Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

Riepilogo

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali è un potente strumento per quantificare in una popolazione di cellule critico se, e in quale misura, una sostanza chimica può indurre mutazioni che potenzialmente portano al cancro. L'uso di un saggio enzimatico per quantificare mutazioni di cellule staminali nel gene di glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked è stata riportata in precedenza. ¹ Questo metodo richiede la preparazione di sezioni congelate e incubazione del tessuto sezionato con una miscela di reazione che produce un colore blu se le cellule producono funzionale glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) enzima. In caso contrario, le cellule appaiono biancastro. Abbiamo modificato la miscela di reazione utilizzando ottimali di taglio Temperatura composto (OCT) media al posto di alcool polivinilico. Ciò facilita la misura di pH, aumenta solubilizzazione dei componenti colorazione G6PD e limita la diffusione dell'enzima G6PD. Per dimostrare che una mutazione si è verificata in una cellula staminale, l'intera cripta deve mancare G6PD enzimaticaattività. Solo se una cellula staminale ospita una mutazione G6PD fenotipica saranno tutti della progenie nella cripta mancano attività enzimatica G6PD. Per identificare cripte con una mutazione di cellule staminali, quattro sezioni congelate adiacenti consecutivi (un livello) sono stati tagliati a 7 micron di spessore. Questo approccio di effettuare tagli adiacenti fornisce conformazione che una cripta era completamente mutato in quanto la stessa cripta mutato sarà osservato in sezioni adiacenti. Vetrini con campioni di tessuto che sono stati più di 50 micron a parte erano pronti a valutare un totale di> 10 ⁴ cripte per mouse. La frequenza di mutazione è il numero di mutanti (bianco) cripte osservati ÷ per il numero di tipo selvatico (blu) cripte in un gruppo di trattamento.

Introduzione

Il cancro del colon è pensato di coinvolgere l'esposizione ad agenti ambientali e componenti della dieta che possono danneggiare il DNA e produrre l'attivazione di mutazioni somatiche in oncogeni (per esempio, ß-catenina) o mutazioni inattivanti in geni oncosoppressori (ad esempio, APC). Si presume che queste mutazioni critiche si verificano in cellule staminali del colon. A causa dell'architettura cripta unica dell'epitelio del colon, è possibile misurare mutazioni di cellule staminali nel colon dopo l'esposizione a sostanze chimiche animali associati carcinogenesi del colon. Diversi enzimi X-linked possono servire come indicatori per le mutazioni che avvengono nelle cellule staminali, come le mutazioni saranno presenti in tutte le cellule all'interno di una cripta.

In precedenza, un procedimento è stata pubblicata a dimostrazione che le sostanze chimiche che inducono tumori del colon nei topi anche generato mutazioni su cellule staminali somatiche nel colon tramite analisi delle mutazioni del glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked (G6PD) gene. ^1-3Il metodo quantifica l'incidenza di mutazioni somatiche casuali nelle cellule staminali del colon senza alcuna pressione di selezione. La procedura prevede la produzione di non fissati sezioni congelate colon da topi trattati e di controllo e l'individuazione delle cripte privi di cellule che producono l'attività G6PD funzionale. Queste cripte mutati, che appaiono bianchi, indicano che la mutazione si è verificato in una cellula staminale che ha dato origine a progenie anche ospitare un gene G6PD mutato. Nel saggio enzimatico, G6PD cripte mutante carente non possono ossidare il glucosio-6-fosfato, che è richiesto per la riduzione del nitro blu tetrazolio (NBT). Quando l'enzima G6PD è funzionale, il NBT nella miscela colorazione è ridotto a formazano insolubile e precipitati, accumulando nella posizione dell'enzima e "colorazione" cellule blu. Cellule che sono mutanti G6PD rimangono biancastro in contrasto con blu macchiati di tipo cripte selvatici. Questo metodo misura le mutazioni che hanno un fenotipo "null". Perché itZymes, quali G6PD, può diffondere fuori delle cellule su una sezione di tessuto non fissata se le sezioni sono poste in una soluzione acquosa, è necessario stabilizzare l'enzima in sezioni di tessuto da analizzare. ⁴ La stabilizzazione dell'enzima nel tessuto non deve interferire con la diffusione di piccole molecole reagenti necessari per la reazione enzimatica G6PD.

