油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

要約

この原稿は、油中水型エマルジョンに基づく疎水性顔料と水溶性タンパク質を組み立てるための単純かつ高スループットの方法が記載されています。私たちは、Eで表したアブラナ属植物の組換え水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs）の4種類でネイティブクロロフィルの組み立て方法の有効性を実証します大腸菌 。

要約

クロロフィル（Chl類）およびバクテリオ（Bchl類）は光合成集光と電子輸送を行う主要な補因子です。これらの機能は、批判的に大規模と精巧なマルチサブユニット膜貫通タンパク質複合体内での特定の組織に依存します。これらの複合体は、太陽エネルギーの変換を促進する方法を分子レベルで理解するためには、蛋白質顔料、および顔料色素相互作用、励起ダイナミクスへの影響を理解することが不可欠です。このような理解を得る一つの方法は、単純な水溶性組換えタンパク質とChl類の複合体を構築し、研究することによってです。しかし、水溶性タンパク質に親油性Chl類及びBchl類を組み込むことは困難です。また、疎水性の顔料と水溶性タンパク質のアセンブリのために使用することができない一般的な方法は存在しません。ここでは、お尻を可能にする、油中水型エマルジョンに基づく単純かつ高スループットのシステムを示します疎水性のChl類と水溶性タンパク質のembly。新しい方法は、クロロフィルとアブラナ科植物 （WSCP）の水溶性クロロフィル結合タンパク質の組換え型を組み立てることによって検証されました。私たちは、クロロフィルの成功アセンブリをE.を表現WSCPの使用して粗溶解物を実証します新規な水溶性のクロロフィル結合タンパク質のための、およびクロロフィル-タンパク質相互作用及び組立プロセスの研究のための遺伝子スクリーニングシステムを開発するために使用することができる大腸菌細胞。

概要

このようなクロロフィル（Chl類）、バクテリオ（Bchl類）およびカロテノイドのような疎水性顔料は、電子輸送、及び光エネルギーの取り込みと転送を行う光合成反応中心と集光性タンパク質中の主要な補因子です。反応中心およびCH1結合集光複合体の大部分は膜貫通タンパク質です。非酸素発生型光合成緑色硫黄細菌^1,2のFenna-マシューズ-オルソン（FMO）タンパク質、および渦鞭毛藻類³のペリジニン-クロロフィルタンパク質（PCP）は、水溶性の集光タンパク質の例外的な例です。水溶性クロロフィル結合タンパク質（WSCPs） アブラナ科 、 タデ 、 アカザ科のとヒユ科の植物は^4、5は、別^のユニークな例であり、まだFMOとPCPとは対照的に、これらは、光の収穫にも主要な光合成反応のいずれかの中にも関与しています、およびそれらの正確なPHYsiological機能はまだ^5-8不明です。彼らの高クロロフィル結合親和性はChl類及びクロロフィル誘導体の^9,10の一過性の担体として示唆された機能につながっています。あるいは、WSCPが損傷を受けた細胞内でChl類を捕捉する役割を果たし、クロロフィルによって誘発される光酸化損傷^7,11-13から保護するという仮説が立てられました。最近では、それはプロテアーゼ阻害剤としてのそのWSCP機能を提案し、草食性の間に役割を果たしているだけでなく花の開発¹⁴の間の細胞死を調節しました。 WSCPsは、それらの光物理的特性に応じて2つの主なクラスに分けられます。最初のクラス（クラスI、 例えば シロザから）は、照明時に光変換を受けることができます。クラスII、さらなるクラスIIa族に細分化されている（ 例えば 、 キャベツ、ダイコンから）光変換^5,10を受けないアブラナ属植物からWSCPsおよびIIb（ 例えば 、 マメグンバイナズナから）。 Lepidiumのvirginicumからクラス第IIb WSCPの構造は2.0Å分解能⁸のX線結晶学によって解決しました。これは、タンパク質サブユニットは、疎水性コアを形成する対称​​ホモ四量体を明らかにしています。各サブユニットは、単純なcore.This内の4つの密に詰まったChl類の密な配置になり、単一のクロロフィルは、すべてのクロロフィルの配置がWSCPsクロロフィル - タンパク質複合体の結合および組み立てを研究するための潜在的に有用なモデルシステム、および隣接Chl類の効果を作る結合しそして個々のChl類のスペクトルと電子物性上の​​タンパク質環境。また、人工光合成素子で集光モジュールに使用することができる人工のクロロフィル結合タンパク質を構築するためのテンプレートを提供することができます。

