Normal Farelerde Amiloid-β Peptitler intraserebroventriküler enjeksiyon Akut Alzheimer gibi Bilişsel Açıkları tetikleyebilecek

Özet

Amiloid-β (Aβ) hayvan modeli tanımlanmış bir miktar ve Aβ parçalarının türlerinin yönetimini sağlayan ve her çalışma grubu içinde bireysel farklılıkları azaltır -injected. Bu protokol, normal farelerde Alzheimer-benzeri davranış bozukluğu üretimini sağlayan, stereotaktik araçlar olmaksızın Aβ intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu anlatılmaktadır.

Özet

Amyloid-β (Aβ) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of Aβ oligomers and plaques is observed. Such Aβ abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of Aβ levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of Aβ is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an Aβ-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the Aβ into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of Aβ. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of Aβ, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of Aβ abnormalities.

Giriş

Alzheimer hastalığı (AD) 'in bir patolojik özelliğidir amiloid-P (Aβ) göz önüne alındığında, AD, hayvan modellerinin geliştirilmesi Aβ nöral aşırı ekspresyonu üzerinde odaklanmıştır. Amiloid öncü proteinin (APP) veya presenilin (PS) mutasyonlar Aβ denge bozulmasına ve sonuçta ailesel AD ¹ patogenezinde yol, çünkü APP veya PS gen mutasyonlarını içeren fare modelleri genel olarak kabul edilmiştir. Transgenik farelerin geniş arasında prototip fare modelleri şunlardır: TG2576, PDAPP APP / PS1 ve APP23. Beyinde, bu fareler, genellikle Aβ agregasyonu ve sonunda senil plaklar gösterirler; plak oluşumu, öğrenme ve bellek davranış testleri düşük performans gösteren, bu önemli bir bilişsel bozulma takip eder. doğal insan AD patoloji taklit transgenik fareler kullanılarak nesil böylece di ilerlemesini izlemek için bize izin AD araştırma topluma katkıda bulunmuşturolgunun hastalığı. Bu Aβ plaklar geliştirmek için fareler ay sürer ve daha uzun Aβ kaynaklı sinaptik ve ruhsal bozukluk ^2,3 göstermek Ancak, transgenik fareler kullanılarak ekonomik değildir ve zaman alıcıdır. Başlangıçta transgenik fare modellerinin eksikliklerin üstesinden gelmek için alternatif olarak geliştirilen, transgenik olmayan modelleri de yaygın olarak farklı avantajlar nedeniyle kullanılır. AD gibi bilişsel bozukluklar, diğer kimyasal ve fiziksel tetiklenebilir ise patojen kaynaklı AD modeller vasıtasıyla-örneğin skopolamin olarak nörotoksik bileşiklerin enjeksiyonundan lezyonların indüksiyonu gibi, beyin içine Aβ direkt enjeksiyonu ile üretilebilir böyle hipokampus, ya da kortikal hasar ⁴ ile biliş ilgili alanlarda. Ancak, kognitif bozukluk olmayan patojenik indüksiyon doğru AD temel patofizyoloji yansıtmamaktadır; bunun yerine, sadece semptomatik sonuçlarını taklit eder. Buna karşılık, bir patojen kaynaklı AD modeli,46; -injected fare modeli, AD-benzeri davranış anormallikleri gösterebilir kalmayıp Aβ patoloji, ailesel ve sporadik AD tarafından paylaşılan ortak özelliği gösterebilir.

