Интрацеребровентрикулярное инъекция амилоид-бета пептидов у нормальных мышей с болезнью Альцгеймера Остро индуцируют подобные когнитивные дефициты

Резюме

Амилоида-β (Ар) -injected животная модель делает возможным введение определенного количества и видов A & beta фрагментов и уменьшает индивидуальные различия внутри каждой исследуемой группе. Этот протокол описывает интрацеребровентрикулярное (ICV) инъекции А без стереотаксической инструментов, что позволяет производство болезни Альцгеймера-подобных поведенческих нарушений у нормальных мышей.

Аннотация

Amyloid-β (Aβ) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of Aβ oligomers and plaques is observed. Such Aβ abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of Aβ levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of Aβ is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an Aβ-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the Aβ into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of Aβ. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of Aβ, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of Aβ abnormalities.

Введение

Учитывая, что амилоид-бета (Ар) является патологическим признаком болезни Альцгеймера (AD), разработка моделей AD животных была сосредоточена на нервной оверэкспрессии A & beta. Поскольку мутации в амилоидного белка - предшественника (АРР) или пресенилина (PS) приводят к нарушению равновесия Ар и в конечном счете к патогенез семейной AD ^1, мышиные модели с участием APP или PS мутации гена были общепринятыми. Среди широкого спектра трансгенных мышей, прототипами мышиные модели включают в себя следующее: TG2576, PDAPP, APP / PS1 и APP23. В головном мозге у таких мышей обычно имеют агрегации и Ар в конечном итоге старческих бляшек; формирование бляшек сопровождается значительным когнитивных нарушений, таких, что они показывают низкую эффективность в поведенческих тестах обучения и памяти. Поколение с использованием трансгенных мышей, которые естественным образом имитировать патологии человека AD, таким образом, способствовал исследованию AD общества, что позволяет нам контролировать прогрессирование диСиз. Тем не менее, с использованием трансгенных мышей , неэкономично и требует много времени , поскольку она занимает месяцы для мышей развивать A & beta ; бляшками и даже больше , чтобы показать , Ар-индуцированной Synaptic или поведенческие отклонения ^2,3. Первоначально разработан как альтернатива для преодоления недостатков трансгенных мышиных моделей, нетрансгенные модели также широко используются из-за их различных преимуществ. Модели патоген-индуцированной AD может быть получен путем прямой инъекции A & beta; в мозг, в то время как AD-как когнитивные нарушения также могут быть вызваны другими химическими и физическими средствами, такими как инъекции нейротоксических соединений, таких как скополамин, индукции очагов поражения в познании , связанных с таких областях, как гиппокамп, либо коркового повреждения ^4. Тем не менее, не патогенны индукция когнитивных нарушений не точно отражает фундаментальную патофизиологии нашей эры; вместо этого, он имитирует только его симптоматические результаты. В отличие от этого, модель А. Д. патоген-индуцированной, А46; -injected модель мыши, может не только показать AD-подобные поведенческие отклонения, но также может демонстрировать, Ар патологию общий признак разделяемое семейного и спорадического нашей эры.

Несмотря на трудности, чтобы визуализировать Ар бляшек в тканях мозга, самое большое преимущество Ар-впрыскивается модель, которая делает его привлекательным для исследования АД является его управляемость. Исследователи могут отсеять индивидуальные различия в моделях мыши, которые могут привести к ошибочным данным в исследованиях, связанных с наркотиками. Своевременное медикаментозное лечение включается в зависимости от механизма кандидата препарата; разработать, ингибитор агрегации Ар может быть применен до инъекции А. Кроме того, исследователи могут предположить, что патогенный преобразование, которое возникает после того, как Ар инъекции происходит от воздействия, так как Ар другие факторы, жестко контролируются, в том числе индивидуальные различия.

В этом протоколе, яркое описание часоввл индуцировать AD-подобный фенотип у нормальных мышей через A & beta; интрацеребровентрикул (ICV) инъекции без стереотаксической инструментов представлена. Сведение к минимуму вносимые спровоцированного повреждения ткани мозга имеет важное значение для предотвращения возможности структурного повреждения и поражения индуцированных воспалением. Отсутствие навыка в обращении мыши приводит к неожиданным нейроповреждения. Кроме того, методы, обеспечивающие соответствующий угол и глубину, чтобы достичь в процессе инъекции, особенно важны для обхода частых ошибок. В дополнение к детальным, яркое объяснение инъекции ICV, надежность модели, рассчитанной по следующим протоколом также может быть проиллюстрирована в следующих разделах. Следующий протокол может быть надежным и легко понять инструмент, который вносит свой вклад в исследования AD, тем самым обеспечивая ступенькой, что в конечном счете может привести к значимому открытию для AD общества.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (NIH публикации N 8023, пересмотренный 1978), а также с животными по уходу и использованию комитета Institutional животных по уходу и использованию комитета KIST (Сеул, Корея).

1. Подготовка животных

1. Подготовьте группу 7-недельных самцов мышей ICR (или C57BL / 6).
2. Пусть мыши пройти через процесс акклиматизации в течение 3-7 дней после транспортировки, чтобы восстановить гомеостаз. В общем, поместить группу 4-5 мышей в каждой клетке и поддерживать их при температуре 22-23 ° C и 40% влажности, с 12/12 ч цикле свет / темнота. Обеспечение водой и продуктами питания в неограниченном количестве .
   Примечание: Процесс акклиматизации имеет решающее значение для обеспечения восстановления от стресса судоходства и адаптации к новым жильем, продовольствием, водой, и запах, а также новую клетку и световой цикл. В этом эксперименте мышей были размещены в индивидуальном Вентилируемые Клеток (ВАХ), расположенный в SpeВозбудитель специфичны Free (SPF) -grade объект
3. Взвешивание каждой мыши и исключить предметы, вес которых отклоняется на ± 10% от среднего значения.
4. Разделите предметы на две группы: на транспортном средстве вводили группу (A (-)) и A & beta; инъецированных группа (A & beta; (+)). Если эксперимент для проверки эффективности конкретного кандидата наркотиков, разделить мышей на четыре группы: (1) A (-) / лекарственное средство (-), (2) A (-) / лекарственное средство (+), (3) A & beta; (+) / лекарство (-), и (4) A & beta; (+) / лекарство (+).

2. Пептид A & beta; Получение

1. Treat пептиды A & beta ; , полученные путем химического синтеза ⁵ или из коммерческих источников, с предварительно охлажденным 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP) растворять любые агрегаты и сделать пептиды гомогенные ⁶ ,
   1. Разрушать ультразвуком решение A & beta; / ГФИП в водяной бане ультразвуковом в течение 5 мин (при комнатной температуре), осторожно вихре, и инкубировать раствор в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите ГФИС полностью за счет испарения с азотоми не хранить гомогенного A & beta при -80 ° С до использования.
2. Готовят мономеры A & beta; (. 100 мкМ Ар, 10% ДМСО, 90% PBS), делают 1 мМ A & beta; диметилсульфоксид (ДМСО), и запас разбавить его в 10 раз в фосфатном буферном растворе (PBS)
3. Подготовка A & beta; олигомеры.
   1. Выдержите раствор мономера A (содержащий A & beta (1-42) или A (1-40)) (этап 2.2.) При 37 ° С в течение 3 или 7 дней, соответственно.
   2. Поместите раствор Ар в запаянной трубке в молнии мешок, содержащий влажное бумажное полотенце, чтобы обеспечить во влажной среде, чтобы предотвратить испарение воды в течение инкубационного периода.
4. Подтвердить подготовленные олигомеров A & beta ; посредством электрофореза в додецилсульфата натрия сульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с фотоинициированного сшиванию немодифицированных белков ^6.
5. Подготовка контрольного раствора PBS, содержащего 10% ДМСО для инъекций транспортного средства ICV.

3. Шприц Подготовка

1. Приготовьте микрошприца с 26 G из нержавеющей стали иглы для ICV инъекцией.
2. Стерилизация в автоклаве шприц со всеми другими устройствами, которые будут использоваться для хирургической процедуры. После того, как автоклав, поместите аппарат под УФ-светом в течение 20 мин.
3. Обертка иглу микрошприцом парапленкой для регулировки его длины до 3,8 мм , с тем чтобы с максимальной точностью в глубине инъекции в мозг (рисунок 1А). (Для мышей В6, отрегулировать иглу шприца до 3,6 мм).
   Примечание: Сжатие Parafilm приведет к глубине, превышающей 3,6 инъекции мм вентрально. Для того, чтобы предотвратить парафином от сжатия во время ввода иглы, плотно завернуть иглу несколько раз.
4. Вымойте внутреннее пространство шприца с 70% этанолом, дважды.
5. Разрушать ультразвуком шприц и иглу в водяной бане ультразвуковом в течение 30 мин при комнатной температуре.
6. Вымойте внутреннее пространство шприца с 70% этанолом, дважды.
7. Промойте шприцс дистиллированной водой и высушить его полностью в вытяжном шкафу в течение более 30 мин. Оставьте чистый шприц под УФ-светом в течение 20 мин перед началом инъекции А.

4. Ар-впрыскивается мышь Модель Приготовление

Примечание: Очистите операционное поле с дезинфицирующим средством для поддержания стерильных условий и стерилизации всех хирургических инструментов для ICV инъекции с использованием 70% этанола и УФ-облучения.

1. Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции смеси ксилазином (20 мг / кг) и tiletamine & bull; HCl / zolazepam & bull; HCl (80 мг / кг) до инъекции ICV. Поместите курсор на теплый коврик для поддержания ее температуры тела в то время как под наркозом и подтвердить адекватную анестезию путем оценки ответа футов пинч.
2. Применить стерильный PBS , капли в оба глаза , чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры (Фиг.1В).
3. Подготовьте два зеркала, нарисовав несколько прямых вертикальных линий на их поверхности в случае difficuLTY инъекционного шприца перпендикулярно.
4. Поместите одно зеркало (M1) в непосредственной близости от тела мыши, а другой (M2) в передней части головы. Keep M1 параллельно воображаемой средней линии между двумя глазами мыши и расположить M2 перпендикулярно M1, так что обе плоскости образуют угол 90 ° (фиг.1С). Поместите M1 на левой стороне мыши, если исследователь является правой рукой. Поместите M1 на правой стороне мыши, если исследователь левша.
5. Спрей 70% этанола на середину лба мыши и протереть сухим ватным тампоном. Не мокрой слишком большой площади лба, чтобы избежать снижения температуры тела из-за испарения спирта.
6. Протрите ту же область на лбу с 2% -ным раствором хлоргексидина, используя чистую ватные тампоны. Повторные scrubbings спиртом и хлоргексидина для общей сложности три раза каждый.
   Примечание: При необходимости, бреют волосы на лбу мыши для того, чтобы свести к минимуму возность загрязнения
7. Найдите брегмы.
   1. Используя большой и указательный палец, плотно удерживая кожу лба, прямо над двумя глазами в той степени, что оба глаза торчат. Перетащите кожу назад, чтобы сделать лоб тугой и свести к минимуму движения черепа под кожей.
   2. Форма невидимый треугольник, назначив три вершины: два глаза мыши и точки, где большой и указательный палец встречаются, брегма. (Цифры 1B, Красная стрелка: брегма)
8. Найдите точку впрыска с рулеткой: -1,0 ± 0,06 мм кзади от темени, 1,8 ± 0,1 мм сбоку от стреловидного шва и 2,4 мм в глубину (рис 1D, голубых звезд: точек впрыска в каждом полушарии). (Для мышей В6: -0,9 мм задние, боковые 1,7 мм и 2,2 мм в глубину)
9. Наполните шприц 10 мкл раствора или транспортного средства Ар с избытком раствора, с тем, чтобы избежать случайного нагнетания воздуха.
10. Поместите шприц в готочка е инъекции (описанный в протоколе 4.7). Сделать шприц перпендикулярно к плоскости точки инжекции. Align отражение изображения шприца в обоих зеркал с нарисованными линиями на зеркалах с фиксированной точки (рис 1C).
11. Начинают введение иглы до тех пор, парафильмом обертывание не достигает кожи.
12. Держите руки держа шприц устойчивый и использовать другую руку, чтобы ввести 5 мкл раствора Ар или транспортного средства, медленно, в течение 5 сек, без паузы. Убедитесь, что шприц остается перпендикулярным повсюду. После завершения инъекции, подождите 3 до 5 секунд перед снятием шприца для диффузии.
13. Если предположить, что исходное положение треугольника, оказывают умеренное давление, чтобы защитить череп от любых ненужных движений. Удалите шприц без наклона.
14. Поместите Ар-впрыскивается мышь на теплую площадку для восстановления и поддержания его грудины лежачее. Не оставляйте без присмотра мышь, пока он не приходит в сознание и не возвращают мOuse к клетке, содержащей нехирургических мышей до тех пор, пока полностью восстановилась.
15. Промойте шприц в соответствии с этапами 3,3-3,6.
16. Послеоперационно контролировать подвижность мышей и проверить наличие каких-либо признаков инфекции или болезни у мышей в течение 5-7 дней.

