Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Zusammenfassung

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zur Stammzellmutationen zu messen, ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um in einer kritischen Zellpopulation zu quantifizieren, ob und in welchem ​​Umfang kann eine chemische Mutationen, die möglicherweise zu Krebs führen zu induzieren. Die Verwendung eines enzymatischen Assays zur Stammzellmutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Gens zu quantifizieren wurde bereits berichtet. ¹ Dieses Verfahren erfordert die Herstellung von Gefrierschnitten und Inkubation des geschnittenen Gewebes mit einem Reaktionsgemisch, das ein ergibt blaue Farbe, wenn die Zellen produzieren funktionelle Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Enzym. Wenn nicht, werden die Zellen erscheinen weißlich. Haben wir die Reaktionsmischung unter Verwendung optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT) Medium anstelle von Polyvinylalkohol modifiziert. Dies erleichtert die pH-Messung erhöht Solubilisierung der G6PD Färbungskomponenten und schränkt die Diffusion der G6PD-Enzym. Um zu demonstrieren, dass eine Mutation aufgetreten ist in einer Stammzelle muss der gesamte Krypta G6PD enzymatische fehltAktivität. Nur wenn eine Stammzelle birgt eine phänotypische G6PD Mutation wird die gesamte Nachkommenschaft in der Krypta fehlt G6PD enzymatische Aktivität. Um Krypten mit einer Stammzelle Mutation zu identifizieren, wurden vier aufeinander folgenden benachbarten Gefrierschnitten (Stufe A) bei 7 & mgr; m Dicke geschnitten. Dieser Ansatz zur Herstellung von benachbarten Schnitten bietet Konformation, die eine Krypta wurde vollständig mutiert, da dieselbe mutierte Krypta in benachbarten Abschnitten beachten. Objektträger mit Gewebeproben, die mehr als 50 & mgr; m getrennt waren bereit waren, insgesamt> 10 ⁴ Krypten pro Maus zu bewerten. Die Mutationsfrequenz ist die Anzahl der beobachteten mutiert (weiß) Krypten durch die Anzahl der Wildtyp (blau) Krypten in einer Behandlungsgruppe ÷.

Einleitung

Darmkrebs ist gedacht, um die Exposition gegenüber Umweltfaktoren und Nahrungskomponenten, die DNA schädigen kann es sich um und produzieren Aktivieren somatische Mutationen in Onkogenen (zB ß-Catenin) oder inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressor-Gene (zB APC). Es wird angenommen, dass diese kritische Mutationen in colonic Stammzellen vorkommen. Aufgrund der einzigartigen Architektur der Krypta Kolonepithel, ist es möglich, Stammzellmutationen im Dickdarm nach dem Belichten Tiere Chemikalien Coloncarzinogenese zu bemessen. Mehrere X-chromosomal-Enzyme können als Indikatoren für die Mutationen, die in Stammzellen auftreten dienen, wie die Mutationen wird in allen Zellen in einer Krypta vorhanden sein.

Bisher wurde ein Verfahren veröffentlicht demonstriert, dass Chemikalien, die Dickdarmtumoren in Mäusen zu induzieren ebenfalls erzeugt somatischer Stammzellen Mutationen in den Dickdarm über die Analyse von Mutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Gens. ^1-3Das Verfahren quantifiziert die Häufigkeit von Zufalls somatische Mutationen in Kolon-Stammzellen ohne Selektionsdruck. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung von nicht fixierten gefrorenen Doppelpunkt Schnitte von behandelten und Kontrollmäusen und die Identifikation der Krypten frei von Zellen, die funktionelle G6PD-Aktivität zu erzeugen. Diese mutierten Krypten, die weiß erscheinen, zeigen an, dass die Mutation trat bei einer Stammzelle, die zu Nachkommen gab auch beherbergt eine mutierte G6PD-Gen. Im Enzymassay kann G6PD defiziente Mutante Krypten nicht oxidiert Glucose-6-phosphat, die zur Reduktion von Nitro-Blau-Tetrazolium (NBT) erforderlich ist. Wenn G6PD Enzym ist funktionell, wird die NBT in der Färbemischung zu unlöslichem Formazan reduziert und ausfällt, Speichern am Ort des Enzyms und "Schleierbildung" Zellen blau. Zellen, die G6PD Mutanten bleiben weißlichen, im Gegensatz zu blau gefärbte Wildtyp Krypten. Bei dieser Methode wird Mutationen, die eine "null" Phänotyp haben. Weil enEnzyme wie G6PD kann aus den Zellen an einer unfixierten Gewebeschnitt, wenn die Abschnitte in einer wässrigen Lösung platziert diffundieren, ist es erforderlich, das Enzym in den Gewebeabschnitten zu analysierende stabilisieren. ⁴ die Stabilisierung des Enzyms in der Gewebe darf nicht mit Diffusion kleiner Moleküle Reagenz für G6PD enzymatische Reaktion notwendig stören.

