تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

القدرة على قياس الطفرات الخلايا الجذعية هي أداة قوية لتحديد في عدد السكان خلية بالغ الأهمية إذا، وإلى أي مدى، يمكن أن مادة كيميائية تحفز الطفرات التي تؤدي المحتمل إلى السرطان. استخدام لفحص الأنزيمية لتحديد الطفرات الخلايا الجذعية في العاشر مرتبطة نازعة الجلوكوز 6 فوسفات الجينات ذكرت سابقا. ¹ هذا الأسلوب يتطلب إعداد أقسام المجمدة وحضانة الأنسجة مقطوع مع خليط التفاعل التي تعطي اللون الأزرق إذا كانت الخلايا تنتج وظيفية نازعة الجلوكوز 6 فوسفات (G6PD) الانزيم. إن لم يكن، والخلايا تظهر بيضاء. قمنا بتعديل خليط التفاعل باستخدام الأمثل مجمع قطع درجة الحرارة (أكتوبر) المتوسطة بدلا من البولي فينيل الكحول. هذا يسهل قياس درجة الحموضة، ويزيد من ذوبان المكونات تلطيخ G6PD ويحد من انتشار انزيم G6PD و. لإثبات أن طفرة حدثت في الخلايا الجذعية، يجب على سرداب كامل تفتقر G6PD الأنزيميةالنشاط. إلا إذا تؤوي الخلايا الجذعية طفرة G6PD المظهرية وجميع ذرية في سرداب تفتقر G6PD النشاط الأنزيمي. للتعرف على خبايا مع طفرة الخلايا الجذعية، وقطعت أربعة أقسام المجمدة المجاورة متتالية (مستوى) في 7 ميكرون سمك. هذا النهج جعل التخفيضات المجاورة يوفر التشكل التي سرداب وتحور بشكل كامل منذ وسيراعى في نفس سرداب تحور في الفروع المجاورة. وكانت الشرائح مع عينات الأنسجة التي كانت أكثر من 50 ميكرون وبصرف النظر مستعدة لتقييم ما مجموعه> 10 ⁴ الخبايا في الماوس. تردد طفرة هو عدد المرصودة تحور (أبيض) الخبايا ÷ من قبل عدد من النوع البري (الأزرق) الخبايا في مجموعة العلاج.

Introduction

ويعتقد أن سرطان القولون لإشراك التعرض للعوامل البيئية والمكونات الغذائية التي يمكن أن تضر الحمض النووي وإنتاج تفعيل الطفرات الجسدية في الجينات المسرطنة (مثل ß-catenin) أو تعطيل الطفرات في جينات الورم القامع (على سبيل المثال، APC). ومن المفترض أن هذه الطفرات الهامة تحدث في الخلايا الجذعية القولون. بسبب بنية فريدة من سرداب ظهارة القولون، فمن الممكن لقياس الطفرات الخلايا الجذعية في القولون بعد تعريض الحيوانات للمواد الكيميائية المرتبطة القولون التسرطن. كما أن الكثير من الانزيمات المرتبطة X بمثابة مؤشرات لالطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية، حيث أن الطفرات سوف تكون موجودة في جميع الخلايا داخل سرداب.

سابقا، وقد نشرت إجراء يدل على أن المواد الكيميائية التي تحفز على أورام القولون في الفئران ولدت أيضا جسدية الطفرات الخلايا الجذعية في القولون عن طريق تحليل الطفرات في نسبة الجلوكوز 6 فوسفات نازعة المرتبطة X (G6PD) الجين ^1-3طريقة الكمي حدوث الطفرات الجسدية العشوائية في الخلايا الجذعية القولون دون أي ضغط الاختيار. الإجراء ينطوي على إنتاج غير المثبتة أقسام القولون المجمدة من الفئران التي عولجت والسيطرة والتعرف على الخبايا خالية من الخلايا التي تنتج النشاط G6PD وظيفية. هذه الخبايا تحور، والتي تظهر أبيض، تشير إلى أن التحور حدث في الخلايا الجذعية التي أدت إلى النسل أيضا بإيواء جين G6PD تحور. في فحص الأنزيمية، ويمكن G6PD الخبايا متحولة ناقصة لا أكسدة الجلوكوز 6 فوسفات، وهو مطلوب للحد من نتروبلو الأزرق نيترو (NBT). عندما انزيم G6PD هو وظيفي، ويتم تقليل NBT في خليط تلطيخ لformazan غير قابلة للذوبان والرواسب، وتراكم في موقع الإنزيم و "تلطيخ" الخلايا الزرقاء. الخلايا التي هي المسوخ G6PD تبقى بيضاء على النقيض من الأزرق الملون الخبايا نوع البرية. يقيس هذا الأسلوب الطفرات التي لديها "لاغيا" النمط الظاهري. لأن ENإنزيمات، مثل G6PD، يمكن نزع فتيل خارج الخلايا على قسم الأنسجة غير المثبتة إذا وضعت المقاطع في محلول مائي، فمن الضروري لتحقيق الاستقرار في الانزيم في أقسام الأنسجة لتحليلها. ⁴ إن استقرار الانزيم في الأنسجة يجب ألا تتداخل مع انتشار جزيئات صغيرة كاشف اللازمة للتفاعل G6PD الأنزيمية.

لقد قدمت عددا من التغييرات الهامة لإجراء الأصلي. تم تغيير وسيلة لتلطيخ الأنزيمية حاسم من البولي فينيل الكحول لالأمثل قطع درجة الحرارة مجمع (أكتوبر)، مما يسهل السيطرة درجة الحموضة والإذابة من المكونات المستخدمة في الفحص. يتم تنفيذ تلطيخ باستخدام 0،4-0،5 مل الآبار مصنوعة من الفولاذ المقاوم للغسالات بحيث حصل كل قسم الأنسجة نفس الحجم من خليط التفاعل G6PD. وقد تم وضع إجراءات لتقدير عدد من الخبايا في قسم تصوير توفر عينة كبيرة من انسجة القولون دون الحاجةالعد يدويا> 10 ⁵ الخبايا لكل القولون. تحليل المجاورة 7 ميكرون أقسام الأنسجة يتيح التصور من سرداب متحولة على أكثر من شريحة واحدة، مما يقلل من التحف تلطيخ المحتملة. هذه التغييرات تجعل الإجراء أكثر كفاءة واستنساخه.

باستخدام هذا البروتوكول المعدل، لقد كميا وتيرة الطفرة في الخلايا الجذعية القولون بعد تعرض C57BL / 6 الفئران لazoxymethane، وهي مادة مسرطنة القولون المعروفة في القوارض. ^5-7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية والمعاملة الأخلاقية للحيوانات من جامعة بيتسبرغ IACUC (بروتوكول # 1104674).

1. إعداد G6PD تلطيخ خليط

ملاحظة: تأكد من أن تركيز النهائي من كل الكواشف هي على النحو التالي؛ 5 ملي الجلوكوز 6 فوسفات (G6P)؛ 2 مم NADP، 5 ملي MgCl _2، 0.35 ملي 1-ميثوكسي-5-methylphenazinium كبريتات الميثيل (MMPMS) و 0.8 ملي NBT. ^1،8،9 لكل كاشف تم اشتقاق التركيز الأولي ل40 مل الحجم النهائي. وقد الحلول الطازجة وتستخدم كل يوم.

1. إضافة 2 مل من 200 ملي درجة الحموضة 7.4 العازلة الفوسفات (PB) إلى 35 مل من أكتوبر المتوسطة في أنبوب 50 مل ويهز بقوة. تأكيد مع ورقة الأس الهيدروجيني أن الحل هو ~ 7.4 درجة الحموضة. إن لم يكن تجاهل الحل.
2. إضافة 61 ملغم G6P حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، 61 ملغ NADP حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، و 41 ملغ MgCl ₂ الذائبة في 0.96 مل من 100 ملي PB. نؤكد من جديد أن الرقم الهيدروجيني ~ 7.4 الطرافةح الأس الهيدروجيني ورقة. إن لم يكن ~ 7.4، تجاهل الحل.
3. إضافة 5 ملغ من MMPMS الذائبة في 0.25 مل من 200 ملي PB (7.4 درجة الحموضة). هزة بقوة مما أدى خليط التفاعل لتوليد جناسة الأحمر الداكن واضح. إذا كان هذا الحل هو عكر، يجب التخلص من الخليط. يتم تغليف الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل في احباط للحد من التعرض للضوء. تخزين خليط التفاعل في RT في حين أن العنصر الأخير، NBT، يتم إعداد.
4. إعداد منفصل حل 5 ملي NBT بإضافة 0.4 مل اللامائية الفورماميد ثنائي ميثيل (DMF) و 0.4 مل الإيثانول اللامائي إلى 164 ملغ من NBT في أنبوب 2 مل مع غطاء O-الحلبة. إغلاق غطاء فضفاض (لا مغلقة بإحكام) وتقديم حل ليغلي قوية في حمام الزيت حتى NBT في الحل. ⁸
5. السماح للNBT solubilized لتبرد إلى RT ثم قم بإضافة كل من الحل لخليط التفاعل أكتوبر ويهز بقوة للحصول على حل واضح. مراقبة تغير لون الحل من الأولي البرتقالي والأحمر إلى أحمر غامق أو purpلو اللون مع مرور الوقت. هذا امر طبيعي.
6. ضع الخليط النهائي G6PD تلطيخ في 37 ° C غرفة دافئة لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام.

2. علاج الحيوان والأنسجة مجموعة

1. علاج عمره 6 أسابيع C57BL / 6 الفئران الذكور مع DNA عامل ضار، على سبيل المثال، 10 ملغ / كغ azoxymethane (أوم) في حجم 200 ميكرولتر PBS عن طريق الحقن الملكية الفكرية. علاج السيطرة على الفئران مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الحقن الملكية الفكرية.
2. في 90 يوما، الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ الخنق تليها خلع عنق الرحم كما وافقت عليها بروتوكول IACUC.
3. جراحيا فتح تجويف البطن من أعلى بقليل من فتحة الشرج إلى قاعدة القص. تحريك الأمعاء الدقيقة من تجويف الجسم ولكن لا استئصال ذلك. استئصال الأمعاء السفلى أسفل الأعور إلى المستقيم. ¹⁰
4. شريحة بعناية على طول جانب واحد من القولون باستخدام مقص تشريح الصغرى وإزالة البراز من القولون فتح طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني العقيمة نظيفة. لفة السويسرية المكوسد القولون مع الجانب اللمعية التي تواجه الخارج، ووضعه في قالب الأنسجة. ¹⁰
5. تماما تزج القولون في أكتوبر المتوسطة ومكان العفن في ديوار التي تحتوي على السائل _N 2. عقد القالب بحيث قاعدة من البلاستيك ليست سوى في اتصال مع السائل _N 2 حتى يتم تجميد المتوسطة أكتوبر الصلبة.
6. تخزين كتلة الأنسجة المجمدة في -80 حتى قطع الأجزاء المجمدة. لا تستخدم أي تثبيتي، الذي من شأنه أن يؤدي إلى تثبيط انزيم G6PD.

3. إعداد أقسام المجمدة

1. قطع أقسام الأنسجة المجمدة في سمك 7 ميكرون باستخدام ناظم البرد في -25 ° C. قطع 4 متتالية 7 ميكرون أقسام ووضع اثنان منهم على نفس الشريحة (الشكل 1). إعداد 2 الشرائح، أو أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام لتمثيل مستوى واحد من القولون (الشكل 1).
2. كرر المستوى التالي مع مسافة لا تقل عن> 50 ميكرون من القسم الأخير من العلاقات العامةمستوى evious. ضمنت هذه المسافة التي الخبايا المقررة لكل مستوى لم يكرر بعضها البعض.
3. يمسح كثيرا النصل ناظم البرد مع الإيثانول بنسبة 100٪ لإزالة بقايا أكتوبر التي تتراكم خلال عدة قطاعات. قبل أن يتم استئناف باجتزاء، ومحو شفرة الجافة مع ورقة مجفف الاستاتيكيه لتبديد المتراكمة تهمة ثابتة. متجر الشرائح مع أقسام المجمدة في -80 ^{درجة مئوية.}

4. تلطيخ قسم الأنسجة المجمدة

1. نفذ رد فعل انزيم الكيمياء النسيجية في 37 ° C غرفة دافئة مع ارتفاع نسبة الرطوبة.
   ملاحظة: محاولة التفاعل الأنزيمي في فرن الحضانة أو على أكثر دفئا الشريحة أدت إلى الفقراء وغير متناسقة تلطيخ G6PD.
2. بناء الآبار للتلوين الأنسجة باستخدام اثنين من 1.5 سم × غسالات الصلب 0.15 سم (الداخلية الارتفاع قطر ×) التي تم المستعبدين معا باستخدام السيليكون الشحوم (الشكل 1). قطع parafilm لتتناسب مع قاعدة من البئر مع مركز قطع والمكان جيداد على قسم الأنسجة على الشريحة.
   ملاحظة: parafilm على الجزء السفلي من غسالة يخلق ختم بين الشرائح والغسالة التي تحافظ على مزيج لزج G6PD تلطيخ على قسم الأنسجة. هذا بناء يعطي بشكل جيد مع 0.4 - حجم 0.5 مل بحيث يكون كل قسم الأنسجة في الدراسة يتلقى نفس الحجم من رد فعل G6PD خليط تلطيخ.
3. احتضان شرائح الأنسجة المجمدة ^عند 37 درجة مئوية في غرفة دافئة لمدة 10 دقيقة. في 37 ° C، إضافة G6PD تلطيخ خليط التفاعل إلى كل قسم الأنسجة بشكل جيد (2 أقسام لكل شريحة) لمدة 45-50 دقيقة. إزالة الشرائح من غرفة دافئة، ورفع بعناية الآبار الفولاذ المقاوم للصدأ من الشرائح.
4. تعيين الشرائح على الحافة الطويلة للسماح وسط التفاعل لاستنزاف. مكان الشرائح في 100 ملي PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 30-60 دقيقة لإزالة G6PD تلطيخ خليط التفاعل من الأنسجة دون إزعاج تلطيخ الأنسجة. غمر الشرائح في الماء المقطر لمدة 5-10 دقائق لإزالة الأملاح PB
5. ختم الأنسجة عن طريق الإضافةجي الفلوري جل من قطارة على الأنسجة والانتظار ~ 30 دقيقة حتى يجف. تجنب الفقاعات التي يمكن أن يتغلب على تحديد الخبايا تحور.
   ملاحظة: إذا كان شكل فقاعات، ويمكن تكرار الإجراء بعد إزالة جل الفلوري عن طريق نقع في الماء المقطر. لا تستخدم زلات غطاء لأنها تميل إلى فقاعات الهواء الفخ.

5. تحديد G6PD المسخ الأقبية والطفرة التردد

1. تحليل الشرائح لG6PD الخبايا متحولة تحت المجهر الضوئي.
   ملاحظة: المعايير المستخدمة لتحديد سرداب متحولة تماما هي: (أ) كان سرداب كامل خال من اللون الأزرق. (ب) كان الهيكل الخارجي للسرداب سليمة، (ج) لوحظ سرداب متحولة على المتاخمة 7 ميكرون أقسام و، (د) كان اثنين من المراقبين لتحديد نفس سرداب كما متحولة. تحسب المسوخ لوحظ على المتاخمة 7 ميكرون أقسام كما متحولة واحد.
2. صورة كل سرداب متحولة G6PD في التكبير 40X والتسويقي الصور باستخدام كاميرا 5.0 megapixel معبرامج التصوير.
3. تحديد العدد الإجمالي للالخبايا درست في الماوس عن طريق اختيار القسم تمثيلي لكل الماوس من مستوى مع مساحة أصغر وصورة ذلك في التكبير 10x (الشكل 1C).
   ملاحظة: مستوى يمثل أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام (1D الشكل)، والتي بسبب قربها غالبا ما تظهر تحور الخبايا على أكثر من مقطع واحد. يتم فصل المستويات> 50 ميكرون لتصور الخبايا من مناطق مختلفة من القولون.
4. فتح كل ملف صورة والاعتماد بصريا عدد من الخبايا على مستوى عن طريق تحليل الملفات (كما هو موضح في الشكل صناديق 1C). سوف تختلف ملفات الصور في عدد من الأقبية لوحظ من ما يصل الى 20 ل> 300 الخبايا في ملف واحد.
5. مضاعفة العدد الإجمالي للالخبايا من مستوى (الشكل 1C) المحدد لكل فأر من قبل عدد من المستويات فرزهم عن الخبايا G6PD متحولة لكل القولون. على سبيل المثال، العدد الإجمالي لل1250 الخبايا في المستوى المختار مضروبا 8 مستويات فحص لالخبايا متحولة تساوي العد الكلي 10،000 الخبايا. تقييم ما لا يقل عن 10،000 الخبايا لكل القولون للتحليل الإحصائي.
6. الجمع بين عدد من المسوخ التي لوحظت في كل من الحيوانات من قبل عدد من الخبايا فحص لحساب MF لكل معاملة. مستوى MF الخلايا الجذعية الخلفية في الفئران غير المعالجة هو <0.1x10 ^-4 (الجدول 1)، وهي قريبة لتلك التي ذكرت سابقا في C57BL / 6 الفئران. ¹¹

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

القدرة على قياس القولون الطفرات الخلايا الجذعية في الحيوانات يوفر طريقة فريدة من نوعها لربط الطفرات إلى تحريض السرطان. عادة، فمن المفترض أن الخطوة الحاسمة في التسرطن ينطوي على تفعيل الطفرات في الجينات المسرطنة و / أو تعطيل الطفرات في الجينات الكابتة للورم. نحن حقن C57...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

غالبا ما يتم تحديد تأثير السمية للمركب بقدرته على تعديل الحمض النووي. ويتم ذلك عادة من خلال عزل الأنسجة وقياس مستوى عالمي من الحمض النووي adducts. لAOM، وهذا ينطوي على قياس O ⁶ -methylguanine adducts في القولون. باستخدام هذه المعلومات النهج على الضرر في غضون أنواع معينة من الخلا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room