대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화

요약

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

초록

줄기 세포의 돌연변이를 측정 할 수있는 능력은, 화학 물질은 잠재적으로 암을 초래할 돌연변이를 유도 할 수 있다면, 어느 정도에 중요한 세포 집단의 정량화 할 수있는 강력한 도구이다. 상기 X 연결된 글루코스 -6- 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 줄기 세포 돌연변이를 정량화하기 위해, 효소 분석의 사용은 이전에보고 된 바있다. ^(1)이 방법을 산출하는 반응 혼합물과 절개 된 조직의 동결 절편과 배양의 준비가 필요 세포가 기능적 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 효소를 생산하는 경우 청색. 그렇지 않은 경우, 셀은 하얗게. 우리는 폴리 비닐 알코올 대신에, 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 매체를 이용하여 반응 혼합물을 수정했다. 이는 pH 측정을 용이 G6PD 염색 성분 가용화를 증가시키고 G6PD 효소의 확산을 제한한다. 돌연변이가 줄기 세포에서 발생 함을 입증하기에, 전체 토굴은 G6PD 효소가 부족합니다활동. 줄기 세포 비호에만 G6PD 표현형 돌연변이 토굴에서 자손 모두 G6PD 효소 활성이 결여된다. 줄기 세포의 변이를 식별하는 지하실, 연속 4 인접 동결 절편 (레벨) 7 μm의 두께로 절단 하였다. 인접 컷의 제조 방법은이 같은 변이 토굴 인접한 부분에서 관찰되기 때문에 토굴 완전히 돌연변이 된 형태를 제공한다. 50 ㎛의 간격이었다 조직 샘플과 슬라이드는 마우스 당> 10 ⁴ 지하실의 합계를 평가 제조 하였다. 돌연변이 빈도는 치료 그룹의 야생형 (청색) 소낭의 숫자로 ÷ 관측 돌연변이 (흰색) 소낭의 수이다.

서문

대장 암은 DNA를 손상시킬 수 환경 에이전트 및식이 구성 요소에 대한 노출을 포함하고 (예를 들어 APC)를 종양 억제 유전자에 돌연변이를 암 유전자에 체세포 돌연변이를 활성화 (예를 들어, 베타 카테닌) 또는 비활성화 생산하는 것으로 생각됩니다. 그러나, 이들 임계 돌연변이 결장 줄기 세포에서 발생하는 것으로 가정한다. 인해 대장 상피의 고유 토굴 아키텍처, 이는 대장 암 발생과 관련된 화학 물질에 동물을 노출 한 후 결장 줄기 세포 돌연변이를 측정 할 수있다. 돌연변이가 토굴 내의 모든 세포에 존재하므로 여러 X-연결 효소는, 줄기 세포에서 발생하는 돌연변이에 대한 지표 역할을 할 수 있습니다.

이전에, 절차는 마우스에서 결장 종양을 유도 화학 또한 X 결합 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 유전자 돌연변이 분석을 통하여 대장 체세포 줄기 세포 돌연변이를 생성하는 것이 입증 된 문서. ^1-3방법은 임의의 선택 압력없이 결장 줄기 세포 무작위 체세포 돌연변이의 빈도를 정량화. 절차는 처리 및 제어 생쥐로부터 결장 냉동 미 정착 부의 생산 G6PD 기능적 활성을 생산 세포의 결여 소낭의 식별을 포함한다. , 흰색으로 보이는 이러한 돌연변이 지하실은 돌연변이는 돌연변이 G6PD 유전자를 품고 자손 초래했다 줄기 세포에서 발생했음을 나타냅니다. 효소 분석에서, G6PD 결핍 돌연변이 소낭은 니트로 블루 테트라 졸륨 (NBT)의 환원에 필요한 글루코오스 -6- 인산을 산화 할 수 없다. G6PD 효소가 작동하는 경우, 염색 액에 NBT는 효소 및 청색 "염색"셀의 위치에서 축적 불용성 포르 마잔과 침전물로 감소된다. G6PD 돌연변이있는 세포는 푸른 스테인드 야생형 지하실에 대비 희끄무레 남아있다. 이 방법은 "NULL"표현형이 돌연변이를 측정한다. EN 때문에하는 효소, 예컨대 G6PD 같이 섹션이 수용액에 배치되는 경우 비 고정 조직 절편에 세포 밖으로 확산 될 수있는, 그것은 분석 될 수있는 조직 절편에서 효소를 안정화 할 필요가있다. ^(4)에서의 효소의 안정성 조직은 G6PD 효소 반응에 필요한 시약 작은 분자의 확산을 방해하지 않아야합니다.

