Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

Résumé

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Résumé

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.

By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Introduction

L'accumulation intracellulaire de la protéine tau amyloïdes tauopathies définit comme la maladie d'Alzheimer. Dans les stades précoces de la maladie, la pathologie est généralement localisée à des régions discrètes du cerveau, mais avec la progression de la maladie, la pathologie se propage le long de invariablement réseaux neuronaux distincts ^1-5. L'accumulation de preuves suggère transcellulaire propagation d'agrégats de protéines toxiques à la base de cette pathologie (revue dans ^10/06). Dans ce modèle, les graines proteopathic (par exemple, tau) sont libérés de cellules du donneur et pénètrent dans les cellules voisines, la transformation de la protéine tau natif dans le formulaire mal repliées via templated changement conformationnel ^11-15. L'essai décrit ici a été développé pour détecter sensibilité telle activité d'ensemencement. Il est compatible avec la protéine recombinante et des échantillons biologiques et permet la quantification des niveaux d'activité minute d'ensemencement proteopathic ^16.

Des cellules HEK 293T qui expriment de manière stable la protéine tau répétition dOMAINE (RD) contenant le P301S mutation associée à la maladie soit fusionnée à PCP ou YFP (ci-après dénommé cellules tau-RD-CFP / YFP) servir un biocapteur stable de l'activité d'ensemencement. En l'absence de graines proteopathic, maintenir les cellules tau en tant que monomère soluble, pas de fond et ont FRET appréciable. L'absorption spontanée ou transduction médiée par des liposomes de graines de tau dans les cellules, cependant, conduit à RD-CFP et YFP-agrégation RD, qui produit un signal de FRET qui est mesurée dans des cellules individuelles par cytométrie en flux.

De nombreux composants de cet essai ont été conçus pour améliorer la sensibilité et de réduire la variabilité. Une lignée cellulaire monoclonal avec un 1: RD-CFP / YFP 1 ratio d'expression a été choisi, car il fournit un signal optimal: le bruit. Pour augmenter la sensibilité, les phospholipides sont utilisés pour introduire les graines directement dans les cellules (bien que d'étudier les mécanismes biologiques de l'absorption, cela peut être omise). Enfin, la cytométrie de flux moniteurs FRET au niveau de la population et une seule cellule niveau, contrairement à d'autres essais d'agrégation des protéines. Le critère d'évaluation finale, la densité de FRET intégré, est hautement quantitative et représente à la fois pour le nombre de cellules présentant l'agrégation, et la mesure dans laquelle l'agrégation a eu lieu au sein de chaque cellule. Tous ces paramètres optimisés améliorer la sensibilité et de garantir la reproductibilité.

Ce système a été récemment utilisé dans une étude approfondie dans les souris transgéniques tauopathie P301S ¹⁷ qui a évalué l'apparition temporelle et la progression de l'activité d'ensemencement de tau par rapport à d'autres marqueurs pathologiques de la protéine tau couramment utilisés (par exemple, MC1, AT8, PG5, et thioflavines). L'activité de semis est de loin le marqueur précoce et le plus robuste de la pathologie tau évalué, précédant la détection histologique par au moins 6 semaines. Semis activité apparaît à 1,5 mois et augmente progressivement avec l'âge, ce qui suggère un rôle causal de graines proteopathic dans l'apparition et / ou la progression de la neurodégénérescence ^16.

e_content "> quantification précise des niveaux infimes de matériel de semence à partir d'échantillons biologiques peut faciliter les études qui surveillent la progression de la maladie au stade précoce. En raccourcissant la durée du procès et permettant l'utilisation d'animaux plus jeunes, ce qui pourrait accroître l'efficacité et la précision des essais précliniques animales. Par exemple, dans P301S la souris décrit ci-dessus, les composés du plomb peuvent être fournis aussi tôt que 4-6 semaines (juste avant, ou au début de l'activité d'ensemencement), et pour surveiller l'efficacité 2-4 semaines plus tard. Le dosage devrait quantifier avec précision toute réduction des semis activité. FRET cytométrie en flux a in vitro applications de criblage ainsi. Par exemple, des réactifs anti-tau (par exemple, des anticorps, de petites molécules, etc.) peut être testé rapidement pour leur capacité à bloquer l'ensemencement induction directement dans la culture, en utilisant soit la protéine tau recombinante agrégats ou lysats dérivé du cerveau comme une source de graines (figure 5). Avec cette configuration, une fois matériel de semence est préparé, un exexpé- prend seulement trois jours pour compléter, y compris l'analyse de données. La quantification rapide de l'activité d'ensemencement proteopathic peut donc faciliter de nombreuses études de la neurodégénérescence.