Wir haben eine Reihe von signifikanten Änderungen des ursprünglichen Verfahrens hergestellt. Das Medium für die kritische enzymatische Färbung wurde von Polyvinylalkohol zu optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT), die pH-Steuerung und Solubilisierung der im Assay verwendeten Komponenten ermöglicht geändert. Die Färbung wird durchgeführt unter Verwendung von 0,4 - 0,5 ml Vertiefungen der Stahlscheiben hergestellt, so dass jede Gewebeabschnitt empfangen das gleiche Volumen an G6PD Reaktionsgemisches. Es wurde ein Verfahren entwickelt, um die Anzahl der Krypten in einem abgebildeten Abschnitt, der einen großen Abtastung des Colongewebe bietet, ohne schätzenmanuell zählen,> 10 ⁵ Krypten pro Doppelpunkt. Die Analyse von angrenzenden 7 um Gewebeschnitte ergibt Visualisierung einer Mutante Krypta auf mehr als eine Folie, die so Flecken Artefakte reduziert. Diese Veränderungen stellen das Verfahren effizienter und reproduzierbar.

Nach dem geänderten Protokoll haben wir die Mutationsfrequenz in colonic Stammzellen nach der Belichtung von C57BL / 6-Mäusen zu Azoxymethan, einem bekannten Karzinogen colon in Nagetieren quantifiziert. ^5-7

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Protokoll

Die experimentellen Verfahren und ethische Behandlung von Tieren wurde von der University of Pittsburgh IACUC (Protokoll # 1104674) zugelassen.

1. Herstellung von G6PD Färbemischung

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der einzelnen Reagenzien ist wie folgt; 5 mM Glucose-6-Phosphat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl _2, 0,35 mM 1-methoxy-5-Methylphenazinium-Methylsulfat (MMPMS) und 0,8 mM NBT. ^1,8,9 für jedes Reagenz die anfängliche Konzentration wurde für 40 ml Endvolumen abgeleitet. Lösungen wurden frisch zubereitet und verwendet werden, jeden Tag.

1. 2 ml 200 mM pH 7,4 Phosphatpuffer (PB) zu 35 ml der OCT-Medium in einem 50-ml-Tube und kräftig schütteln. Bestätigen Sie mit pH-Papier, dass die Lösung ~ pH 7,4. Wenn nicht die Lösung verwerfen.
2. Add 61 mg G6P in 0,94 ml 200 mM PB gelöst in 0,94 ml 200 mM PB 61 mg NADP gelöst und 41 mg MgCl _{2 in} 0,96 ml 100 mM PB gelöst. Zu bestätigen, dass der pH-Wert ~ 7,4 with pH-Papier. Wenn nicht ~ 7,4, die Lösung verwerfen.
3. Plus 5 mg MMPMS in 0,25 ml 200 mM PB (pH 7,4) gelöst. Kräftig schütteln der resultierenden Reaktionsmischung, um eine klare dunkelrote Homogenat zu generieren. Wenn die Lösung trübe ist, sollte die Mischung verworfen. Die Röhre, die das Reaktionsgemisch wird in Folie eingewickelt, um Belichtung zu minimieren. Speichern das Reaktionsgemisch bei RT, während die letzte Komponente, NBT, wird hergestellt.
4. Vorbereitung separat eine 5 mM NBT-Lösung durch Zugabe von 0,4 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) und 0,4 ml wasserfreiem Ethanol auf 164 mg NBT in einem 2 ml-Röhrchen mit einem O-Ring Deckel. Schließen Sie den Deckel lose (nicht dicht verschlossen) und wird die Lösung auf einem kräftigen Sieden in einem Ölbad, bis die NBT in Lösung ist. ⁸
5. Lassen Sie das solubilisierte NBT auf RT abkühlen und fügen Sie dann die gesamte Lösung des ÜLG Reaktionsgemisch und kräftig schütteln, um eine klare Lösung zu erhalten. Beachten Sie die Lösung Farbwechsel von Anfangs orange-rote bis dunkelroter oder purple Farbe im Laufe der Zeit. Das ist normal.
6. Setzen Sie den endgültigen G6PD Färbemischung in einem 37 ° C warmen Raum für 1 Stunde vor dem Gebrauch.