Beyin dokusunda Aβ plaklar görselleştirmek için zorluk rağmen, AD soruşturma için cazip kılan Aβ enjekte modelin en büyük avantajı kontrol edilebilirliği olduğunu. Araştırmacılar uyuşturucuyla ilgili çalışmalarda hatalı verilere yol açabilir fare modellerinde bireysel farklılıkları ayıklamak yapabilirsiniz. Zamanında ilaç tedavisi aday ilacın mekanizmasına bağlı olarak etkindir; hazırlamak için, Aβ agregasyon inhibitörü Aβ enjeksiyonundan önce uygulanabilir. Ayrıca, araştırmacılar diğer faktörler sıkıca bireysel farklılıklar da dahil olmak üzere, kontrol edilir, çünkü Aβ enjeksiyonundan sonra ortaya çıkan patojenik dönüşüm Aβ maruz türetilmiştir varsayabiliriz.

h Bu protokol, canlı açıklamakumaşla sunulmuştur stereotaktik enstrümanların olmadan Aβ intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyon yoluyla normal farelerde bir AD-benzeri fenotipi teşvik. Beyin dokusu ekleme-provoke hasarı en aza indirmek yapısal hasar ve lezyon kaynaklı inflamasyon olasılığını önlemek için şarttır. fare kullanımı tecrübeli eksikliği beklenmedik bir nöronal yaralanmaya yol açar. Ayrıca, enjeksiyon sırasında elde edilecek uygun açı ve derinlik sağlayacak teknikleri sık sık hatalar aşmak için özellikle önemlidir. ICV enjeksiyonundan ayrıntılı, canlı bir açıklama ile birlikte, aşağıdaki protokol ile üretilen modelin güvenilirliği, aşağıdaki bölümlerde açıklanmaktadır. Aşağıdaki protokol böylece sonuçta AD toplum için anlamlı bir keşif yol açabilecek bir Steppingstone sağlayarak, AD araştırmaya katkıda güvenilir ve kolay anlaşılır bir araç olabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri (1978 revize NIH Yayınları No. 8023) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre yürütülen ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile yapıldı KIST (Seul, Kore).

1. Hayvan hazırlanması

1. 7 haftalık erkek ICR farelere (veya C57BL / 6) bir grup hazırlayın.
2. Fareler homeostazı geri taşıma sonra 3-7 gün boyunca aklimasyonundan sürecinde gidelim. Genel olarak, her bir kafeste 4-5 fareden oluşan bir gruba yer ve 12/12 saat ışık / karanlık döngüsü ile, 22-23 ° C ve% 40 nemde onları korumak. Su ve gıda ad libitum sağlamak.
   aklimasyonundan sürecinin yeni konut, gıda, su nakliye ve adaptasyon stres kurtarma izin için kritik öneme sahiptir ve yeni bir kafes ve ışık döngüsü yanı sıra koku Not:. Bu deneyde, fareler, Spe bulunan tek tek havalandırma kafesler (IVCs) yerleştirildireli Patojen Free (SPF) filtreler içten tesisi
3. Her fare tartılır ve kimin ağırlığı ortalama ±% 10 sapma konuları hariç.
4. iki gruba konu bölün: araca uygulanan grup (Aβ (-)) ve Aβ-uygulanan grup (Aβ (+)). Deney, belirli bir ilaç adayı etkinliğini test etmek için ise, dört gruba fareler bölme (1) Aβ (-) / ilaç (-), (2) Aβ (-) / ilaç, (+) (3) Aβ (+) / ilaç (-), ve (4) Aβ (+) / ilaç (+).

2. Aβ Peptid hazırlanması

1. Önceden soğutulmuş 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP) herhangi bir agrega çözülür ve ⁶ homojen peptidler yapmak için olan kimyasal sentez ⁵ üzerinden ya da ticari kaynaklardan elde edilen Aβ peptidi, tedavi .
   1. (Oda sıcaklığında), 5 dakika, yavaşça girdap için bir su banyosu sonikatör Aβ / HFIP çözeltisi sonikasyon ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözeltiden inkübe edin. Tamamen azot ile buharlaştırma yoluyla HFIP kaldırve kullanılana kadar -80 ° C'de homojen Aβ saklayın.
2. Aβ monomerler hazırlayın: (. 100 uM Aβ,% 10 DMSO,% 90 PBS) 1 mM Aβ dimetilsülfoksit (DMSO) stok yapmak ve seyreltik 10 kat fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde
3. Aβ oligomerleri hazırlayın.
   1. sırasıyla, 3 veya 7 gün süre ile 37 ° C 'de (aşama 2.2.) (Aβ (1-42) ya da Aβ (1-40) ihtiva eder) Aβ monomer çözeltisi inkübe edin.
   2. Kuluçka süresi boyunca suyun buharlaşmasını önlemek için nemlendirilmiş bir ortam sağlamak için, bir ıslak kağıt havlu ihtiva eden bir fermuarlı torba içinde sızdırmaz kılınmış bir tüp içinde Aβ çözeltisi yerleştirin.
4. Modifiye edilmemiş proteinlerin ⁶ foto indüklemeli çapraz bağlantıları olan sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile hazırlanan Aβ oligomerleri teyit edin.
5. Araç ICV enjeksiyonundan 10% DMSO içeren kontrol PBS çözeltisi hazırlayın.

3. Şırınga Hazırlama

1. ICV enjeksiyon için 26 G, paslanmaz çelik bir iğne ile mikroenjektör hazırlayın.
2. cerrahi işlem için kullanılacak olan tüm diğer aparatı ile otoklav içinde şırınga sterilize edin. Otoklav sonra 20 dakika boyunca UV ışığı altında aparatı yerleştirin.
3. Beyin (Şekil 1A) içine enjeksiyon derinliği maksimum doğruluk sağlamak için 3.8 mm, uzunluğunu ayarlamak Parafilm ile mikroşırınga iğne sarın. (B6 fareler için 3.6 mm şırınga iğnesi ayarlayın).
   Not: Parafilm Sıkıştırma 3,6 mm ventral aşan enjeksiyon derinliği yol açacaktır. İğne yerleştirme sırasında sıkıştırılmış olmaktan Parafilm önlemek için, yoğun iğne birden çok kez sarın.
4. iki kez% 70 etanol ile şırınganın iç alanı yıkayın.
5. Oda sıcaklığında 30 dakika için bir su banyosu sonikatör şırınga ve iğne sonikasyon.
6. iki kez% 70 etanol ile şırınganın iç alanı yıkayın.
7. şırıngayı çalkalayınDamıtılmış su ve daha uzun bir süre, 30 dakika boyunca bir çeker ocak içinde tamamen kurutun. Aβ enjeksiyon başlamadan önce 20 dakika boyunca UV ışığı altında temiz bir şırınga bırakın.

4. Aβ enjekte Fare Modeli Hazırlama

Not: steril koşullar korumak ve% 70 etanol ve UV maruziyeti ile ICV enjeksiyon için tüm cerrahi aletler sterilize etmek için bir dezenfektan ile çalışma alanını temizleyin.

1. ksilazin (20 mg / kg) ve tiletamin bir karışımın peritoneal içi enjekte ile fare anestezisi HCI / zolazepam · ICV enjeksiyonundan önce, HCI (80 mg / kg). anestezi sırasında vücut ısısını korumak ve ayak tutam tepkisini değerlendirerek yeterli anestezi onaylamak için sıcak bir minder üzerinde fare yerleştirin.
2. Uygulama, steril PBS prosedür (Şekil 1B) içinde kornea kurumasını önlemek için her iki göze düşer.
3. difficu durumunda yüzeylerinde birden düz dikey çizgiler çizerek iki aynalar hazırlayınlty dik şırınga enjekte.
4. hemen yanındaki fare gövdesine ve diğer (M2) başın önünde bir ayna (M1) yerleştirin. Farenin iki göz arasındaki hayali orta hatta M1 paralel tutun ve iki uçak 90 ° açı (Şekil 1C) oluşturmak, böylece M1 dik M2 düzenlemek. Araştırmacı sağ elini ise farenin sol tarafındaki M1 yerleştirin. Araştırmacı solak ise farenin sağ tarafında M1 yerleştirin.
5. Farenin alnının ortasına üzerine% 70 etanol sprey ve kuru pamuklu ovalayın. alkolün buharlaşması için vücut ısısının düşürülmesi önlemek için alnına bir alanda çok büyük ıslatmayın.
6. Temiz bir pamuklu çubuklarla kullanarak% 2 klorheksidin solüsyonu ile alnına aynı alanı silin. üç kez, her biri toplam alkol ve kloroheksidinler tekrarlayın scrubbings.
   Gerekirse Possi en aza indirmek için fare alnına saç tıraş Not:kirlenme lük
7. bregma bulun.
   1. başparmak ve işaret parmağı kullanarak, sıkı, alnın cilt basılı doğrudan her iki gözde çıkıntı dereceye kadar iki gözü üstünde. gergin alnını yapmak ve deri altında kafatası hareketlerini en aza indirmek için geri cilt sürükleyin.
   2. Üç köşe atayarak görünmez bir üçgen oluşturur: farenin iki gözü ve nokta nerede başparmak ve işaret parmağı buluştuğu, Bregma. (Şekil 1B, Kırmızı ok: Bregma)
8. Bregma -1.0 ± 0.06 mm posterior derinlemesine sagital sütür yanal ± 0.1 mm 1.8 ve 2.4 mm (Şekil 1D, mavi yıldız: enjeksiyon noktaları her yarımkürede) ölçüm bandı ile enjeksiyon noktası bulun. (B6 fareler için: -0.9 mm arka derinlemesine 1.7 mm lateral ve 2,2 mm)
9. kaza ile hava enjeksiyon önlemek için fazla çözelti 10 ul Aβ çözeltisi veya araç ile şırınga doldurun.
10. th şırıngae enjeksiyon noktası (protokolde 4.7 anlatılmıştır). enjeksiyon noktasında düzlemine dik şırınga sağlayın. Hizala sabit bir bakış açısı (Şekil 1C) den aynalar çizilen çizgilerle hem aynalarda şırınganın görüntüleri yansıtıyordu.
11. parafilm sarma cildi ulaşıncaya kadar iğneyi batırmak başlayın.
12. elinizle tutarak şırınga tutun ve duraklamadan yavaşça sn üzerinde 5, Aβ solüsyonu veya aracın 5 ul enjekte etmek için diğer elinizi kullanın. Şırınga boyunca dik olduğundan emin olun. enjeksiyon tamamladıktan sonra, difüzyon için şırıngayı çıkarmadan önce 3 sn 5 bekleyin.
13. Orijinal üçgen görev üstlenen herhangi bir gereksiz hareketlerden kafatası korumak için orta baskı. eğmeden şırıngayı çıkartın.
14. kurtarma için sıcak yastığı Aβ enjekte fare koyun ve sternum yatma korumak. o bilinç kavuşur kadar sahipsiz fare bırakmayın ve m dönüş yokTamamen iyileşene kadar cerrahi olmayan fareler içeren bir kafes ouse.
15. adım 3.3-3.6 göre olan şırınga yıkayın.
16. Ameliyat sonrası dönemde farelerin hareketliliğini izlemek ve 5-7 gün farelerde enfeksiyon veya hastalık herhangi bir işaret olup olmadığını kontrol edin.

ICV bölgeye Şekil 1. Aβ enjeksiyon (A) değiştirilmemiş bir şırınga iğnesi ile karşılaştırıldığında Parafilm sarılmış şırınga iğnesi.; (B) PBS kuruluğunu önlemek için gözlerin üzerine düşer; başparmak, işaret parmağı ile fare alnına oluşan üçgen ve farenin iki gözü yanı sıra her bir gözün eşit uzaklıkta hayali orta hat; (C) şırınga iğnesi enjekte dik yardımcı olmak için yüzeylere çizilen birden dikey çizgilerle iki ayna (M1 ve M2); (D) enjeksiyon noktaları ile üçgen, indicated mavi yıldız (bregmadan -1.0 ± 0.06 mm ve sagittally 1.8 ± 0.1 mm) fare her yarımkürede; Yeşil ok: parafilm, Kırmızı ok: Bregma bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Y-labirent ve Beyin Analiz tarafından Aβ Enjeksiyonu 5. Onay

1. Y-labirent testlerinde ^3,7,8 tarafından Aβ-enjekte edilen farelerin çalışma belleği değerlendirmek
   1. Bellek açıklarının başlangıcı için enjeksiyondan sonra 3 gün bekleyin.
   2. üç özdeş silah ile bir siyah plastik labirent kullanılarak Y-labirent testleri gerçekleştirmek etiketli A, B, ve C, her labirentin merkezine 120 ° açıyla hangi dalları dışında (genişlik x uzunluk x yükseklik, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
   3. başlangıç ​​kolu (kol A) bir fare koyun ve konu serbestçe 8 dakika labirent keşfetmek için izin verir.
   4. Her kolun içine girişlerinin sayısını ölçmek ve Altern hesaplamakher konunun ^3,9 arasında tirme oranı.
2. Doğrudan enjeksiyon uygun ICV bölgesini hedef olmadığını kontrol etmek için postmortem beyin inceleyin.
   1. Bölüm 4.1'de tarif edilen aynı prosedür ile fare anestezisi. Sonra servikal dislokasyon ile fare kurban.
   2. fare başını kesmek ve cerrahi makas kullanarak kafatası açığa cilt kaldırmak. Kafatası dokuları ve kasları çıkarın.
   3. Beyni zarar vermeden (parietal ve interparietal kemikler arasında) sutura lambdoidea'nın üzerinde kesim yapmak. oksipital ve interparietal kemikleri, daha sonra parietal ve frontal kemiklerin çıkarın. forseps kullanarak kranial kemik çıkarın ve meninksler kaldırarak kafatası beyin izole eder.
   4. Soğutulmuş steril tuzlu su içinde beyin yıkayıp cerrahi bıçak (Şekil 2), koronal yönde beyin ICV bölge kesin.
   5. İğne ekleme izi dayalı enjeksiyon bölgesini onaylamakBeyin dokusu (Şekil 2). İğne iz ventriküllerin biri ulaşmıştır olmadığını kontrol edin. iğne izi karşılamak veya ventriküllerin geçmez ise, deney sonuçlarının analizi o kişinin verileri hariç.

Sonuçlar

Bu bölüm, Aβ agregasyon ve hafıza noksanlıkları Y-labirenti değerlendirme teyidi elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Tam uzunlukta Aβ kullanılarak 42 amino asit, Aβ monomerler, oligomerler karışımı ve fibrillerinin (Şekil 3) (1-42) peptidi üretilmiştir. HFIP kaynaklı monomerization adım sayesinde nispeten homojen monomerler (Lane B) ürün elde edilmiştir. 7 gün kuluçkalamadan sonra, Aβ agrega (hat c), çeşitli boyutlarda...

Tartışmalar

Bu protokolde en önemli adım Aβ ve ICV enjeksiyonu olduğunu. Bu protokol, stereotaktik araçlar ^11,12 olmayan farelerin ICV bölgesine Aβ enjekte etmek için dizayn edilmiştir. Bir deney başlamadan önce, yerine Aβ bir mavi boya ile uygulama enjeksiyonu ön sürenin yeterli maharet elde etmek için yer almalıdır. Enjeksiyondan hemen sonra, pigment enjeksiyonu düzgün gerçekleştirildi olup olmadığını kontrol etmek gerekir. Dikkatle beyin çıkarmak ve uygun bölge mavi boyalı olup olmadığı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 27~29 g of body weight
C57BL/6 mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 21~23 g of body weight
Amyloid-beta1-42	in house synthesis	n.a.	stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS
ICV injection syringe (26s gauge)	Hamilton	80308
Evans blue dye (EBD)	abcamBIochemicals	ab120869	1 % EBD in PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
Silver-Staining Kit	GE-Healthcare	17-1150-01