Abbiamo fatto una serie di cambiamenti significativi alla procedura originale. Il mezzo per la colorazione enzimatica critica è stata cambiata da polivinilalcool a taglio ottimale Temperatura Compound (OCT), che facilita il controllo del pH e la solubilizzazione dei componenti utilizzati nel saggio. La colorazione viene effettuata con 0,4 - 0,5 ml pozzi realizzati rondelle in acciaio in modo che ciascuna sezione di tessuto ricevuto lo stesso volume della miscela di reazione G6PD. Una procedura è stata sviluppata per stimare il numero di cripte in una sezione immaginata che fornisce una grande campionamento del tessuto del colon senza doverdi contare manualmente> 10 ⁵ cripte per ciascun colon. L'analisi di 7 micron adiacenti sezioni di tessuto permette la visualizzazione di una cripta mutante più diapositive, che riduce potenziali artefatti di colorazione. Questi cambiamenti rendono la procedura più efficiente e riproducibile.

Usando questo protocollo rivisto, abbiamo quantificato la frequenza di mutazione in cellule staminali del colon dopo l'esposizione di topi C57BL / 6 a azoxymethane, un agente cancerogeno colon noto nei roditori. ^5-7

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Protocollo

Le procedure sperimentali e trattamento etico degli animali è stato approvato dal l'Università di Pittsburgh IACUC (protocollo # 1.104.674).

1. Preparazione di G6PD colorazione Miscela

NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di ogni reagenti è il seguente; 5 mM di glucosio-6-fosfato (G6P); 2 NADP mM, 5 mM MgCl _2, NBT mM 0,35 mm 1-metossi-5-metil methylphenazinium solfato (MMPMS) e 0,8. ^1,8,9 Per ogni reagente la concentrazione iniziale è stata derivata per 40 ml di volume finale. Soluzioni sono state preparate al momento e utilizzati ogni giorno.

1. Aggiungere 2 ml di 200 mM pH 7,4 tampone fosfato (PB) a 35 ml di ottobre medio in un tubo da 50 ml e agitare vigorosamente. Conferma con carta pH che la soluzione è ~ pH 7.4. Se non scartare la soluzione.
2. Aggiungere 61 mg G6P disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, 61 mg NADP disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, e 41 mg di MgCl ₂ disciolto in 0,96 ml di 100 mM PB. Riconfermare che il pH è ~ 7,4 ingegnoh carta pH. In caso contrario ~ 7.4, scartare la soluzione.
3. Aggiungere 5 mg di MMPMS disciolti in 0,25 ml di PB 200 mM (pH 7,4). Agitare la miscela di reazione risultante per generare una chiara omogenato rosso scuro. Se la soluzione è torbida, la miscela deve essere scartato. La provetta contenente la miscela di reazione è avvolto in un foglio per minimizzare l'esposizione alla luce. Conservare la miscela di reazione a temperatura ambiente, mentre il componente finale, NBT, viene preparato.
4. Preparare a parte una soluzione 5 mM NBT aggiungendo 0,4 ml anidra formammide dimetil (DMF) e 0,4 ml di etanolo anidro a 164 mg di NBT in una provetta 2 ml di un coperchio O-ring. Chiudere il coperchio liberamente (non ermeticamente chiusi) e portare la soluzione ad ebollizione vigorosa in un bagno ad olio fino a quando il NBT è in soluzione. ⁸
5. Lasciare solubilizzato NBT raffreddare a RT e quindi aggiungere tutta la soluzione alla miscela di reazione Office e agitare energicamente per ottenere una soluzione limpida. Osservare il cambiamento di colore della soluzione da rosso-arancio iniziale a un rosso scuro o purpcolore le nel tempo. E 'normale.
6. Posizionare la miscela finale G6PD colorazione a 37 ° C camera calda per 1 ora prima dell'uso.

2. Trattamento degli animali e del tessuto Collection

1. Trattare 6 settimane di età C57BL / 6 topi maschi con DNA agente dannoso, ad esempio, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) in un volume di 200 microlitri di PBS mediante iniezione ip. Trattare topi di controllo con 200 ml di PBS mediante iniezione ip.
2. A 90 giorni, eutanasia topi da CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale come approvato dal protocollo IACUC.
3. Aprire chirurgicamente la cavità addominale da appena sopra l'ano alla base dello sterno. Spostare il piccolo intestino fuori della cavità del corpo, ma non asportare esso. Accise basso intestino appena sotto il cieco al retto. ¹⁰
4. Tagliare attentamente lungo un lato del colon mediante una forbice micro-dissezione e rimuovere le feci dal colon aperto mediante lavaggio con PBS sterile pulito. Swiss roll accised colon con lato luminale rivolto verso l'esterno, e posto in uno stampo di tessuto. ¹⁰
5. Immergere completamente i due punti in ottobre medio e luogo stampo in una Dewar contenente liquido _N 2. Tenere lo stampo in modo che la base in plastica è solo a contatto con il liquido N ₂ fino a quando il mezzo PTOM solidifica.
6. Conservare il blocco tessuti congelati a -80 fino a tagliare sezioni congelate. Non utilizzare fissatore, che si tradurrebbe in l'inattivazione dell'enzima G6PD.

3. Preparazione di sezioni congelate

1. Tagliare sezioni di tessuto congelato ad uno spessore di 7 micron utilizzando un criostato a -25 ° C. Tagliare 4 consecutivi 7 sezioni micron e posizionare due di essi sulla stessa slitta (figura 1). Preparare 2 diapositive o quattro consecutive 7 sezioni micron per rappresentare un livello del colon (Figura 1).
2. Ripetere per il livello successivo con una distanza minima di> 50 micron dall'ultima sezione del prlivello evious. Questa distanza garantito che le cripte valutati per ogni livello non riproducano l'un l'altro.
3. Pulire frequentemente la lama criostato con 100% di etanolo per rimuovere i residui ottobre che si accumula durante il taglio. Prima di sezionamento riprende, la lama secco è pulito con un foglio di essiccatore antistatica per dissipare carica statica accumulata. Conservare i vetrini con sezioni congelate a -80 ^{° C.}

4. La colorazione di sezioni congelate Tissue

1. Eseguire la reazione enzimatica istochimica a 37 ° C ambiente caldo con umidità elevata.
   NOTA: tentativo la reazione enzimatica in un forno incubazione o su un vetrino più caldo ha portato povero e incoerente G6PD colorazione.
2. La costruzione di pozzi per la colorazione dei tessuti utilizzando due rondelle di acciaio da 1,5 a 0,15 cm (interno diametro x altezza) cm x che sono legati tra loro con grasso al silicone (figura 1). Tagliare il parafilm per adattarsi alla base del pozzo con il centro tagliare e il luogo bend sulla sezione di tessuto sul vetrino.
   NOTA: Il parafilm sul fondo della rondella crea una tenuta tra la slitta e la rondella che mantiene la miscela viscosa G6PD colorazione sulla sezione di tessuto. Questo costrutto dà un pozzo con 0,4 - 0,5 ml di volume in modo che ciascuna sezione di tessuto nello studio riceve lo stesso volume della miscela di reazione di colorazione G6PD.
3. Incubare i vetrini di tessuto congelato ^a 37 ° C in un ambiente caldo per 10 minuti. A 37 ° C, aggiungere la miscela di reazione G6PD colorazione ad ogni pozzetto sezione di tessuto (2 sezioni per vetrino) per 45-50 min. Togliere i vetrini dalla camera calda, e sollevare con cautela i pozzetti in acciaio inox al largo delle diapositive.
4. Set diapositive sul loro lato lungo per permettere al mezzo di reazione di scarico. Collocare i vetrini in PB 100 mM (pH 7,4) per 30-60 minuti per rimuovere la miscela di reazione G6PD colorazione dal tessuto senza disturbare la colorazione dei tessuti. Immergere i vetrini in acqua distillata per 5-10 minuti per eliminare i sali PB
5. Sigillare il tessuto da aggiungereing fluoro-gel da un contagocce sul tessuto e in attesa ~ 30 minuti che si asciughi. Evitare bolle che possono confondere l'identificazione delle cripte mutati.
   NOTA: Se si formano bolle, la procedura può essere ripetuta dopo la rimozione del fluoro-gel per immersione in acqua distillata. Non utilizzare coprioggetto in quanto tendono a intrappolare bolle d'aria.

5. Determinazione di G6PD Mutant Cripte e Mutazione frequenza

1. Analizzare scivoli per G6PD cripte mutanti al microscopio ottico.
   NOTA: I criteri utilizzati per individuare una cripta completamente mutante sono stati: (i) l'intera cripta era privo di colore blu; (ii) la struttura esterna della cripta era intatto, (iii) la cripta mutante è stato osservato su sezioni adiacenti 7 micron e, (iv) due osservatori dovevano identificare la stessa cripta come un mutante. Mutanti osservati su adiacenti 7 sezioni micron vengono conteggiati come un mutante.
2. Immagine ogni G6PD cripta mutante a 40x e catalogare le immagini con una fotocamera da 5.0 megapixel consoftware di imaging.
3. Quantificare il numero totale di cripte esaminati in un mouse selezionando una sezione rappresentativa per ogni mouse dal livello con la superficie più piccola e l'immagine che a ingrandimento 10x (Figura 1C).
   NOTA: Un livello rappresenta quattro consecutivi 7 sezioni micron (Figura 1D), che per la loro vicinanza spesso mostrano cripte mutati in più di una sezione. I livelli sono separati da> 50 micron per visualizzare cripte diverse aree del colon.
4. Aprire ogni file di immagine e contare visivamente il numero di cripte a livello analizzando i file (mostrate come caselle nella Figura 1C). File di immagini variano nel numero di cripte osservati da un minimo di 20 a> 300 cripte in un unico file.
5. Moltiplicare il numero totale delle cripte dal livello selezionato (Figura 1C) per ogni mouse per il numero di livelli di screening per cripte G6PD mutanti per ciascuna colon. Per esempio, un conteggio totale di1.250 cripte per livello selezionato moltiplicato per 8 livelli a screening per cripte mutanti equivale a un conteggio totale di 10.000 cripte. Valutare un minimo di 10.000 cripte per ciascun colon per l'analisi statistica.
6. Combinare il numero di mutanti osservate in tutti gli animali per il numero totale di cripte schermati per calcolare il MF per ogni trattamento. Il livello MF cellule staminali sfondo in topi non trattati è <0.1x10 ^-4 (Tabella 1), che è vicino a quello riportato in precedenza in topi C57BL / 6. ¹¹

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Risultati

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali del colon negli animali fornisce un modo unico per correlare le mutazioni a induzione di cancro. Normalmente, si presume che il passaggio critico nella carcinogenesi comporta mutazioni attivanti in oncogeni e / o inattivazione mutazioni in geni oncosoppressori. Abbiamo iniettato Topi C57BL / 6 con 200 microlitri di PBS o 10 mg / kg AOM in 200 ml di PBS. AOM è un agente cancerogeno del colon conosciuto. ^5-7 A 90 giorni i due punti sono stati analizzati p...

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Discussione

Spesso l'effetto genotossico di un composto è determinata dalla sua capacità di modificare il DNA. Questo avviene normalmente isolando il tessuto e misurando il livello globale di addotti di DNA. Per AOM, ciò comporterebbe la quantificazione O ⁶ -methylguanine addotti nel colon. Utilizzando queste informazioni approccio sui danni entro specifici tipi cellulari, come ad esempio nella nicchia delle cellule staminali, è perduto. Inoltre, un addotto DNA non è la stessa come una mutazione in quanto solo u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room