植物から精製された複合体は常にクロロフィルaの異なる組み合わせで四量体の不均一な混合物が含まれているため、ネイティブWSCPsの厳密な研究が実現可能ではありませんそして、クロロフィルbの^9。したがって、 インビトロで Chl類と組換え的に発現WSCPsを組み立てるための方法が必要とされます。これは、 インビトロ組立体^15が示されたチラコイド膜とアポタンパク質とを混合することによってそれができないだけで、水溶液中で顔料と水溶性のアポタンパク質を混合することによってin vitroで複合体をアセンブルすることができるChl類のごくわずかな水溶解度挑戦しているがこの方法は、チラコイド内のネイティブChl類の存在に限定されています。シュミットら 。組換えにより大腸菌にヒスチジンタグ付きタンパク質を発現させることによってカリフラワー（CaWSCP）からWSCPで、いくつかのクロロフィルとのBchl誘導体を組み立てる上で報告大腸菌は、Ni-アフィニティーカラム上にそれを固定化し、洗浄剤¹¹中に可溶化クロロフィル誘導体を導入します。 A.からの組換えWSCPsのに成功しました再構成シロイヌナズナ ^6、および芽キャベツ（BoWSCP）、日本の野生ダイコン（RshWSCP）AN同様の方法により、Dバージニアpepperweed（LvWSCP）も報告されました。

ここでは、小説、タンパク質をタグ付けを必要としないWSCPとChl類を組み立てるまたは固定化するための一般的な、簡単な方法を提示します。これは、鉱油中の水​​溶性アポタンパク質のそれらの水溶液からエマルションを調製するに依存しています。タンパク質は、このように体積比¹⁶に非常に高い表面積を有する油中水型（W / O）微小液滴中に封入されています。疎水性の補因子は、次いで、油中に溶解され、容易に油相から液滴に導入されます。我々は、組換えE.で表現WSCPアポタンパク質のいくつかの変異体の組立方法を使用してについて報告しますクロロフィルを持つ大腸菌 。我々は、新規のクロロフィル結合タンパク質を開発するためのスクリーニング系として使用することができるWSCP過剰発現細菌の粗溶解物からアセンブリを示します。