Рисунок 1. A & beta ; Инъекции в область ICV (A) парафильмом обернутая игла шприца по сравнению с неизмененной иглой шприца. (B) PBS падает на глаза , чтобы предотвратить сухость; треугольник, образованный на лбу мыши с большим пальцем, указательный палец, а два глаза мыши, а также мнимое по средней линии на равном расстоянии от каждого глаза; (C) два зеркала (M1 и M2) с несколькими вертикальными линиями , проходящими на поверхности , чтобы помочь перпендикулярна инъекции иглы шприца; (D) треугольник с точками впрыска, Indicованные, как голубые звезды (-1,0 ± 0,06 мм от темени и 1,8 ± 0,1 мм сагиттальной) на каждом полушарии мыши; Зеленая стрелка: парафильмом, Красная стрелка: брегма Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. Подтверждение Ар инъекций по Y-лабиринте и мозга Анализы

1. Оценить рабочую память A & beta-мышей , инъецированных с помощью тестов Y-лабиринте ^3,7,8
   1. Подождите, через 3 дня после инъекции для возникновения дефицита памяти.
   2. Выполните тесты Y-образном лабиринте с помощью черной пластиковой лабиринт с тремя одинаковыми руками меченый А, В, и С, каждый из которых разветвляется на 120 ° углом от центра лабиринта (ширина х длина х высота 10 см х 40 см х 12 см).
   3. Поместите курсор в начале руки (рука A) и позволяют субъект свободно исследовать лабиринт в течение 8 минут.
   4. Измерьте количество записей в каждой руке и вычислить чередующеесяСкорость данию каждого субъекта ^3,9.
2. Непосредственно исследовать посмертных мозги, чтобы проверить, если инъекции ориентирована на ICV регион соответствующим образом.
   1. Обезболить мышью по той же методике, как описано в разделе 4.1. Затем жертву мышь путем смещения шейных позвонков.
   2. Обезглавьте мыши и снимите кожу, чтобы подвергать черепа с помощью хирургических ножниц. Удалить ткани и мышцы от черепа.
   3. Сделайте надрезы на ламбдовидного швом (между теменной и interparietal костей) без повреждения мозга. Удалить затылочной и interparietal кости, затем теменной и лобной кости. Удалите черепную кость с помощью пинцета и изолировать мозг от черепа, подняв мозговых оболочек.
   4. Промыть мозг в охлажденном стерильного физиологического раствора и сократить ICV область мозга в корональной направлении с хирургическим ножом (Рисунок 2).
   5. Подтвердите области инжекции, основанный на след вставки иглу наткани мозга (рисунок 2). Проверьте, если игла след достигла одного из желудочков. Если игла след не отвечает или проходят через желудочки, исключить данные этого субъекта из анализа результатов эксперимента.

Результаты

В этом разделе представлены примеры результатов, которые могут быть получены путем подтверждения агрегации и оценки Ар Y-лабиринте дефицита памяти. Используя всю длину Ар был произведен (1-42) пептид из 42 аминокислот, смеси мономеров A & beta ; , олигомеров и фибрилл (р...

Обсуждение

Наиболее важным шагом в этом протоколе является ICV инъекция A & beta. Этот протокол предназначен для введения A & beta в ICV области мышей без стереотаксической инструментов ^11,12. Перед началом эксперимента, предварительный период практики инъекций с синим красителем вместо A & beta; д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 27~29 g of body weight
C57BL/6 mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 21~23 g of body weight
Amyloid-beta1-42	in house synthesis	n.a.	stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS
ICV injection syringe (26s gauge)	Hamilton	80308
Evans blue dye (EBD)	abcamBIochemicals	ab120869	1 % EBD in PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
Silver-Staining Kit	GE-Healthcare	17-1150-01