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Protocole

NOTE: Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de FRET cytométrie en flux pour détecter l'activité d'ensemencement à partir d'échantillons biologiques de la souris. Il est également compatible avec des fibrilles recombinantes et des échantillons biologiques humains. Souris l'euthanasie et le cerveau la récolte a été effectuée conformément aux procédures IACUC approuvés.

1. Extraction cerveau

1. À la suite de l'anesthésie profonde avec de l'isoflurane (2%), perfuser une souris avec du PBS glacé contenant 0,03% de l'héparine, et extraire le cerveau en suivant les indications de Gage et al. ¹⁸
2. Placez le tissu extrait dans un cryo-fiole, et enclenchez gel en plaçant dans l'azote liquide. Alternativement, geler les tissus sur glace sèche. Une fois congelés, transférer tissu à -80 ° C et magasin pour une période de temps prolongée, si nécessaire.
   Remarque: Ce protocole est compatible avec des homogénats de cerveaux entiers ou de régions du cerveau micro-disséqué. Voir Hagihara et al. Pour un protocole détaillé micro-dissection ^19.

2. Préparation des semences du matériel biologique

1. Préparation du tampon d'homogénéisation par dissolution d'inhibiteurs de la protéase (EDTA libre) dans TBS 1x (1 comprimé pour 10 ml). Vortex vigoureusement, et conserver dans la glace. Les inhibiteurs de protéase doivent être EDTA libre afin de préserver la viabilité des cellules biocapteur.
2. Peser le tissu cérébral congelé dans un bateau peser jetable, et la transfère dans un tube conique de 5 ml. Ajouter du tampon d'homogénéisation glacé de telle sorte que la solution finale est de 10% poids / volume. Stocker temporairement sur la glace. Masse tissulaire et le volume de tampon d'homogénéisation subséquente varient en fonction de la taille du cerveau et / ou des régions utilisées. Ici, un hemibrain de la souris adulte pesant 0,2 g est mis en suspension dans 2 ml d'une solution à 10% p / vol.
3. Les échantillons dans une chambre froide de transfert, et ajuster un sonicateur à sonde pour les réglages appropriés. Pour sonde ultrasons avec un Ruptor Omni (illustré ici), régler la puissance à 20%, ce qui correspond à environ 75 W. L'utilisation d'un mode d'impulsion afin que les échantillons ne sont pas OVer-chauffé pendant la sonication. Régler le générateur d'impulsions de 30%, correspondant à environ 500 msec.
4. Nettoyer la pointe de l'appareil à ultrasons de la sonde par rinçage à l'eau, de l'isopropanol, et de l'eau à nouveau, en essuyant la sonde entre chaque solution. Soyez certain d'Rincer et essuyer les deux côtés et le fond de la sonde avec Lab-lingettes.
5. Travailler avec un échantillon à la fois, plonger la pointe de la sonde dans le tampon d'homogénéisation, et démarrer le traitement ultrasonique. Utilisation des paramètres de puissance et de pulseur décrites ci-dessus, de livrer 25 impulsions totales. Assurez-vous que le tissu est complètement en suspension. Soyez prudent pour éviter de faire mousser l'échantillon lors de cette étape.
   REMARQUE: Les échantillons sont sensibles à la formation de mousse si a) le volume total est faible ou b) l'homogénat réchauffe. Avec cet instrument spécifique, ne soniquer avec des volumes inférieurs à 250 pi. Pour assurer que les échantillons restent réfrigérés, les tubes peuvent être stockés sur la glace lors de cette étape.
6. Nettoyez la sonde en essuyant lysat résiduelle, puis livrer 10 impulsions dans un bécher of l'eau propre. Rincer les côtés et le fond de la sonde avec de l'eau, de l'isopropanol, et de l'eau à nouveau (comme dans l'étape 2.4), essuyage à sec entre chaque étape. Pour éviter la contamination, rincer abondamment la sonde entre les échantillons.
   NOTE: Avec agrégats de tau, on n'a pas constaté que les méthodes de nettoyage plus strictes sont nécessaires pour prévenir la contamination échantillon à échantillon. Autres amyloïdes, cependant, peuvent nécessiter des soins supplémentaires qui a été largement décrite dans la littérature ^20,21.
7. Magasin homogénats sur de la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été traités.
8. Spin homogénats à 21 300 g pendant 15 min à 4 ° C.
9. Transférer le surnageant dans un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Jeter le culot. Aliquoter le surnageant, et les lysats de conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Éviter les cycles de gel / dégel des broyats, cependant, car cela réduit l'efficacité de l'ensemencement.