2. Behandlung von Tieren und Gewebeentnahme

1. Behandlung von 6 Wochen alten C57BL / 6-Mäuse mit männlichen DNA-schädigenden Mittel, zB 10 mg / kg azoxymethane (AOM) in einem Volumen von 200 ul PBS durch ip-Injektion. Behandlung von Mäusen der Kontrollgruppe mit 200 ul PBS durch ip-Injektion.
2. An 90 Tagen einschläfern Mäuse durch _CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte wie IACUC Protokoll genehmigt.
3. Chirurgisch öffnen die Bauchhöhle von knapp über dem Anus mit der Basis des Brustbeins. Bewegen Sie den Dünndarm aus der Körperhöhle, aber nicht herauszuschneiden es. Auszuschneiden den unteren Darm knapp unter dem Blinddarm zum Rektum. ¹⁰
4. Entlang einer Seite des Dickdarms sorgfältig Scheibe mit einer Scheren-Mikrodissektion und entfernen Fäkalien aus der geöffneten Doppelpunkt durch Waschen mit reinem sterilem PBS. Swiss roll die Verbrauchd Doppelpunkt mit der luminalen Seite nach außen, und in eine Gewebeform. ¹⁰
5. Vollständig einzutauchen den Doppelpunkt in OCT-Medium und Ort Form in einem Dewar-enthaltenden flüssigen N _2. Halten Sie die Form, so dass die Kunststoffbasis ist nur in Kontakt mit dem flüssigen N _{2, bis} die OCT-Medium fest gefroren.
6. Bewahren Sie die gefrorenen Gewebeblock bei -80 bis Schneiden Gefrierschnitten. Verwenden Sie keine Fixiermittel, die in der Inaktivierung von G6PD Enzym führen würde.

3. Herstellung von Gefrierschnitte

1. Geschnitten Gefrierschnitte mit einer Dicke von 7 & mgr; m unter Verwendung eines Kryostats auf -25 ° C. Schneiden Sie 4 aufeinanderfolgenden Abschnitten 7 um und legen Sie zwei von ihnen auf demselben Objektträger (Abbildung 1). Bereiten Sie 2 Dias oder vier aufeinander folgenden 7 um Abschnitte zu einer Ebene des Dickdarms (Abbildung 1) zu vertreten.
2. Wiederholen Sie für die nächste Ebene mit einem Mindestabstand von> 50 & mgr; m aus dem letzten Abschnitt des previous Ebene. Dieser Abstand gewährleistet, dass die Krypten für jede Ebene beurteilt nicht duplizieren einander.
3. Häufig wischen Sie den Kryostaten Klinge mit 100% Ethanol, um das Office-Rückstand, der beim Schneiden ansammelt zu entfernen. Vor dem Schneiden wieder aufgenommen wird, wird das trockene Blatt mit einer antistatischen Trockner Blatt um angesammelte statische Ladung abzuleiten abgewischt. Shop Folien mit den Gefrierschnitten bei -80 ^o C

4. Die Färbung der Gefrierschnitt Tissue

1. Führen Sie die Enzymhistochemie Reaktion in einem 37 ° C warmen Raum mit hoher Luftfeuchtigkeit.
   HINWEIS: Der Versuch, die enzymatische Reaktion im Brutschrank oder auf einer Folie wärmer führte zu schlechten und inkonsistente G6PD-Färbung.
2. Bauen Brunnen für Gewebefärbung unter Verwendung von zwei 1,5 cm x 0,15 cm Stahlscheiben (Innendurchmesser x Höhe), die zusammen mit Silikonfett (Abbildung 1) gebunden sind. Schneiden Sie den Parafilm, um die Basis der gut mit dem Zentrum passen herausgeschnitten und der Brunnen Ortd über dem Gewebeschnitt auf der Folie.
   HINWEIS: Der Parafilm auf der Unterseite der Scheibe erzeugt eine Dichtung zwischen dem Schieber und der Scheibe, die das viskose G6PD Färbemischung auf dem Gewebeschnitt beibehält. Dieses Konstrukt ergibt einen gut mit einem von 0,4 bis 0,5 ml Volumen, so dass jede Gewebeschnitt in der Studie erhält das gleiche Volumen G6PD Reaktions Färbemischung.
3. Gefrorenen Gewebeschnitten bei 37 ^{° C} in einem warmen Raum für 10 min. Bei 37 ° C, fügen G6PD Färbung Reaktionsgemisch zu jedem Gewebeschnitt gut (2 Teile pro Folie) für 45-50 min. Objektträger aus der warmen Stube, und heben Sie die Stahlbrunnen Edelstahl aus den Folien.
4. Set gleitet auf ihrer langen Kante, damit das Reaktionsmedium ablaufen. Die Objektträger in 100 mM PB (pH 7,4) 30-60 Minuten zu G6PD Färbereaktion Mischung aus dem Gewebe, ohne das Gewebe zu stören Färbung zu entfernen. Tauchen Sie gleitet in destilliertem Wasser für 5-10 Minuten, um PB Salze zu entfernen
5. Dichten Sie das Gewebe durch Adding Fluor-Gel aus einer Pipette auf das Gewebe und Warte ~ 30 min, bis es trocken. Luftblasen vermeiden, die die Identifizierung von mutierten Krypten verwechseln kann.
   HINWEIS: Wenn sich Blasen bilden, kann das Verfahren nach dem Entfernen des Fluor-Gel durch Einweichen in destilliertem Wasser wiederholt. Verwenden Sie keine Deckgläser, wie sie zu stoppen Luftblasen neigen.

5. Bestimmung der G6PD Mutant Krypten und Mutationsfrequenz

1. Analysieren Sie Folien für G6PD Mutante Krypten unter einem Lichtmikroskop.
   HINWEIS: Die verwendeten, um eine vollständig mutierten Krypta identifizieren Kriterien waren: (i) die gesamte Krypta war frei von blauer Farbe; (ii) die äußere Struktur der Krypta intakt war, (iii) die Mutante Krypta an benachbarten Abschnitten 7 um beobachtet, und, (iv) zwei Beobachtern hatte die gleichen Krypta als Mutante zu identifizieren. An benachbarten Abschnitten 7 um beobachtet Mutanten werden als eine Mutante gezählt.
2. Bild jedes G6PD Mutante Krypta bei 40-facher Vergrößerung und katalogisieren die Bilder mit einem 5,0-Megapixel-Kamera mitImaging-Software.
3. Quantifizierung der Gesamtzahl der Krypten in einer Maus untersucht, indem Sie einen repräsentativen Abschnitt für jede Maus von der Ebene mit der kleinsten Oberfläche und Bild es bei 10-facher Vergrößerung (Abbildung 1c).
   Hinweis: eine Ebene stellt vier aufeinander folgenden 7 um Abschnitte (1D), die aufgrund ihrer Nähe zeigen oft auf mehr als einem Abschnitt mutiert Krypten. Die Pegel werden durch> 50 um getrennt Krypten aus verschiedenen Bereichen des Darms sichtbar zu machen.
4. Öffnen Sie jede Bilddatei und optisch zählen die Anzahl der Krypten auf einer Ebene durch die Analyse der (als Kästchen in 1C gezeigt) Dateien. Bilder-Dateien werden in der Anzahl der von so niedrig wie 20 bis> 300 Krypten in eine Datei beobachtet Krypten variieren.
5. Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der Krypten aus der ausgewählten Ebene (Abbildung 1c) für jede Maus durch die Anzahl der Ebenen für G6PD Mutante Krypten pro Doppelpunkt gescreent. Zum Beispiel eine Gesamtzahl von1.250 Krypten pro gewählte Stufe, multipliziert mit 8 Stufen für Mutante Krypten gescreent entspricht einer Gesamtzahl von 10.000 Krypten. Beurteilen Sie ein Minimum von 10.000 Krypten pro Doppelpunkt für die statistische Analyse.
6. Verbinden die Anzahl der in allen Tieren durch die Gesamtzahl der Krypten gescreent, um die MF für jede Behandlung berechnet beobachteten Mutanten. Der Hintergrund Stammzellen MF Ebene in unbehandelten Mäusen ist <0.1x10 ^{-4 (Tabelle} 1), die in der Nähe der zuvor in C57BL / 6 Mäusen berichtet wird. ¹¹

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Ergebnisse

Die Fähigkeit, Kolon-Stammzellmutationen in Tieren zu messen, bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Mutationen zu Krebs Induktion korreliert. Normalerweise wird angenommen, dass der kritische Schritt bei der Karzinogenese beinhaltet aktivierende Mutationen in Onkogenen und / oder inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen. Injizierten wir C57BL / 6-Mäuse mit 200 ul PBS oder 10 mg / kg AOM in 200 ul PBS. AOM ist ein bekanntes Karzinogen Doppelpunkt. ^5-7 nach 90 Tagen wurden die Doppelpunkte für d...

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Diskussion

Oft die genotoxische Wirkung einer Verbindung wird durch ihre Fähigkeit, zu modifizieren DNA bestimmt. Dies wird normalerweise durch Isolieren der Gewebe und Messen der globalen Ebene der DNA-Addukte erfolgt. AOM wäre dies die Quantifizierung ^O 6 -Methylguanin-Addukte in den Dickdarm. Unter Verwendung dieses Ansatzes Informationen zu Schäden innerhalb bestimmter Zelltypen, wie in der Stammzellnische wird verloren. Darüber hinaus ist ein DNA-Addukt nicht das gleiche wie eine Mutation, da nur ein kleiner Te...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room