الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور

Summary

توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة والإنتاجية العالية لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور التي تقوم على مستحلبات الماء في الزيت. علينا أن نبرهن فعالية الأسلوب في تجميع الكلوروفيل الأم مع أربعة أنواع من المؤتلف للذوبان في الماء، الكلوروفيل ملزم البروتينات (WSCPs) من النباتات الكرنب وأعرب في E. القولونية.

Abstract

الكلوروفيل (CHLS) ويخضور جرثومي (BChls) هي العوامل المساعدة الأولية التي تنفذ حصاد ضوء الضوئي ونقل الإلكترون. وظائفها يعتمد بشكل كبير على منظمة معينة في إطار مجمعات البروتين multisubunit الغشاء كبيرة ومعقدة. من أجل فهم على المستوى الجزيئي كيف تسهل هذه المجمعات تحويل الطاقة الشمسية، فمن الضروري أن نفهم البروتين الصباغ، والتفاعلات الصباغ الصباغ، وتأثيرها على ديناميات متحمس. طريقة واحدة لكسب هذا الفهم هو من خلال بناء ودراسة المجمعات من CHLS مع البروتينات المؤتلف بسيطة للذوبان في الماء. ومع ذلك، والذي يتضمن CHLS دهون وBChls إلى بروتينات قابلة للذوبان في الماء أمر صعب. وعلاوة على ذلك، ليس هناك طريقة عامة، والتي يمكن أن تستخدم لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور. هنا، علينا أن نظهر نظام الإنتاجية بسيط وارتفاع على أساس مستحلبات الماء في الزيت، والتي تمكن الحمارembly من البروتينات للذوبان في الماء مع CHLS مسعور. تم التحقق من صحة الطريقة الجديدة عن طريق تجميع الإصدارات المؤتلف من الكلوروفيل البروتين للذوبان في الماء ملزما من كرنبية النباتات (WSCP) مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع الناجح لكلوروفيل لاستخدام لست] الخام من WSCP معربا عن E. خلية كولاي، والتي يمكن استخدامها لتطوير نظام شاشة الجيني للبروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة للذوبان في الماء، وللدراسات التفاعلات كلوروفيل البروتين وعمليات التجميع.