3. Cellules replacage Biocapteur

NOTER:Utilisez quatre lignées cellulaires pour cet essai: HEK 293T (lignée cellulaire n ° 1), RD-P301S-PCP (lignée cellulaire n ° 2), RD-P301S-YFP (lignée cellulaire 3 #), et RD-P301S-CFP / YFP ( lignée cellulaire n ° 4). S'il vous plaît référencer le tableau 1 pour la contribution de chaque lignée cellulaire à l'essai.

1. Dans un environnement stérile, le milieu de culture par aspiration. Rincer les cellules avec du PBS chaud, et aspirer. Trypsiniser les cellules (3 ml de trypsine-EDTA (0,05%)) pendant 3 minutes, éteindre avec du milieu de culture chaud (9 ml de DMEM, 10% de FBS, 1% de pen / strep, 1% Glutamax), et la transfère immédiatement les cellules à une tube conique.
2. Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le milieu, et le culot de cellules de remettre en suspension dans un milieu de culture chaud.
3. L'utilisation d'un hémocytomètre, déterminer la densité de cellules pour chaque lignée cellulaire. La densité cellulaire sera variable en fonction de confluence au moment de la récolte et le volume de remise en suspension. Resuspendre les cellules récoltées à partir d'un plat de 10 cm à 90% de confluence dans 10 ml de milieu, à une densité cellulaire d'être environ 1 million de cellules / ml.
4. Faireun mélange maître de cellules + médias tels que chaque puits d'une plaque de 96 puits contiendra 35.000 cellules dans 130 ul médias (par exemple, pour faire un mélange maître pour 100 puits, remettre en suspension 3,5 millions de cellules dans 13 ml de milieu). Modifier le nombre de cellules en fonction des dessins et des échéanciers expérimentales individuelles. Pour le traitement de cellules environ 18 heures après l'étalement, ajouter 35.000 cellules dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
5. En utilisant une pipette multi-canal, une pipette lentement 130 pi de mélange maître suspension cellulaire dans chaque puits d'un fond plat, la culture de tissus traité plaque de 96 puits. Alors que le placage, placer la pointe de la pipette dans le centre du puits, ne pas toucher le fond de la plaque.
   REMARQUE: Bien que le format de placage peut être modifiée, ce qui rend n = 4 puits pour chacune des lignées cellulaires par 1-3 plaque est recommandée. Le reste de la plaque (n = 84) est réservé pour une lignée cellulaire # 4 (cellules de biocapteurs).
6. Laisser les cellules sédimenter en laissant la plaque au repos pendant 10 min à température ambiante. Incuber O / N à 37 ° C, 5% CO _2, et &# 8805; 80% d'humidité relative.

4. le traitement de cellules

NOTE: Le jour suivant, lorsque les cellules de biocapteurs tau sont 60-65% de confluence, préparer des complexes de transduction de semences comme suit:

1. Dans un tube, mélanger réactif de transfection, comme Lipofectamine, avec les médias-sérum réduite, comme Opti-MEM, pour faire un mélange maître. Par puits, ajouter 1,25 ul réactif de transfection et 8,75 pi médias-sérum réduite. Tube de Flick légèrement pour bien mélanger, brièvement tourner vers le bas, et incuber pendant 5 min à température ambiante.
2. Dans un autre tube, combiner du matériel de semences (aliquote de lysat de l'étape 2.9) avec les médias-sérum réduite.
   REMARQUE: Le volume de matériau d'ensemencement varie en fonction de l'expérience individuelle. Au moment de choisir le volume de semences, prendre en considération: l'abondance de graines dans un échantillon et la toxicité potentielle. Homogénats bruts peuvent être toxiques pour les cellules. En tant que tel, utilisez le volume le plus bas possible pour surveiller l'effet désiré. Volumes testés précédemment de lysat / puits gamme frOM 1-5 pi, correspondant à 5-20 pg de protéine totale. Assurez-vous que le volume total par puits (Seeds + des médias-sérum réduit) est de 10 pi.
3. Mélanger le contenu des deux tubes décrits en 4.1 et 4.2, film doucement pour mélanger, centrifuger brièvement (1000 xg, 5 sec), et incuber à température ambiante pendant au moins 20 min et jusqu'à 2 h.
4. Pipeter doucement 20 ul de complexe de transduction sur le côté du puits de biocapteurs individuels. Utilisez trois répétitions techniques, si possible. Retour cellules traitées à l'incubateur pendant 24-48 h. Incuber dans les mêmes conditions que celles décrites à l'étape 3.6.
   NOTE: La condition de contrôle négative appropriée pour cette configuration est cellules de biocapteurs traitées avec des liposomes vides (c.-à-réactif de liposome + médias sérique réduite) parce que l'application de phospholipides introduit un léger changement dans le profil de fluorescence par rapport à biocapteurs cellules non exposées au réactif de liposome.

5. la récolte de cellules pour FRET cytométrie en flux

NOTE: Avant de récolter les cellules généralement 24-48 h post-traitement, il est possible d'obtenir une lecture préliminaire de l'activité d'ensemencement en utilisant le filtre de la GFP sur un microscope à fluorescence standard inversé. Les cellules traitées sans matériel de semences (c.-à-liposomes vides) montreront une fluorescence diffuse, alors que les cellules traitées avec du matériel de graines montreront ponctuée intense et réticulaires inclusions intracellulaires (figure 1A - B).

1. En utilisant une pipette à canaux multiples, aspirer tout moyen de cellules (150 ul). Trypsiniser (50 ul) de cellules pendant 5 minutes, et trempe refroidie avec 150 ul du milieu de culture. Ne pas inclure un rinçage PBS avant trypsinisation à cette étape, car il peut causer de levage cellulaire et la perte cellulaire ultérieure. Exclure les cellules mortes et les débris contaminants lors de la cytométrie de flux par l'intermédiaire de stratégies de déclenchement.
2. Immédiatement après la trempe, les cellules de transfert à une plaque de fond du puits tour 96, et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
3. Aspirer et jeter moyen en prenant soin d'éviter de perturber le culot cellulaire.
4. Doucement, mais à fond, remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ul de 2% de paraformaldehyde, et incuber pendant 10 min. Alternativement, les cellules lancez Live, bien que la fixation fournit des résultats plus propres et plus cohérentes.
5. Centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer et jeter paraformaldéhyde, en prenant soin d'éviter de perturber le culot cellulaire.
6. Doucement, mais à fond, remettre le culot cellulaire dans 200 pi flux refroidi cytométrie tampon (HBSS, 1% de FBS, EDTA 1 mM) et exécuter la plaque dès que possible afin d'éviter l'agglutination des cellules.

6. FRET Flow Cytometry

REMARQUE: Utiliser un cytomètre en flux tel que la MACSQuant výb, qui est équipé de FRET compatible laser et les lignes de jeux de filtres (tableau 2). Pour chaque étape de cette section, cliquez sur le bien d'intérêt en utilisant le modèle à 96 puits du logiciel, puis cliquez sur"Play" pour commencer à l'absorption de l'échantillon et le débit. Faire des parcelles ou des tableaux statistiques en cliquant sur l'icône «nouvelle fenêtre d'analyse". Changer les paramètres de l'axe sur des parcelles individuelles bivariées en cliquant sur le titre sur X ou l'axe Y et en sélectionnant le filtre approprié. Pour déplacer des populations de cellules ou des signaux de fluorescence, augmenter ou diminuer les tensions associées aux filtres appropriés. Avec cet instrument, exécutez <1000 événements / sec pour assurer un suivi précis cellule unique.

