حقن Intracerebroventricular من الببتيدات اميلويد β في الفئران العادية للحث تماما العجز الإدراكي الزهايمر تشبه

Summary

واميلويد β (Aβ) -injected نموذج حيواني تمكن الإدارة من كمية وأنواع من شظايا Aβ محددة ويقلل الفروق الفردية داخل كل مجموعة الدراسة. يصف هذا البروتوكول حقن intracerebroventricular (ICV) من Aβ دون أدوات المجسم، مما يتيح للإنتاج الانحرافات السلوكية الزهايمر تشبه في الفئران العادية.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of Aβ oligomers and plaques is observed. Such Aβ abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of Aβ levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of Aβ is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an Aβ-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the Aβ into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of Aβ. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of Aβ, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of Aβ abnormalities.

Introduction

وبالنظر إلى أن اميلويد β (Aβ) هي السمة المميزة المرضية لمرض الزهايمر (م)، وقد ركزت على تطوير نماذج حيوانية م على overexpression العصبي للAβ. بسبب طفرات في بروتين اميلويد السلائف (APP) أو presenilin (PS) يؤدي إلى اضطراب في التوازن Aβ وفي نهاية المطاف إلى التسبب في العائلي ¹ م، نماذج الماوس التي تنطوي على APP أو PS الطفرات الجينية تم المقبولة عموما. من بين مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا، وتشمل نماذج الماوس نموذجية ما يلي: TG2576، PDAPP، APP / PS1 وAPP23. في الدماغ، هذه الفئران تظهر عادة تجميع Aβ لويحات خرف في نهاية المطاف. ويتبع تشكيل لوحة من الضعف الادراكي كبير بحيث أنها تظهر ضعف الأداء في الاختبارات السلوكية في التعلم والذاكرة. وهكذا ساهمت توليد باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تحاكي بشكل طبيعي علم الأمراض AD الإنسان في مجتمع البحث AD من خلال السماح لنا لرصد التقدم من ديsease. ومع ذلك، باستخدام الفئران المعدلة وراثيا غير اقتصادية وتستغرق وقتا طويلا لأنه يستغرق شهورا للفئران لتطوير لويحات Aβ وحتى وقتا أطول لتظهر متشابك الناجم عن Aβ أو الانحرافات السلوكية ^2،3. وضعت أصلا كبديل للتغلب على أوجه القصور في نماذج الفئران المعدلة وراثيا، كما تستخدم نماذج غير المعدلة وراثيا عادة بسبب مزاياها متميزة. نماذج AD-الناجم عن العوامل المسببة للأمراض يمكن أن تنتج عن طريق الحقن المباشر للAβ في الدماغ، في حين يمكن أيضا أن تسبب العجز المعرفي مثل م من قبل الكيميائية والفيزيائية وسائل أخرى مثل الحقن المركبات السمية العصبية مثل سكوبولامين، تحريض الآفات في المجالات ذات الصلة الإدراك مثل الحصين، أو الضرر القشرية ^4. ومع ذلك، لا تعكس تحريض غير المسببة للأمراض من الضعف الادراكي بدقة الفيزيولوجيا المرضية الأساسي للم. بدلا من ذلك، فإنه يحاكي فقط نتائجها الأعراض. في المقابل، نموذج AD-الناجم عن العوامل المسببة للأمراض، وهناك46؛ نموذج الفأر -injected، لا يمكن إلا أن تظهر الانحرافات السلوكية مثل م ولكن يمكن أيضا يحمل علم الأمراض Aβ، الميزة المشتركة بين العائلي ومتفرقة م.

وعلى الرغم من صعوبة تصور لويحات Aβ في أنسجة المخ، أكبر فائدة من طراز حقن Aβ أن يجعلها جذابة للتحقيق م هي التحكم فيها. يمكن للباحثين تخلص من الفروق الفردية في نماذج الفئران يمكن أن يؤدي إلى بيانات خاطئة في الدراسات المتعلقة بالمخدرات. يتم تمكين العلاج من تعاطي المخدرات في الوقت المناسب اعتمادا على آلية للعقار مرشح. أن تضع، ​​يمكن تطبيق المانع من Aβ التجميع قبل حقن Aβ. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمحققين أن نفترض أن تحول الممرض الذي يطرح نفسه بعد حقن Aβ مشتق من التعرض Aβ لأن العوامل الأخرى لرقابة مشددة، بما في ذلك الفروق الفردية.

في هذا البروتوكول، وصفا حيا من حآه للحث على النمط الظاهري مثل م في الفئران العادية عبر Aβ intracerebroventricular (ICV) حقن بدون الات المجسم يرد. تقليل الضرر الناجم عن أنشطة الإدراج إلى أنسجة المخ ضروري لمنع احتمال الضرر الهيكلي والتهاب الناجم عن الآفة. وعدم وجود مهارة في التعامل مع الماوس يؤدي إلى الإصابة العصبية غير متوقعة. وعلاوة على ذلك، والتقنيات التي تمكن من زاوية وعمق المناسبة لتحقيقها خلال حقن ذات أهمية خاصة للتحايل على الأخطاء المتكررة. وبالإضافة إلى ذلك، شرح حية مفصل لحقن ICV، ويتضح أن الاعتماد على نموذج التي تنتجها بروتوكول التالي أيضا في الأقسام التالية. بروتوكول التالية يمكن أن تكون أداة موثوقة وسهلة الفهم الذي يسهم في البحوث م، وبالتالي توفير وسيلة للتقدم التي يمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى اكتشاف معنى للمجتمع الميلادي.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعاهد القومية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH النشر رقم 8023، منقحة 1978) ومع لجنة رعاية واستخدام الحيوان لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية كيغالي (سيول، كوريا).

1. إعداد الحيوان

1. إعداد مجموعة من الذكور الفئران مجلس النواب البالغ من العمر 7 أسابيع (أو C57BL / 6).
2. السماح الفئران تذهب من خلال عملية التأقلم لمدة 3-7 أيام بعد النقل لاستعادة التوازن. بشكل عام، وضع مجموعة من 4-5 الفئران في كل قفص والمحافظة عليها في 22-23 درجة مئوية و 40٪ الرطوبة، مع 12/12 ساعة دورة الضوء / الظلام. توفير الماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
   ملاحظة: عملية التأقلم أمر بالغ الأهمية للسماح التعافي من الإجهاد الشحن والتكيف في السكن الجديد، والغذاء، والمياه، ورائحة وكذلك قفص جديد ودورة الخفيفة. في هذه التجربة، تم إيواء الفئران في اقفاص التهوية بشكل فردي (IVCs) الواقعة في جمعية مهندسي البترولcific الممرض الحرة (SPF) منشأة -grade
3. وزن كل فأر واستبعاد المواد التي ينحرف ± 10٪ من متوسط ​​الوزن.
4. تقسيم الموضوعات إلى مجموعتين: مجموعة حقن سيارة (Aβ (-)) والمجموعة التي حقنت Aβ (Aβ (+)). إذا كانت التجربة هي لاختبار فعالية من عقار مرشح معين، تقسيم الفئران إلى أربع مجموعات هي: (1) Aβ (-) / المخدرات (-)، (2) Aβ (-) / المخدرات (+)، (3) Aβ (+) / المخدرات (-)، و (4) Aβ (+) / المخدرات (+).

2. إعداد الببتيد Aβ

1. علاج الببتيد Aβ، والمستمدة من خلال التركيب الكيميائي ⁵ أو من مصادر تجارية، مع قبل المبردة 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول (HFIP) بحل أي وحدات العمل ولجعل الببتيدات متجانسة ⁶ .
   1. يصوتن الحل Aβ / HFIP في sonicator حمام مائي لمدة 5 دقائق (في RT)، بلطف دوامة، واحتضان الحل لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة HFIP تماما عن طريق التبخر مع النيتروجينوتخزين Aβ متجانسة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. إعداد مونومرات Aβ: (100 ميكرومتر Aβ، 10٪ DMSO، و 90٪ PBS) جعل 1 ملي Aβ ثنائي ميثيل سلفوكسيد الأسهم ([دمس])، وتمييع 10 أضعاف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
3. إعداد الأوليغومرات Aβ.
   1. احتضان حل مونومر Aβ (التي تحتوي على Aβ (1-42) أو Aβ (1-40)) (الخطوة 2.2) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أو 7 أيام، على التوالي.
   2. وضع حل Aβ في أنبوب مختومة في كيس انغلق تحتوي على منشفة ورقية مبللة لتوفير بيئة ترطيب لمنع تبخر المياه خلال فترة الحضانة.
4. تأكيد الأوليغومرات Aβ مستعدة عبر دوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE) مع الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة ^6.
5. إعداد برنامج تلفزيوني حل التحكم التي تحتوي على 10٪ DMSO لحقن ICV السيارة.

3. إعداد الحقنة

1. إعداد محقنة مكروية مع 26 G إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ لحقن ICV.
2. تعقيم حقنة في الأوتوكلاف مع كافة الأجهزة الأخرى التي سيتم استخدامها لإجراء العمليات الجراحية. بعد الأوتوكلاف، ضع الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
3. التفاف إبرة محقنة مكروية مع بارافيلم لضبط طوله إلى 3.8 مم لتمكين أقصى قدر من الدقة في عمق الحقن في الدماغ (الشكل 1A). (بالنسبة للفئران B6، وضبط حقنة الإبرة إلى 3.6 ملم).
   ملاحظة: سوف ضغط من بارافيلم يؤدي إلى عمق حقن تزيد على 3.6 ملم بطني. لمنع بارافيلم من يتم ضغطها أثناء إدخال الإبرة، المكتظة التفاف إبرة عدة مرات.
4. غسل الفضاء الداخلي من المحاقن مع 70٪ من الإيثانول، مرتين.
5. يصوتن الحقنة والإبرة في sonicator حمام مائي لمدة 30 دقيقة في RT.
6. غسل الفضاء الداخلي من المحاقن مع 70٪ من الإيثانول، مرتين.
7. التشطيف حقنةمع الماء المقطر وجافة تماما في غطاء الدخان لفترة أطول من 30 دقيقة. ترك حقنة نظيفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة قبل البدء في حقن Aβ.

4. حقن Aβ ماوس إعداد نموذج

ملاحظة: تنظيف ميدان التشغيل مع مطهر للحفاظ على ظروف معقمة وتعقيم جميع الأدوات الجراحية لحقن ICV باستخدام الايثانول 70٪ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية.

1. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط من زيلازين (20 ملغ / كلغ) وتلييتامين · حمض الهيدروكلوريك / zolazepam · حمض الهيدروكلوريك (80 ملغ / كلغ) قبل الحقن ICV. ضع الماوس على حصيرة الدافئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في حين تخدير وتأكيد التخدير الكافي من خلال تقييم استجابة القدم قرصة.
2. تطبيق برنامج تلفزيوني العقيمة قطرات لكلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية (الشكل 1B).
3. إعداد اثنين من المرايا عن طريق رسم متعددة الخطوط المستقيمة الرأسية على سطوحها في حالة difficuLTY حقن حقنة عموديا.
4. وضع مرآة واحدة (M1) بجوار جسم الفأر والآخر (M2) في مقدمة الرأس. الحفاظ M1 بالتوازي مع خط الوسط وهمي بين عينيه من الفأرة وترتيب M2 عمودي على M1، حتى أن الطائرتين تشكل زاوية 90 درجة (الشكل 1C). وضع M1 على الجانب الأيسر من الفأرة إذا كان الباحث هو اليد اليمنى. وضع M1 على الجانب الأيمن من الفأرة إذا أعسر الباحث.
5. رذاذ الايثانول 70٪ على منتصف الجبهة من الفأرة وفرك مع قطعة قطن جافة. لا تبلل كبيرة جدا من مساحة الجبين لتجنب خفض درجة حرارة الجسم بسبب التبخر من الكحول.
6. مسح المنطقة نفسها على الجبهة مع 2٪ محلول الكلورهيكسيدين باستخدام قطعة قطن نظيفة. كرر scrubbings مع الكحول وchlorohexidine لمجموعه ثلاث مرات لكل منهما.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، حلاقة الشعر على الجبين من الفأرة من أجل تقليل possiبيليتي من التلوث
7. تحديد موقع bregma.
   1. باستخدام الإبهام والسبابة، وعقد بإحكام أسفل الجلد في الجبين، مباشرة فوق اثنين العينين إلى درجة أن تبرز كلتا العينين. سحب الجلد مرة أخرى إلى جعل جبهته مشدود وتقليل الحركات الجمجمة تحت الجلد.
   2. تشكيل مثلث غير مرئية عن طريق تعيين ثلاثة رؤوس: اثنان أعين من الفأرة ونقطة حيث الإبهام والسبابة لقاء، وbregma. (أرقام 1B، أحمر السهم: bregma)
8. تحديد موقع نقطة حقن مع شريط قياس: -1.0 ± 0.06 ملم الخلفي إلى bregma، 1.8 ± 0.1 مم الجانبي لالدرز السهمي، و 2.4 ملم في العمق (1D الشكل، النجوم الزرقاء: نقاط حقن في كل نصف الكرة الأرضية). (بالنسبة للفئران B6: -0.9 مم الخلفي، 1.7 مم الجانبية، و 2.2 ملم في العمق)
9. ملء الحقنة مع 10 ميكرولتر حل Aβ أو مركبة مع حل الزائد من أجل تجنب حقن الهواء بطريق الخطأ.
10. وضع حقنة في عشرنقطة حقن ه (كما هو موضح في بروتوكول 4.7). جعل حقنة عمودي على الطائرة من نقطة الحقن. ينعكس محاذاة الصور من الحقنة في كل من المرايا مع الخطوط المرسومة على المرايا من منظور ثابت (الشكل 1C).
11. بدء إدخال الإبرة حتى يصل إلى التفاف بارافيلم الجلد.
12. الحفاظ على حقنة جهة عقد ثابت واستخدام اليد الأخرى لحقن 5 ميكرولتر من حل Aβ أو مركبة، ببطء على مدى 5 ثانية دون التوقف. تأكد من تبقى حقنة عمودي طوال الوقت. بعد الانتهاء من الحقن، وانتظر 3-5 ثانية قبل إزالة حقنة لنشرها.
13. وإذا افترضنا أن موقف مثلث الأصلي، الضغط المعتدل لحماية الجمجمة من أي تحركات غير ضرورية. إزالة حقنة دون إمالة.
14. ضع الماوس حقن Aβ على وسادة دافئة لاستعادة والحفاظ على الاستلقاء على القصية. لا تترك الماوس غير المراقب حتى يستعيد وعيه ولا يعودون م[أوس] إلى قفص يحتوي على الفئران غير الجراحية حتى تعافى تماما.
15. غسل حقنة وفقا لخطوات 3،3-3،6.
16. مراقبة بعد العمل الجراحي التنقل من الفئران والتحقق من وجود أي علامة على الإصابة أو المرض في الفئران لمدة 5-7 أيام.

الشكل 1. Aβ حقن في المنطقة ICV (A) إبرة حقنة ملفوفة بارافيلم-مقارنة مع إبرة حقنة معدلة؛ (ب) برنامج تلفزيوني يسقط على العينين لمنع جفاف. المثلث على جبين الفأر مع الإبهام، السبابة، وعيون اثنين من الماوس، فضلا عن خط الوسط وهمي على مسافة واحدة من كل عين. (C) اثنين من المرايا (M1 و M2) مع خطوط عمودية متعددة رسمها على السطوح لمساعدة عمودي حقن إبرة حقنة. (د) مثلث مع نقاط حقن، الهنديةATED من النجوم الزرقاء (-1.0 ± 0.06 ملم من bregma و 1.8 ± 0.1 مم sagittally) على كل الكرة الأرضية من الماوس. الأخضر السهم: بارافيلم، السهم الأحمر: bregma الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تأكيد Aβ حقن بواسطة Y-متاهة وتحليلات الدماغ

1. تقييم الذاكرة التي تعمل لدى الفئران المحقونة Aβ من قبل الاختبارات Y-متاهة ^3،7،8
   1. انتظر 3 أيام بعد الحقن لظهور العجز في الذاكرة.
   2. أداء الاختبارات Y-متاهة باستخدام متاهة بلاستيكية سوداء مع ثلاثة الأسلحة متطابقة المسمى A، B، و C، ولكل منها فروع خارج على 120 درجة زاوية من وسط المتاهة (العرض × الارتفاع × طول، 10 سم × 40 سم × 12 سم).
   3. ضع الماوس في بداية ذراع (الذراع أ) ويسمح هذا الموضوع لاستكشاف بحرية المتاهة لمدة 8 دقائق.
   4. قياس عدد الإدخالات في كل ذراع وحساب alternمعدل أوجه كل موضوع ^3،9.
2. دراسة مباشرة العقول بعد الوفاة لمعرفة ما اذا كان يستهدف حقن المنطقة ICV بشكل مناسب.
   1. تخدير الماوس عن طريق نفس الإجراء على النحو المبين في القسم 4.1. ثم التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
   2. قطع رأس الماوس وإزالة الجلد لفضح الجمجمة باستخدام مقص جراحي. إزالة أنسجة وعضلات من الجمجمة.
   3. إجراء تخفيضات على الدرز اللامي (بين جداري والعظام الجداريين) دون الإضرار الدماغ. إزالة القذالي والعظام الجداريين، ثم جداري والعظام الأمامية. إزالة العظام في الجمجمة باستخدام ملقط وعزل الدماغ من الجمجمة عن طريق رافعين السحايا.
   4. غسل الدماغ في ملحي معقم المبردة وقطع المنطقة ICV من الدماغ في اتجاه الاكليلية بسكين الجراحة (الشكل 2).
   5. تأكيد المنطقة حقن استنادا إلى أثر للإبرة علىأنسجة المخ (الشكل 2). تحقق مما إذا كان أثر إبرة وصلت واحدة من البطينين. إذا لم تتبع إبرة تلبي أو تمر من خلال البطينين، واستبعاد بيانات هذا الموضوع من تحليل النتائج التجريبية.

النتائج

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها عن طريق تأكيد Aβ تجميع وتقييم Y-متاهة من العجز في الذاكرة. باستخدام كامل طول Aβ كانت تنتج (1-42) الببتيد من 42 الأحماض الأمينية، وخليط من مونومرات Aβ، الأوليغومرات، والألياف (الشكل 3). من خلال ...

Discussion

أهم خطوة في هذا البروتوكول هو حقن ICV من Aβ. تم تصميم هذا البروتوكول لحقن Aβ في المنطقة ICV من الفئران بدون الات المجسم ^11،12. قبل بدء التجربة، يجب أن فترة أولية من الحقن الممارسة مع صبغة زرقاء بدلا من Aβ تتم لتحقيق البراعة الكافية. مباشرة بعد الحقن، فمن الضروري للتحقق ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 27~29 g of body weight
C57BL/6 mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 21~23 g of body weight
Amyloid-beta1-42	in house synthesis	n.a.	stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS
ICV injection syringe (26s gauge)	Hamilton	80308
Evans blue dye (EBD)	abcamBIochemicals	ab120869	1 % EBD in PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
Silver-Staining Kit	GE-Healthcare	17-1150-01