Introduction

أصباغ مسعور مثل الكلوروفيل (CHLS)، يخضور جرثومي (BChls) والكاروتينات هي العوامل المساعدة الأولية في مراكز رد فعل الضوئي والبروتينات حصاد الخفيفة التي تنفذ نقل الإلكترون، والتقاط الطاقة الضوئية ونقلها. مراكز التفاعل ومعظم المجمعات حصاد ضوء ملزم كلوروفيل هي بروتينات الغشاء. البروتين Fenna-ماثيوز أولسون (FMO) من بكتيريا التمثيل الضوئي الأخضر الكبريت غير الاوكسجينية ^1،2، والبروتين peridinin-كلوروفيل (PCP) من دينوفلاجيليت ³ أمثلة استثنائية من المياه القابلة للذوبان البروتينات حصاد الضوء. الكلوروفيل ملزم البروتينات للذوبان في الماء (WSCPs) من كرنبية، بطباطية، سرمقية والنباتات قطيفية ^{4، 5} ومثال فريد آخر، ولكن في المقابل لFMO وحزب المؤتمر الشعبي، وهذه هي ليست متورطة في ضوء حصاد ولا في أي من رد فعل الضوئي الأساسي وفيز على وجه الدقةوظائف siological غير واضحة ^5-8 بعد. أدت بهم عالية تقارب ملزم كلوروفيل إلى وظيفة اقترح كحاملات عابرة من CHLS ومشتقاتها كلوروفيل ^9،10. بدلا من ذلك، كان الافتراض بأن WSCP يلعب دورا في مسح CHLS في الخلايا التالفة ويحمي ضد يسببها كلوروفيل-الضرر photooxidative ^7،11-13. وفي الآونة الأخيرة، اقترح أن ظائف WSCP كمانع البروتيني، ويلعب دورا خلال مقاومة عاشب كذلك ينظم موت الخلية أثناء التطور زهرة ^14. وتنقسم WSCPs إلى فئتين الرئيسية وفقا لخصائصها بالفوتونات. الدرجة الأولى (الصف الأول، على سبيل المثال. من سرمق أبيض) قد تخضع photoconversion على الإضاءة. الدرجة الثانية WSCPs من النباتات الكرنب، التي لا تخضع photoconversion ^5،10، وتنقسم الى مزيد من الدرجة الداخليين (على سبيل المثال، من OLERACEA الكرنب، Raphanus SATIVUS) وبنك الاستثمار الدولي (على سبيل المثال، من رشاد virginicum ). تم حل بنية الطبقة بنك الاستثمار الدولي WSCP من رشاد virginicum من البلورات بالأشعة السينية في دقة 2.0 Å ^8. أنه يكشف عن homotetramer متماثل التي مفارز البروتين تشكل نواة مسعور. كل فرعية تشد كلوروفيل واحد مما يؤدي الى ترتيب ضيق من أربعة CHLS معبأة بشكل وثيق داخل core.This بسيطة عن ترتيب كلوروفيل يجعل WSCPs نظام نموذجي يمكن أن تكون مفيدة لدراسة ملزمة وتجميع المجمعات كلوروفيل البروتين، وآثار CHLS المجاورة وبيئات البروتين على الخصائص الطيفية والإلكترونية للCHLS فرد. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن توفر نماذج لبناء البروتينات الاصطناعية ملزم كلوروفيل التي يمكن أن تستخدم لوحدات ضوء حصاد في أجهزة الضوئي الاصطناعي.

دراسات دقيقة من WSCPs مواطن ليست مجدية لأن المجمعات تنقيته من النباتات تحتوي دائما خليط غير متجانس من tetramers مع مجموعات مختلفة من كلوروفيل لوكلوروفيل ب ^9. وبالتالي، لا بد من طريقة لتجميع WSCPs أعرب recombinantly مع CHLS في المختبر. والتحدي الذي يواجه هذا من قبل لا يذكر المياه للذوبان من CHLS مما يجعل من المستحيل لتجميع المجمع في المختبر ببساطة عن طريق خلط apoproteins للذوبان في الماء مع أصباغ في المحاليل المائية. في المختبر التجمع عن طريق خلط apoproteins مع الأغشية الثايلاكويد وقد تجلى ^15، ولكن يقتصر هذا الأسلوب لالأصلي CHLS موجودة في ثايلاكويد. شميت وآخرون. تقارير عن تجميع عدة كلوروفيل وBChl المشتقات مع WSCP من القرنبيط (CaWSCP) بالإعراب عن recombinantly بروتين الموسومة الحامض الاميني في E. القولونية شل حركة وضعها على عمود ني تقارب وإدخال مشتقات شيلي بالفاعلات في المنظفات ^11. إعادة بنجاح من WSCPs المؤتلف من أ. thaliana ^6، وبراعم بروكسل (BoWSCP)، الفجل البري الياباني (RshWSCP) لوذكرت أيضا د فرجينيا pepperweed (LvWSCP) بطريقة مشابهة.

هنا، نقدم رواية، عام، طريقة مباشرة لتجميع CHLS مع WSCP التي لا تتطلب وضع علامات أو شل حركة البروتينات. وهي تعتمد على إعداد مستحلبات من المحاليل المائية على من apoproteins للذوبان في الماء في الزيوت المعدنية. وبالتالي مغلفة البروتينات في الماء في النفط (W / O) microdroplets مع سطح عالية جدا إلى نسبة حجم ^16. ثم يتم حله العوامل المساعدة مسعور في مجال النفط وأدخلت بسهولة إلى قطرات من مرحلة النفط. نحن تقريرا عن استخدام طريقة لتجميع من عدة أنواع من apoproteins WSCP أعرب recombinantly في E. القولونية مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع من المحللة الخام من البكتيريا overexpressing WSCP التي يمكن استخدامها كنظام فحص لتطوير البروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة.

Protocol

1. إعداد كلوروفيل والحلول المالية

1. خطوة حاسمة: تنفيذ جميع خطوات إعداد الكلوروفيل في غطاء الكيميائية، تحت الضوء الأخضر (520 نانومتر) أو في الظلام من أجل تقليل photodamage. دائما إضافة النيتروجين أو الأرجون قبل تجميد أصباغ للتخزين. التأكد من أن جميع المذيبات هي درجة التحليلي.
2. تزن حوالي 5 ملغ من خلايا سبيرولينا الفطور مجفف بالتجميد أو خلايا cyanobacterium أخرى تحتوي على كلوروفيل الوحيد لفي الأغشية الثايلاكويد وسحقها باستخدام هاون ومدقة.
3. تحميل خلايا سحق على عمود الزجاج ويغسل مع حوالي 50-100 مل من 100٪ الأسيتون لإزالة الكاروتينات. تجاهل البرتقال / جزء الأخضر مزال.
   ملاحظة: إذا لم يتم مزال جزء البرتقال مع 100 مل من الاسيتون تواصل غسل الخلايا مع الأسيتون حتى يبدأ جزء الأخضر للأزل.
4. صرف الأسيتون مع الميثانول بنسبة 100٪ وجمع جزء الأخضر التي تحتوي على كلوروفيل أ. حجم fract مزالأيون قد تختلف بين 50-100 مل. في البداية، جزء مزال لها لون الأخضر الداكن، والذي يتغير إلى الأخضر الشاحب في نهاية شطف. عندما يتحول لون جزء مزال إلى الأخضر الشاحب وقف شطف.
5. يتبخر الميثانول باستخدام المبخر الدوار حتى استخراج جاف تماما. لا تنطبق الحرارة إلى حل. تأكد من أن درجة حرارة حمام الماء المبخر لا تتجاوز 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: الساعة التبخر يعتمد على حجم جزء الميثانول التي تبخرت وقد تختلف بين 10-60 دقيقة. ومن المهم أن تجف استخراج تماما.
6. حل أصباغ من استخراج المجففة في كمية صغيرة من ايثر (حوالي 5-10 مل)، وتصفية من خلال القطن والصوف. تأكد من أن الصبغات يذوب تماما في الأثير قبل الترشيح.
7. تتبخر ايثر حتى أصباغ جافة تماما (10-30 دقيقة).
   ملاحظة: يمكن تطهير والأصباغ الجافة مع وأبقى تحت النيتروجين أو الأرجون في -20 درجة مئوية، في الظلام حتى مزيد من المعالجة.
8. حل الأصباغ الجافة في أصغر حجم ممكن من الميثانول بنسبة 100٪ (حوالي 1 مل)، حتى إذا علقت ليس كل شيء تماما. إضافة 4 مل من الأسيتون إلى الحل، ونفض الغبار الزجاج بلطف من أجل حل تماما أصباغ.
9. باستخدام ماصة باستور، تحميل عينة بلطف على عمود من DEAE سيفاروز معايرتها في 100٪ الأسيتون.
10. الكاروتينات أزل (فرقة البرتقالي والأصفر) مع 100٪ الأسيتون. ثم، أزل كلوروفيل ل(الفرقة الخضراء) مع 3: 1 ت / ت الأسيتون / الميثانول الخليط.
    ملاحظة: حجم الأسيتون وخليط الأسيتون / الميثانول ما يعادل تقريبا حجم DEAE سيفاروز تحميلها على العمود.
11. تحقق من كلوروفيل نقاء كتبها رقيقة اللوني طبقة باستخدام 68: 25: 5: 2 ثنائي كلورو ميثان / ن الهكسان / الأيسوبروبانول / الميثانول (ت / ت) خليط كما شاطف ^17.
12. تتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار حتى كلوروفيل وجافة تماما (10-60 دقيقة).
    ملاحظة: كلوروفيل الجاف ويمكن تطهير مع النيتروجين أو الأرجون وتخزينها في جو من الأرجون -20 درجة مئوية في الظلام.
13. إعداد كلوروفيل حل الأسهم عن طريق إعادة تذويب الجاف كلوروفيل لفي 2-4 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
    ملاحظة: معامل انقراض كلوروفيل لفي 663 نانومتر هي 74400 سم ^-1 م ^-1 (83.3 سم ^-1 (ملغ / مل) ^-1) في الإيثانول. يجب أن يكون هناك حل الأسهم نموذجي لOD من 1860 الموافق تركيز 25 ملم (23 ملغ / مل). إضافة 20 ميكرولتر من هذا المخزون إلى مستحلب تحتوي على 5 مل من المرحلة العضوية، و 1 ملغ من WSCP في 1 مل من نتائج المرحلة المائية في خليط مع 10 فائض الرحى أضعاف من كلوروفيل في مقابل WSCP.

2. إعداد المرحلة العضوية من مستحلب

ملاحظة: وتتكون المرحلة العضوية من مستحلب من الزيوت المعدنية التي تحتوي على 4.5٪ (ت / ت) سبان 80، و 0.4٪ (ت / ت) توين 80.

1. في وزن 50 مل أنبوب 0.2 غرام من تيوين 80، 1.8 غرام من سبان 80، و 38 غراما من الزيوت المعدنية. تخلط جيدا جميع المكونات ويبرد على الجليد.
   ملاحظة: يمكن تخزين المرحلة العضوية في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد.

3. إعداد المرحلة مائي من مستحلب

ملاحظة: قد تتكون المرحلة المائية من مستحلب إما WSCP تنقيته، أو استخراج النفط الخام من البكتيريا overexpressing WSCP.

1. إعداد المرحلة المائية التي تحتوي على WSCP تنقيته.
   1. تنمو البكتيريا القولونية BL21 التي تحتوي على البلازميد WSCP ¹² في 1 لتر من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية حتى OD من 0.3-0.6.
   2. حمل بروتين تعبير بإضافة 1 ملم IPTG. بعد تحريض نمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
   3. البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   4. حل بيليه في ملزمة العازلة ويصوتن على الجليد (30 ثانية في 15 ثانية من خمس مرات). استخدام 10 مل من العازلة لبيليه تم الحصول عليها من الطرد المركزي من 250 مل منمتوسطة LB مع الخلايا overexpressing البروتين.
      ملاحظة: اعتمادا على طريقة تنقية، قد تكون مؤلفة من العازلة ملزمة من 100 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2 أو 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي EDTA.
   5. تدور أسفل الخلايا المحللة في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   6. تنقية WSCP بواسطة اللوني تقارب. اعتمادا على العلامة تنصهر WSCP، تنقية البروتينات المؤتلف باستخدام المتاحة تجاريا نظام تقارب اللوني المناسب لتنقية البروتين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   7. لتحضير مستحلب، استخدم WSCP تنقيته في 50 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.8. تأكد من أن كمية البروتين النهائي تستخدم لإعادة هو 0،5-1،0 ملغ لكل 1 مل من العازلة.
2. إعداد المرحلة المائية التي تحتوي على البكتيريا المحللة الخام مع WSCP.
   1. زراعة خلايا القولونية BL21 تحتوي على WSCP، معربا عن البلازميد في 250 مل من LB المتوسطة عند 37 درجة مئوية حتى OD 0،3-0،6.
   2. حمل تعبير البروتين مع1 ملم IPTG وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
   3. الخلايا البكتيرية الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   4. حل بيليه في 1-2 مل من 50 ملي العازلة فوسفات الصوديوم الهيدروجيني 7.8، يصوتن (30 ثانية على، 15 ثانية قبالة، ثلاث مرات) وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   5. إعداد المرحلة المائية من مستحلب عن طريق خلط 0.125 مل من طاف مع 0.875 مل من 50 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 7.8.

4. جمعية WSCP مع كلوروفيل لفي مستحلب

1. نقل 5 مل من مزيج النفط بالسطح في قارورة زجاجية وتبريده على الجليد. قبل pipetting ل، تحقق من أن جميع مكونات المرحلة العضوية مختلطة تماما وليس هناك فصل بين مرحلة السطحي والزيوت المعدنية.
2. إضافة 1 مل من المرحلة المائية المثلج أعد كما في القسم 3-5 مل من المرحلة العضوية.
3. مزيج مرحلتي باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 2 دقيقة في 9500 دورة في الدقيقة على الجليد.
4. خطوة حاسمة: من هذه المرحلة على، أداء جميع خطوات أخرى تحت الضوء الأخضر (520 نانومتر) من أجل تقليل photodamage. إضافة 20 ميكرولتر من 25 ملي كلوروفيل حل الأوراق المالية (انظر القسم 1.13) إلى مستحلب. تفريق عبها وعكس القارورة الزجاجية. تأكد من أن كلوروفيل يتم توزيعها بالتساوي في مستحلب.
5. احتضان مستحلب لمدة 1-2 ساعة على الجليد في الظلام.
6. من أجل كسر مستحلب وقطرات الماء منفصلة عن المرحلة العضوية نقل مستحلب لأنابيب البلاستيك 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إذا كان التجمع ناجحا، يجب أن يكون المرحلة المائية السفلى خضراء اللون.
7. التخلص من مرحلة النفط العليا وإضافة 1 مل من الزيوت المعدنية. تخلط جيدا الزيوت المعدنية مع مستحلب مكعبات من دوامة أو عن طريق التقليب أنبوب دقيق. تدور باستمرار العينة في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة حتى هلالة واضحة تفصل بين مائي والتعدينيتم الحصول على مراحل النفط الله، دون أي مستحلب المتوسط.
8. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الكيميائية. بعد يتم فصل مراحل النفط المائية والمعدنية بشكل واضح، وإزالة الزيوت المعدنية وإضافة 1 مل من ايثر المشبعة بالمياه. دوامة وتدور باستمرار العينة في 14000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين.
9. بعد الطرد المركزي الثاني، وإزالة ايثر وترك الأنابيب مفتوحة ل5-20 دقيقة في غطاء محرك السيارة.
10. وأخيرا، تحميل المرحلة المائية التي تحتوي على WSCP / كلوروفيل مجمع على عمود تحلية وأزل مع العازلة المناسبة لمزيد من التجارب.
    ملاحظة: البروتين هو مستقر في مخازن الفوسفات وتريس في مجموعة واسعة من درجة الحموضة (6،0-7،5). ويمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء تصل إلى شهر واحد.

النتائج

تم تجميعها apoproteins WSCP المؤتلف مع كلوروفيل لفي W المستحلبات / O وفقا للبروتوكول وصفها في القسم السابق. تم تنفيذ بروتوكول باستخدام المراحل المائية التي تحتوي إما WSCPs نقية، أو لست] خلايا القولونية overexpressing WSCP (الشكل 1). بروتوكول بسيط و?...

Discussion

هدفنا هو تطوير نظام عام جديد لتجميع البروتينات للذوبان في الماء ملزم الكلوروفيل مع أصباغ مسعور. ومن هنا يظهر أن نظام إعادة جديد يقوم على W / O مستحلب هو النهج العام ثبت للعمل لتجميع apoproteins WSCP من براعم بروكسل والقنبيط والفجل الياباني وفرجينيا pepperweed أعرب recombinantly في E. ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification