السابق اختبار من المحللة / جيد نطاق الاب OM 1-5 ميكرولتر الموافق البروتين الكلي 5-20 ميكروغرام. ضمان أن الحجم الكلي لكل بئر (بذور + وسائل الاعلام خفض المصل) هو 10 ميكرولتر.
3. الجمع بين محتويات من الأنابيب المذكورين في 4.1 و 4.2، ونفض الغبار بلطف لمزج، لفترة وجيزة تدور باستمرار (1000 x ج، 5 ثانية)، واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 2 ساعة.
4. ماصة بلطف 20 ميكرولتر من مجمع تنبيغ على الجانب الآبار جهاز الاستشعار البيولوجي الفردية. استخدام ثلاثة مكررات الفنية، إذا كان ذلك ممكنا. العودة الخلايا المعالجة إلى حاضنة لمدة 24-48 ساعة. احتضان تحت نفس الشروط كما هو موضح في الخطوة 3.6.
   ملاحظة: حالة سيطرة سلبية المناسبة لهذا الإعداد هو خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي تعامل مع الجسيمات الشحمية فارغة (أي الحويصلية كاشف + وسائل الاعلام خفض المصل) لتطبيق الفوسفورية يدخل تحولا طفيفا في ملف تعريف مضان نسبة إلى جهاز الاستشعار البيولوجي خلايا غير معلن لالحويصلية كاشف.

5. الخلايا حصاد لالحنق التدفق الخلوي

الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: قبل حصاد الخلايا عموما 24-48 ساعة بعد المعاملة فمن الممكن الحصول على قراءات أولية من النشاط البذر باستخدام فلتر GFP على مستوى مقلوب مضان المجهر. والخلايا المعالجة بدون مواد البذور (أي الجسيمات الشحمية فارغة) تظهر مضان منتشر، في حين أن الخلايا المعالجة بمادة البذور سوف تظهر منقط المكثف والادراج شبكي داخل الخلايا (الشكل 1A - B).

1. باستخدام الماصة متعدد القنوات، ونضح كل خلية متوسطة (150 ميكرولتر). يعرض للتريبسين (50 ميكرولتر) خلايا لمدة 5 دقائق، وإخماد مع 150 ميكرولتر المبردة متوسطة الثقافة. لا تشمل شطف PBS قبل trypsinization في هذه الخطوة، لأنها قد تسبب رفع الخلايا وفقدان الخلية اللاحقة. استبعاد أي خلايا ميتة تلويث والحطام خلال التدفق الخلوي عبر استراتيجيات النابضة.
2. مباشرة بعد التبريد، نقل الخلايا إلى 96 جولة جيدا لوحة أسفل، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 ميلن في RT.
3. نضح وتجاهل المتوسطة، مع الحرص على تجنب إزعاج بيليه الخلية.
4. بلطف، ولكن بدقة، resuspend الكرية خلية في 50 ميكرولتر 2٪ امتصاص العرق، واحتضان لمدة 10 دقيقة. بدلا من ذلك، قم بتشغيل الخلايا الحية، على الرغم من تثبيت يوفر نتائج أكثر نظافة وأكثر اتساقا.
5. خلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح وتجاهل امتصاص العرق، مع الحرص على تجنب إزعاج بيليه الخلية.
6. بلطف، ولكن بدقة، resuspend الكرية الخلية في 200 ميكرولتر تدفق المبرد الخلوي العازلة (HBSS، 1٪ FBS، 1 ملم EDTA) وتشغيل لوحة في أقرب وقت ممكن لتجنب تراكمها الخلية.

6. الحنق التدفق الخلوي

ملاحظة: استخدام قياس التدفق الخلوي مثل MACSQuant VYB، وهو مجهز الحنق متوافق مع خطوط الليزر ومجموعات فلتر (الجدول 2). لكل خطوة في هذا القسم، انقر فوق البئر ذات الاهتمام باستخدام قالب 96 جيدا البرمجيات، وانقر"مسرحية" لبدء امتصاص العينة والتدفق. جعل المؤامرات أو جداول الإحصاءات بالنقر على "تحليل نافذة جديدة" رمز. تغيير معالم محور على قطع ذات المتغيرين الفردية من خلال النقر على عنوان إما X أو Y محور واختيار المرشح المناسب. لتحويل السكان الخلية أو إشارات مضان، زيادة أو نقصان الفولتية المرتبطة الفلاتر المناسبة. مع هذه الأداة، تشغيل <1000 أحداث / ثانية لضمان دقة الرصد وحيدة الخلية.

1. جعل الجانب مبعثر المساحة (SSC-A) مقابل الأمام مبعثر المساحة (FSC-A) مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، ومع خط الخلية رقم 1 على التوالي، وضبط SSC وFSC الفولتية حتى السكان الخلية في الربع السفلي الأيسر. انقر فوق الأداة مضلع، وتعريف السكان الخلية (بوابة P1). لجميع المعلمات النابضة انظر الشكل 2.
2. جعل FSC-H (الارتفاع) مقابل FSC-A ثنائي المتغير المؤامرة، وتطبيق بوابة P1 لهذه المؤامرة بالنقر على "العيش" فوق مؤامرة، واختيار P1. مع خط الخلية # 1تشغيل، انقر فوق أداة المضلع، وتحديد الخلايا واحد (بوابة P2).
3. تقديم 3 قطع الرسم البياني، واحدة لكل من المرشحات للاهتمام: الحراجية، YFP، والحنق. تطبيق بوابة P2 إلى كل هذه المؤامرات بالنقر على "العيش" فوق المؤامرات، واختيار P2. مع خط الخلية رقم 1 على التوالي، وضبط الفولتية مثل أن سكان الخلية متوسط ​​في CFP، YFP، والحنق رسوم بيانية كلها بين 0 و 1. قياس CFP والحنق، تثير الخلايا مع ليزر 405 نانومتر، والتقاط مضان مع 450/50 نانومتر و 525/50 نانومتر مرشح، على التوالي. لقياس YFP، تثير الخلايا مع ليزر والقبض مضان 488 نانومتر مع 525/50 نانومتر التصفية. وكذلك وصف إعدادات الليزر والمرشح في الجدول 2.
4. أداء التعويض عن CFP امتداده إلى القنوات الحنق وYFP.
   ملاحظة: التعويض هو عملية تصحيح مضان غير المباشرة. يحدث مضان غير المباشرة كلما تم الكشف عن الانبعاثات مضان من تألقي واحدة خلال دس مرشحgned لقياس إشارة من تألقي آخر. مع التعويض المناسب، يمكن إزالة امتداد مضان CFP من القنوات الحنق وYFP.
   ملاحظة: يتطلب التعويض وجود كل من خلايا -positive و-negative مضان. وهكذا، للتعويض عن الخلايا CFP الإيجابية (خلية خط 2 #)، وخلايا السلبية (خلية خط رقم 1) يجب أن يضاف إلى العينة السابقة للتشغيل.
   1. ارتفاع في 30 ميكرولتر من خط الخلية # 1 تعليق من نفس واحدة بشكل جيد في 200 ميكرولتر من خط الخلية رقم 2 تعليق مسبق على الفور لتعويض.
   2. انقر على "إعدادات الصك" رمز، ثم علامة التبويب "التعويض"، وتحقق "المصفوفة" لفتح الجدول التعويض.
   3. جعل الحنق-A مباراة CFP-A مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، وتطبيق بوابة P2، كما هو موضح في الخطوة 6.3. مع خطوط الخلايا 1 + 2 على التوالي، انقر على أيقونة "رباعي" ورسم الأرباع بحيث يتم فصل مضان -negative و-positive السكان من السفليين الأرباع (غيتس LL3 لالثاني LR3، على التوالي).
   4. إنشاء جدول الإحصاءات أن يعرض شدة متوسط ​​مضان (MFI) من الحنق لLL3 وبوابات LR3. ضبط المعلمة الحنق في مصفوفة التعويض حتى مؤسسات التمويل الأصغر للإشارة الحنق ما يعادل بين LL3 وLR3. وبعد هذه الخطوة، ومؤسسات التمويل الأصغر للإشارة الحنق تساوي بين الخلايا غير ملوثين والخلايا CFP إيجابية، مما يشير إلى غياب CFP امتداده إلى قناة الحنق.
   5. جعل YFP-A مباراة CFP-A مؤامرة ثنائية المتغيرات bivariate، وتطبيق بوابة P2، كما هو موضح في الخطوة 6.3. رسم الأرباع (LL4 وLR4) مماثلة لتلك التي فعلت في الخطوة 6.4.3.
   6. إنشاء جدول الإحصاءات أن يعرض مؤسسات التمويل الأصغر من YFP لLL4 وLR4. ضبط المعلمة YFP في مصفوفة التعويض حتى مؤسسات التمويل الأصغر للإشارة YFP ما يعادل بين LL4 وLR4. وبعد هذه الخطوة، ومؤسسات التمويل الأصغر من إشارة YFP تساوي بين الخلايا غير ملوثين والخلايا CFP إيجابية، مما يشير إلى غياب CFP امتداده إلى القناة YFP.
5. الفلبسبب الإعداد بوابة والتعويض، وتسليط الضوء الآبار المصالح وتشغيل ما تبقى من لوحة.
6. بعد أن تم تشغيل جميع العينات، وملفات البيانات التصدير عن طريق النقر على 'الملف'، ثم 'نسخة'. حدد علامة التبويب "ملفات البيانات"، تسليط الضوء على التجربة المجلد، ثم انقر 'نسخة'.

تحليل 7. البيانات

ملاحظة: تغيير المعلمات محور على قطع ثنائية المتغيرات bivariate الفردية من خلال النقر على عنوان إما X أو Y محور واختيار المرشح المناسب.

1. ملفات FCS مفتوحة في التدفق الخلوي برنامج التحليل.
2. على أساس الخصائص مبعثر، واستخدام بوابة مضلعة لتعريف السكان الخلية (SSC مقابل FSC) والسكان القميص (FSC-H مقابل FSC-A) من الخلايا المعالجة مع الجسيمات الشحمية فارغة، على غرار تلك التي وصفها في القسم 6.
3. إذا تم إجراء تعويض CFP أثناء الإعداد، لا مزيد من ضبط CFP.
4. إنشاء الحنق ضد YFP ذات المتغيرين المؤامرة. باستخدام خط الخلية رقم 3وتحديد بوابة الحنق كاذبة عن طريق رسم بوابة متعددة الأضلاع الذي يمتد على طول المنحدر من السكان خلية الحنق إيجابي. هذه البوابة تستثني YFP خلايا وحيدة إيجابية التي تنبعث منها إشارة داخل فلتر الحنق، وضعت مماثلة لتلك التي أظهرت في وقت سابق عن طريق حظر وآخرون ²²
5. تعريف بوابة الحنق بالتآمر خلايا فارغة المعالجة الحويصلية CFP / YFP على الحنق ضد CFP ذات المتغيرين المؤامرة. إدخال بوابة مضلعة على طول المنحدر من السكان التي تمتد إلى أعلى ونحو اليسار بعيدا عن السكان. هذه البوابة ينبغي أن تستبعد معظم الخلايا (~ 99٪)، مثل هذه الخلفية الحنق هو ≥1٪ من الخلايا. وتعتبر أي أحداث هذا التحول في هذه البوابة الحنق إيجابي.
   ملاحظة: يتم تطبيق كل بوابة الفردية المذكورة أعلاه لجميع العينات قبل إنشاء بوابات لاحقة. بعد تحليل، يتم تعريف أربع بوابات الفردية (السكان الخليوي، القميص؛ الحنق كاذبة؛ الحنق).
6. المعلمات تحليل سجلات المصالح، بما في ذلك: في المئة الإيجابية الحنق ومؤسسات التمويل الأصغرمن الخلايا الحنق إيجابي. حساب يدويا كثافة الحنق متكاملة عن طريق قياس نتاج المئة الإيجابية ومؤسسات التمويل الأصغر.
   ملاحظة: إذا تم استخدام كثافة الحنق المتكاملة كتدبير النتيجة، تعيين الحنق الخلفية (كما هو موضح في الخطوة 7.5) ومؤسسة التمويل الأصغر إلى أكبر من أو يساوي 1 من أجل تجنب حساب المنتج الذي هو أقل من العوامل الفردية اثنين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التدفق الخلوي الحنق تمكن الحساسة، الكمية، والكشف السريع عن النشاط البذر من عينات المؤتلف أو البيولوجية. إعداد الاختبار هو سطحي: يتم transduced خطوط الخلايا مستقرة وحيدة النسيلة مشتقة من التعبير عن تاو-RD-CFP / YFP مع المواد البذور، والمحتضنة لمدة 24-48 ساعة، وتعرض لتحليل التدفق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الحنق التدفق الخلوي النظام المذكور هنا هو أداة قوية لبسرعة وكميا تقييم النشاط تاو البذر. لا يتطلب سوى المعتدلة تجربة زراعة الخلايا ومعرفة عمل من الحنق والتدفق الخلوي. المقايسات البذر الأخرى، مثل Thioflavin T - الذي يسلك تعزيز مضان عندما يتجهون إلى هيكل رقة بيتا - هي شاقة وت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBS	Sigma	T5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)	Roche	4693159001
Cryo-vials	Sarstedt	72.694.006
Analytical Balance	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml conical tube	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer	Omni International	18-000-115
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Noise Cancelling Ear Muffs	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
1.5 ml tubes	USA Scientific	1615-5510
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml Conical Tubes	Phenix Research	SS-PH15
25 ml reagent resevoirs	VWR	41428-954
Multi channel pipet	Fisher Scientific	TI13-690-049
96 well flat bottom plates	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 well round bottom plates	Corning	3788
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 Centrifuge	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003796
Hemacytometer	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Flow Cytomter	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo analysis software	Flow Jo
20 μl pipet tips	Rainin	GPS-L10
200 μl pipet tips	Rainin	GPS-250
1 ml pipet tips	Rainin	GPS-1000
200 μl pipet tips	USA Scientific	1111-1800
5 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-606180
10 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-607180
25 ml Serological pipett	Phenix Research	SPG-760180