1. Faire un Scatter-Side Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Zone (FSC-A) graphe bivarié, et avec la ligne de la cellule n ° 1 en marche, régler les tensions SSC et FSC jusqu'à ce que la population de cellules est dans le quadrant inférieur gauche. Cliquez sur l'outil polygone, et de définir la population de cellules (Porte P1). Pour tous les paramètres de déclenchement voir la figure 2.
2. Faire une FSC-H (hauteur) vs parcelle de FSC-A bivariées, et appliquer Porte P1 à ce complot en cliquant sur "live" au-dessus du terrain, et en sélectionnant P1. Avec lignée cellulaire # 1exécution, cliquez sur l'outil polygone, et de définir des cellules individuelles (porte P2).
3. Faire 3 parcelles d'histogramme, une pour chacun des filtres d'intérêt: CFP, YFP, et le FRET. Appliquer porte P2 à l'ensemble de ces parcelles en cliquant sur "live" au-dessus des parcelles, et en sélectionnant P2. Avec lignée cellulaire # 1 en marche, régler les tensions de sorte que la population de cellule médiane dans la PCP, YFP, et FRET histogrammes sont toutes comprises entre 0 et 1. Pour mesurer la PCP et le FRET, exciter les cellules avec le laser de 405 nm, et la capture de fluorescence avec un 450/50 et 525/50 nm nm filtre, respectivement. Pour mesurer YFP, exciter les cellules avec un laser et la capture de fluorescence à 488 nm avec un filtre 525/50 nm. Les paramètres de laser et de filtrage sont en outre décrits dans le tableau 2.
4. Effectuer une compensation pour PCP débordement dans les canaux de FRET et YFP.
   REMARQUE: La compensation est le processus de correction de fluorescence de débordement. Fluorescence débordement se produit chaque fois que l'émission de fluorescence d'un fluorochrome est détecté dans un filtre desitiné ​​à mesurer le signal d'un autre fluorochrome. Avec une compensation adéquate, le débordement fluorescence PCP peut être retiré à partir des canaux de FRET et YFP.
   REMARQUE: Compensation nécessite la présence de deux cellules -positifs et séronégatifs fluorescence. Ainsi, pour compenser sur les cellules de la PCP-positive (lignée cellulaire n ° 2), les cellules négatives (lignée cellulaire N ° 1) doit être ajouté à l'échantillon avant la course.
   1. Spike à 30 pi de la lignée cellulaire # 1 suspension à partir d'un seul puits dans 200 pi de la lignée cellulaire # 2 suspension immédiatement avant compensation.
   2. Cliquez sur l'icône «Réglages de l'appareil", onglet puis «de compensation», et vérifier «matrice» pour ouvrir la table de compensation.
   3. Faire un FRET-A vs PCP-Un complot bivariées, et appliquer porte P2, comme décrit dans l'étape 6.3. Avec lignées cellulaires 1 + 2 en cours d'exécution, cliquez sur l'icône «quadrant» et d'en tirer quadrants tels que les populations fluorescence séronégatifs et séropositifs pour sont séparés par les deux quadrants inférieurs (Portes LL3 unee LR3, respectivement).
   4. Créer une table de statistiques qui affiche l'intensité médiane de fluorescence (MFI) de FRET pour la LL3 et portes LR3. Réglez le paramètre FRET dans la matrice de rémunération jusqu'à ce que le MFI du signal de FRET est équivalent entre LL3 et LR3. Après cette étape, le MFI du signal de FRET est égale entre les cellules non colorées et les cellules PCP-positifs, suggérant l'absence de PCP débordement dans le canal FRET.
   5. Faire un YFP-A vs PCP-Un complot bivariées, et appliquer porte P2, comme décrit dans l'étape 6.3. Dessinez quadrants (LL4 et LR4) semblable à celui fait à l'étape 6.4.3.
   6. Créer une table de statistiques qui affiche l'IMF de la YFP pour LL4 et LR4. Réglez le paramètre YFP dans la matrice de rémunération jusqu'à ce que le MFI du signal YFP est équivalent entre LL4 et LR4. Après cette étape, l'IMF d'un signal YFP est égale entre les cellules non colorées et les cellules PCP-positifs, suggérant l'absence de PCP débordement dans le canal YFP.
5. Follen raison configuration de grille et la rémunération, mettre en évidence les puits d'intérêt et exécuter le reste de la plaque.
6. Lorsque tous les échantillons ont été exécutés, des fichiers de données d'exportation en cliquant sur «fichier», puis «copie». Sélectionnez l'onglet "fichiers de données", sélectionnez le dossier de l'expérience, et cliquez sur «copie».

Analyse des données 7.

NOTE: Changer axe paramètres sur des parcelles individuelles bivariées en cliquant sur le titre sur X ou l'axe Y et en sélectionnant le filtre approprié.

1. FCS fichiers ouverts dans la cytométrie de flux programme d'analyse.
2. Basé sur les propriétés de dispersion, utiliser une grille polygonale à définir la population de cellules (SSC vs FSC) et de la population de singlet (FSC-H vs FSC-A) à partir de cellules traitées avec des liposomes vides, de façon similaire à celle décrite dans la section 6.
3. Si la compensation de la PCP a été réalisée lors de l'installation, ne pas régler plus PCP.
4. Créer un FRET vs YFP parcelle bivariées. En utilisant la lignée cellulaire # 3, Définir une grille de FRET faux en dessinant une grille polygonale qui court le long de la pente de la population de cellules-FRET positive. Cette porte exclut YFP cellules individuelles positif qui émettent un signal dans le filtre de FRET, et est attirée similaire à celui montré précédemment par Banning et al. ²²
5. Définir une grille de FRET en traçant des cellules vides de liposomes traités CFP / YFP sur un FRET vs PCP parcelle bivariées. L'introduction d'un grille polygonale le long de la pente de la population qui se prolonge vers le haut et vers la gauche à partir de la population de distance. Cette porte doit exclure la plupart des cellules (~ 99%), de telle sorte que fond FRET est ≥1% des cellules. Tous les événements qui changent dans cette porte sont considérées FRET positif.
   NOTE: chaque porte décrit ci-dessus est appliquée à tous les échantillons avant de construire des portes suivantes. Suite à l'analyse, quatre portes individuels sont définis (la population de la Cellule; singlet; fausse FRET; FRET).
6. Paramètres de l'analyse du dossier d'intérêt, y compris: pour cent FRET positivité et IMFdes cellules de FRET positif. Calculer manuellement la densité de FRET intégré en mesurant le produit de pour cent la positivité et IMF.
   NOTE: Si la densité de FRET intégré est utilisé comme une mesure des résultats, mis FRET de fond (tel que défini dans l'étape 7.5) et IMF supérieur ou égal à 1 afin d'éviter de calculer un produit qui est moins que ses deux facteurs individuels.

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Résultats

FRET cytométrie en flux permet sensible, quantitative, et la détection rapide de l'activité de l'ensemencement à partir d'échantillons recombinantes ou biologiques. Configuration de test est facile: lignées cellulaires stables monoclonaux dérivés exprimant la protéine tau-RD-CFP / YFP sont transduites avec du matériel de semences, incubées pendant 24-48 h, et ​​soumis à l'analyse par cytométrie de flux (figure 1A). En l'absence de semences, les cellules de biocapteur...

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Discussion

La cytométrie en flux système de FRET décrit ici est un outil puissant pour évaluer rapidement et quantitativement l'activité de la protéine tau ensemencement. Elle exige seulement une expérience de culture cellulaire modérée et une connaissance pratique de FRET et cytométrie de flux. D'autres essais de semis, comme Thioflavine T - qui présente une fluorescence améliorée lorsqu'il est lié à la structure de feuillet bêta - sont laborieux et nécessitent un substrat de protéine pure, recombina...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBS	Sigma	T5912
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)	Roche	4693159001
Cryo-vials	Sarstedt	72.694.006
Analytical Balance	Mettler Toledo	XSE 105DU
Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-743
15 ml conical tube	USA Scientific	1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer	Omni International	18-000-115
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer	Omni International	OR-T-156
2-Propanol	Fisher Scientific	A451
Noise Cancelling Ear Muffs	Fisher Scientific	19-145-412
Kimwipes	Fisher Scientific	S47299
1.5 ml tubes	USA Scientific	1615-5510
Microcentrifuge	Eppendorf	5424 000.215
DPBS	Life Technologies	14190-136
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
GlutaMax	Life Technologies	35050-061
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
50 ml Conical Tubes	Phenix Research	SS-PH15
25 ml reagent resevoirs	VWR	41428-954
Multi channel pipet	Fisher Scientific	TI13-690-049
96 well flat bottom plates	Corning	3603
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
96 well round bottom plates	Corning	3788
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15710
PBS	Sigma-Aldrich	P5493
EDTA	Sigma-Aldrich	ED2SS
HBSS	Life Technologies	14185-052
Sorvall ST 40 Centrifuge	Thermo Scientific	75004509
BIOLiner Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003796
Hemacytometer	VWR	15170-172
MACSQuant VYB Flow Cytomter	Miltenyi Biotec	130-096-116
Chill 96 Rack	Miltenyi Biotec	130-094-459
Flow Jo analysis software	Flow Jo
20 μl pipet tips	Rainin	GPS-L10
200 μl pipet tips	Rainin	GPS-250
1 ml pipet tips	Rainin	GPS-1000
200 μl pipet tips	USA Scientific	1111-1800
5 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-606180
10 ml serological pipett	Phenix Research	SPG-607180
25 ml Serological pipett	Phenix Research	SPG-760180