プロトコル

1.準備クロロフィル株価ソリューション

1. 重要なステップ：光損傷を最小限にするために、化学フードで、緑色光（520 nm）の下や暗所でのクロロフィルの準備のすべての手順を実行します。必ず、ストレージ用の顔料を凍結する前に、窒素またはアルゴンを追加します。全ての溶媒は分析グレードであることを確認してください。
2. チラコイド膜にのみクロロフィルaを含有する凍結乾燥スピルリナプラテンシス細胞または他のシアノバクテリア細胞の約5mgを秤量し、乳鉢と乳棒を使用してそれをつぶします。
3. 負荷は、ガラスカラム上に細胞を破砕し、カロテノイドを除去するために約50〜100mlの％アセトンので洗います。溶出グリーン/オレンジ部分を破棄します。
   注：オレンジ画分を100mlのアセトンで溶出されていない場合には、緑色の画分が溶出し始めるまでアセトンで細胞を洗浄し続けます。
4. 100％のメタノールを使用してExchangeアセトンとクロロフィルaを含む緑色画分を収集します。溶出したFRACTの体積イオン50-100 mlの間で変化してもよいです。初めに、溶出画分を溶出の終わりに薄緑色に変化する暗緑色を持っています。溶出画分の色は薄緑色に変わったら溶出を停止します。
5. 抽出物が完全に乾燥するまでロータリーエバポレーターを用いてメタノールを蒸発させます。この溶液に熱を加えないでください。エバポレーターの水浴温度が30℃を超えないようにしてください。
   注：蒸発時間が蒸発するメタノール画分の量に依存し、10〜60分の間で変化してもよいです。完全にエキスを乾燥させることが重要です。
6. ジエチルエーテル（約5〜10 ml）を少量の乾燥抽出物から顔料を溶解し、脱脂綿でろ過します。顔料が完全にフィルタリングする前に、エーテル中に溶解されていることを確認してください。
7. 顔料は（10月30日分）完全に乾燥するまで、ジエチルエーテルを蒸発させます。
   注：乾燥顔料はでパージし、で窒素またはアルゴン下に保持することができます-20℃で、さらに処理するまで暗いインチ
8. ないすべてが完全に中断されていても、100％メタノール（約1ml）の可能な最小量に乾燥顔料を溶解します。この溶液にアセトンの4ミリリットルを追加し、完全に顔料を溶解させるために穏やかにガラスをフリック。
9. パスツールピペットを用いて、DEAEカラム上に静かにサンプルをロードし、100％アセトンで平衡化したセファロース。
10. 100％アセトンでカロテノイド（橙黄色帯）を溶出します。 1（v / v）のアセトン/メタノール混合物：その後、3とクロロフィル（緑帯）溶出します。
    注：アセトン、アセトン/メタノール混合物の体積がカラムに充填セファロースDEAEの容積とほぼ同等です。
11. 溶離液¹⁷として2ジクロロメタン/ n-ヘキサン/イソプロパノール/メタノール（v / v）の混合物：25：5クロロフィル68を用いた薄層クロマトグラフィーにより純度を確認。
12. クロロフィルaが完全に乾燥するまで（ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させ、10-60分）。
    注：乾燥クロロフィル窒素またはアルゴンでパージし、暗所に-20℃でアルゴン雰囲気下で保存することができます。
13. 100％エタノール2〜4 ml中の乾燥クロロフィルaを再溶解することによりクロロフィルに原液を準備します。
    注：663 nmでのクロロフィルaの吸光係数は74400センチメートル^-1 M ^-1（83.3センチメートル^-1（mg / mlで^）-1）エタノールです。典型的なストック溶液を、25mM（23 mg / mlで）の濃度に対応する1860のODを持っている必要があります。クロロフィルの10倍モル過剰の対と混合して有機相の5ミリリットル、及び水相の結果の1ミリリットル中WSCP 1mgを含有するエマルジ ​​ョンに、この株式の20μLを追加しますWSCP。

2.エマルジョンの有機相を準備

注：エマルジョンの有機相（v / v）のスパン80 4.5％を含有する鉱油で構成され、0.4％（v / v）のツイーン80。

1. Tの50ミリリットルチューブ0.2グラムを計量、80スパン80を1.8g、および鉱油38gのをWEEN。よく、すべての成分を混合し、氷上で冷却します。
   注：有機相は、一週間まで4℃で保存することができます。

3.エマルジョンの水相を準備

注：エマルジョンの水相は、精製WSCP、またはWSCPを過剰発現する細菌の粗抽出物のいずれかで構成されてもよいです。

1. 精製WSCPを含む水相を調製しました。
   1. 0.3から0.6のODまで37℃でLB培地1LにWSCPプラスミド^12を含む大腸菌 BL21細菌を成長させます。
   2. 1mMのIPTGを添加することによってタンパク質発現を誘導します。誘導後12から16時間、30℃で細菌を成長させます。
   3. 4℃で10分間、5000×gで遠心分離によって収穫細菌。
   4. 氷の上にバッファと超音波処理の結合にペレットを溶解させる（上30秒、15秒オフ、5回）。の250ミリリットルの遠心分離から得られたペレットのための緩衝液10mlを使用しますタンパク質を過剰発現する細胞を含むLB培地。
      注：精製方法に応じて、結合緩衝液は、100mMのリン酸緩衝液（pH7.2）または50mMのトリス、pH7.5で、500mMのNaCl、5mMのEDTAから構成されてもよいです。
   5. 4℃で30分間12,000×gで細胞溶解物をスピンダウン。
   6. アフィニティークロマトグラフィーによってWSCPを精製します。 WSCPに融合したタグに応じて、製造業者の指示に従って、タンパク質精製のための適切な市販のアフィニティークロマトグラフィーシステムを使用して組換えタンパク質を精製します。
   7. エマルジョン調製のために、50 mMの中の精製WSCPリン酸緩衝液、pH 7.8を使用します。再構成のために使用される最終的なタンパク質の量がバッファの1ミリリットル当たり0.5〜1.0ミリグラムであることを確認してください。
2. WSCPで、粗細菌溶解物を含む水相を調製しました。
   1. OD 0.3から0.6まで、37℃でLB培地250ml中のプラスミド発現WSCPを含む大腸菌 BL21細胞を成長させます。
   2. でタンパク質発現を誘導します1mMのIPTGおよび30℃で一晩細菌を増殖します。
   3. 4℃で10分間5,000×gでの遠心分離によって菌体を回収。
   4. 4℃で30分間、12,000×gで50 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.8、超音波処理（上の30秒、15秒オフ、三回）遠心1-2 ml中にペレットを溶解します。
   5. 50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.8の0.875 mlの上清0.125 mlと混合して、エマルジョンの水相を調製します。