우리는 원래의 절차에 큰 변화의 숫자를 만들었습니다. 중요한 효소 염색 배지 pH 조절 및 상기 분석에 사용 된 성분의 용해를 용이하게 최적의 절단 온도 화합물 OCT (), 폴리 비닐 알코올로부터 변경되었다. 각 조직 섹션 G6PD 반응 혼합물을 동일한 용적을 수신하도록 강철 와셔 이루어지는 0.5 ml를 웰​​ - 염색 0.4을 사용하여 수행된다. 절차없이 결장 조직의 큰 표본을 제공 묘화 부에 소낭의 수를 추정하기 위해 개발 된수동> 각 대장 10 ⁽⁵⁾ 지하실을 계산합니다. 7 μm의 인접 조직 절편의 분석은 잠재적 염색 아티팩트를 감소 하나 이상의 슬라이드에 토굴 돌연변이의 시각화를 제공한다. 이러한 변경 절차가보다 효율적이고 재현합니다.

이 수정 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 설치류 공지 결장 발암 아족시 메탄을 위해 C57BL / 6 마우스의 결장 노출 후 줄기 세포의 돌연변이 빈도를 정량화 하였다. ^5-7

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프로토콜

실험 절차 및 동물의 윤리적 인 대우는 피츠버그 IACUC 대학 (프로토콜 # 1104674)에 의해 승인되었다.

G6PD 염색 혼합물 1. 준비

참고 : 다음과 같이 각 시약의 최종 농도가 있는지 확인; 5 mM의 글루코스 -6- 포스페이트 (G6P); 2 mM의 NADP, 5 밀리미터의 MgCl _2, 0.35 mM의 1- 메 ​​톡시 -5- methylphenazinium 메틸 설페이트 (MMPMS) 및 0.8 mM의 NBT. 초기 농도가 40 ㎖의 최종 부피에 대해 유도 된 각 시약 ^1,8,9. 솔루션 갓 준비하고 매일 사용되었다.

1. 50 ML 튜브에 10월 매체의 35 ml의 200 mM의 pH 7.4의 인산염 완충액 (PB) 2 ㎖를 추가하고 격렬하게 흔들어. 이 솔루션은 ~ pH가 7.4 인 산도 용지 확인합니다. 그렇지 않으면하는 솔루션을 버린다.
2. 61 mg을 200 mM의 G6P PB 0.94 ㎖에 용해하고, 추가 61 mg을 200 mM의 NADP PB 0.94 ㎖에 용해시키고, 41 mg의 0.96의 MgCl ₂ ml의 100 mM이 PB에 용해시켰다. pH가 있음을 재확인 ~ 7.4 재치시간의 pH 종이. 하지 ~ 7.4 경우, 솔루션을 버린다.
3. 200 mM의 PB (PH 7.4) 0.25 ㎖에 녹이고 MMPMS 5 mg을 추가합니다. 적극적으로 분명 어두운 빨간색 균질을 생성하기 위해 생성 된 반응 혼합물을 흔들어. 용액이 혼탁 한 경우, 혼합물은 폐기한다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브는 빛에 대한 노출을 최소화하기 위해 호일로 래핑된다. 최종 요소,​​ NBT가 준비되는 동안 실온에서 반응 혼합물을 저장한다.
4. O 링 뚜껑을 2 ㎖의 튜브에 NBT 164 mg을 0.4 ml의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 및 0.4 ml의 무수 에탄올을 첨가함으로써 별도로 5mM의 NBT 용액을 제조 하였다. 뚜껑을 느슨하게 닫고 (밀봉되지 않은) 및 NBT 용액이 될 때까지 오일 배스에서 격렬한 비등으로 용액을 가져온다. ⁽⁸⁾
5. 가용화 된 NBT는 RT로 냉각 한 후 OCT를 반응 혼합물에 모든 용액을 추가하고 투명한 용액을 수득 할 수 있도록 격렬히 흔들어. 어두운 빨간색 또는 PURP에 초기 오렌지 - 레드의 솔루션 색 변화를 관찰시간이 지남에 따라 제작 색상. 이것은 정상입니다.
6. 사용하기 전에 1 시간 동안 37 ℃로 따뜻한 방에서 최종 G6PD 염색 혼합물을 놓습니다.

2. 동물 치료 및 조직 컬렉션

1. DNA 손상 에이전트, 예를 들어, 6 주령 C57BL / 6 수컷 마우스 치료, IP 주입하여 200 μL PBS의 볼륨에서 10 ㎎ / ㎏ 아족시 메탄 (AOM). IP 주입하여 PBS 200 μL와 제어 쥐를 치료​​.
2. 구십일에서 공동으로 IACUC 프로토콜에 의해 승인 된 자궁 경부 전위 다음 ₂ 질식을 쥐를 안락사.
3. 수술로 바로 흉골의 기지로 항문 위에서 복강을 엽니 다. 체강에서 소장을 이동하지만, 그것을 절제하지 않습니다. 그냥 직장에 맹장 아래의 하부 대장을 절제. ⁽¹⁰⁾
4. 조심스럽게 마이크로 해부 가위를 사용하여 대장의 한 측면을 따라 슬라이스하고 깨끗한 멸균 PBS로 세척하여 열린 대장에서 대변을 제거합니다. 소비세 스위스 롤조직 금형의 내강 바깥 측면 및 장소 D 결장. ⁽¹⁰⁾
5. 완전히 듀어는 액체 N _2를 포함에 10월 매체와 장소 금형에 콜론을 담그지. 플라스틱 기재는 단지 간섭 단층 매체가 얼어 때까지 액체 N _2와 접촉하도록 몰드를 잡아.
6. 동결 절편을 절단 할 때까지 -80에서 냉동 조직 블록을 저장합니다. G6PD 효소의 불 활성화 될 것입니다 어떤 정착액을 사용하지 마십시오.

냉동 섹션 3. 준비

1. -25 ℃에서 저온 유지 장치를 이용하여 7 μm의 두께에서 동결 조직 절편을 잘라. 4 연속 7 μm의 섹션을 잘라와 같은 슬라이드 (그림 1)에 그 두 가지를 배치합니다. 콜론 (그림 1)의 한 단계를 표현하기 위해 2 슬라이드 또는 4 연속 7 μm의 섹션을 준비합니다.
2. 홍보의 마지막 부분에서> 50 ㎛의 최소 거리와 다음 단계에 대해 반복evious 수준. 이 거리는 각각의 레벨에 대해 평가 소낭이 서로 중복되지 않는다고 보장.
3. 자주 절단하는 동안 축적 OCT의 잔류 물을 제거하기 위해 100 % 에탄올로 그라 이오 스탯 블레이드를 닦아냅니다. 단면 처리가 다시 시작되기 전에, 건조 블레이드는 축적 된 정전기를 소산하는 대전 드라이어 시트로 닦는다. C. ^O -80에서 냉동 섹션 스토어 슬라이드

동결 절편 조직 4. 염색

1. 습도가 높은 37 ℃로 따뜻한 방에서 효소 조직 화학 반응을 수행합니다.
   참고 : 배양 오븐 또는 슬라이드 따뜻한의 효소 반응을 시도 가난과 일치하지 G6PD 염색되었다.
2. 실리콘 그리스 (그림 1)를 사용하여 서로 결합 된 두 개의 1.5 cm X 0.15 cm 스틸 와셔 (내부 직경 x 높이)를 사용하여 조직 염색을위한 우물을 구축 할 수 있습니다. 센터와 잘의 기본에 맞게 파라 필름을 잘라 잘라 잘 장소슬라이드에 조직 섹션을 통해 D.
   참고 : 세탁기의 바닥에있는 파라 필름은 슬라이드와 조직 섹션에 점성 G6PD 염색 혼합물을 유지 와셔 사이에 실을 만듭니다. 이 연구에서 각 조직 섹션은 G6PD 반응 염색 혼합물의 동일한 볼륨을받을 수 있도록 0.5 ml의 볼륨 -이 구조는 0.4로 잘 있습니다.
3. 10 분 동안 따뜻한 방에서 37 ^O C에서 냉동 조직 슬라이드를 품어. 37 ℃에서 45-50 분 동안 각 조직 절편 웰 (슬라이드 당 2 부)에 G6PD 염색 반응 혼합물을 추가한다. 따뜻한 방에서 슬라이드를 제거하고 조심스럽게 슬라이드 오프 스테인레스 스틸 우물을 들어 올립니다.
4. 긴 가장자리에 설정 슬라이드는 반응 매체가 배출되도록합니다. 30 ~ 60 분 동안 100 mM의 PB (PH 7.4)에 넣어 슬라이드 조직 염색을 방해하지 않고 조직에서 G6PD 염색 반응 혼합물을 제거합니다. PB 염을 제거하기 위해 5 ~ 10 분 동안 증류수에 슬라이드를 잠수함
5. 추가로 조직을 밀봉조직에 적기에서 플루오로 젤을 보내고하고 건조를위한 ~ 30 분 대기. 돌연변이 지하실의 식별을 혼동 할 수 있습니다 거품을 피하십시오.
   주 : 기포가 형성되면, 절차는 증류수에 담가 플루오 겔의 제거 후에 반복 될 수있다. 그들이 트랩 기포 경향이 커버 전표를 사용하지 마십시오.

G6PD 돌연변이 납골당과 돌연변이 주파수 5. 결​​정

1. 광학 현미경 G6PD 돌연변이 지하실에 대한 슬라이드를 분석합니다.
   주 : 완전 돌연변이 토굴을 식별하는 데 사용 기준은 (ⅰ) 전체 토굴 푸른 색의 결여였다 (ⅱ) 토굴의 외부 구조 (III) 돌연변이는 굴 (IV)의 두 관찰자 돌연변이 같은 토굴을 확인했다, 7 μm의 인접 부분에서 관찰되었고, 그대로였다. 인접 7 μm의 섹션에서 관찰 돌연변이는 하나의 돌연변이로 계산됩니다.
2. 이미지 각 G6PD 돌연변이 40 배 배율에서 crypt와는 5.0 메가 픽셀 카메라를 사용하여 이미지를 카탈로그이미징 소프트웨어.
3. 배율 10 배 (도 1C)에서의 최소 표면적과 이미지를 가진 레벨에서 각 마우스의 대표 부분을 선택하여 마우스에서 조사 소낭의 총 수를 정량화.
   참고 : 수준은 그들의 근접에 종종 하나 이상의 섹션에 지하실을 돌연변이 보여 연속 4 7 μm의 섹션 (그림 1D)를 나타냅니다. 레벨은 대장의 다른 지역에서 지하실을 시각화 할 수 μm의 50>로 구분됩니다.
4. 각각의 이미지 파일을 열고 시각 (도 1C에서 상자로 표시됨) 파일을 분석하여 레벨 소낭의 개수를 카운트. 이미지 파일을 하나의 파일에 낮은 300>에 20 지하실에서 관찰 된 지하실의 수에 따라 달라질 수 있습니다.
5. 각 콜론 G6PD 돌연변이 지하실 스크리닝 수준의 숫자로 각 마우스에 대해 선택된 레벨 (도 1C)에서 소낭의 총 수를 곱한다. 예를 들면, 총 횟수돌연변이 지하실에 대한 검사 8 단계를 곱한 선택한 레벨 당 1,250 지하실 10,000 지하실의 총 수와 동일합니다. 통계 분석을 위해 각 대장 10,000 지하실의 최소를 평가합니다.
6. 각각의 치료를위한 MF를 계산하는 스크리닝 소낭의 전체 숫자로 모든 동물에서 관찰 된 돌연변이의 수를 조합. 처리되지 않은 쥐의 배경 줄기 세포 MF 수준은 <0.1x10 ^-4 이전 C57BL / 6 마우스에보고에 가깝다 (표 1). ¹¹

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결과

동물에 결장 줄기 세포 돌연변이를 측정 할 수있는 능력은 암 유발에 돌연변이를 상관하는 유일한 방법을 제공한다. 일반적으로, 그것은 암화 과정에서 중요한 단계는 종양 유전자 돌연변이의 활성화 및 / 또는 종양 억제 유전자를 불 활성화 돌연변이가 포함한다고 가정한다. 우리는 PBS 200 μL 또는 PBS 200 μL 10 ㎎ / ㎏ AOM과 C57BL / 6 마​​우스를 주입. AOM은 공지 결장 발암 물질이다. 콜론은 줄기 세...

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토론

종종 유전자 독성 화합물의 효과는 DNA를 수정하는 능력에 의해 결정된다. 이 작업은 일반적으로 조직을 분리하고 DNA 부가 물의 글로벌 레벨을 측정하여 수행됩니다. AOM, 이것은 결장 O ⁶ -methylguanine 부가 정량 포함한다. 이러한 줄기 세포의 틈새와 같은 특정 유형의 세포 내에서의 손상에 대한 이러한 접근 정보를 이용하여, 손실된다. 부가 물 중 일부분 결국 고정 돌연변이로 변환되기 때?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room