エマルジ ​​ョン中のクロロフィルAとWSCPの4アセンブリ

1. ガラスバイアルへの転送油、界面活性剤混合物の5ミリリットルを、氷上にそれを冷却します。ピペッティングの前に、有機相のすべてのコンポーネントが完全に混合されていることを確認し、界面活性剤や鉱物油との間には相分離はありません。
2. 有機相の5ミリリットルにセクション3のように調製した氷冷水相の1ミリリットルを追加します。
3. 氷上で9,500 rpmで2分間、組織ホモジナイザーを用いて、両相を混ぜます。
4. 重要なステップ：上のこの段階から、光損傷を最小限にするために、緑色の光（520 nm）の下にあるすべてのさらなるステップを実行します。 25 mMのクロロフィルストック溶液20μlを加えるエマルジ ​​ョンに（項1.13を参照してください）。フリックとガラスバイアルを反転させて分散させます。クロロフィルが均等にエマルジョンで配布されていることを確認します。
5. 暗所で氷上で1〜2時間乳剤をインキュベートします。
6. 有機相からエマルジョンおよび独立した水滴を打破するために、室温で5分間、14,000×gで1.5ミリリットルプラスチックチューブと遠心分離機にエマルジョンを転送します。
   注意：アセンブリが​​成功した場合、下層の水相は、緑の色を持っている必要があります。
7. 上部の油相を廃棄し、鉱油を1ml加えます。ボルテックスによって、あるいは完全にチューブを反転することによってペレット化し、エマルジョンとよくミネラルオイルを混ぜます。室温で5分間、14,000×gでサンプルをスピンダウン。水性および鉱山労働者を分離する明確なメニスカスまで、この手順を繰り返します中間エマルジョンなしアル油相が得られます。
8. 化学フード内で、この手順を実行します。水、ミネラルオイル相が明確に分離された後、ミネラルオイルを除去し、水飽和ジエチルエーテルを1ml加えます。ボルテックスし、室温で5分間、14,000×gでサンプルをスピンダウン。二回、この手順を繰り返します。
9. 2回目の遠心分離後、ジエチルエーテルを除去し、フード内で5-20分間開いたチューブを残します。
10. 最後に、脱塩カラムにWSCP /クロロフィル複合体を含有する水相をロードし、さらなる実験のための適切な緩衝液で溶出します。
    注：タンパク質は、リン酸と広範囲のpH（6.0-7.5）でトリス緩衝液中で安定しています。試料は、1ヶ月まで、光から保護して4℃で保存することができます。

結果

組換えWSCPアポタンパク質は、前のセクションで説明したプロトコルに従って、W / Oエマルション中のクロロフィルAを用いて組み立てました。プロトコルは純粋WSCPs、または溶解物大腸菌細胞WSCPを過剰発現する（ 図1）のいずれかを含有する水相を用いて実施されました。プロトコルは速く、簡単で、組織ホモジナイザーを除き、特別な装置?...

ディスカッション

私たちの目標は、疎水性の顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質の組み立てのための新しい一般的なシステムを開発することでした。ここでは、W / Oエマルションに基づいて、新たな再構成システムは、組換えE.で表現芽キャベツ、カリフラワー、わさびとバージニアpepperweedからWSCPアポタンパク質のアセンブリのために働くことが証明の一般的なアプローチであることが示されて?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification