המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.

Abstract

כלורופיל (Chls) ו bacteriochlorophylls (BChls) הוא הקו-הפקטורים העיקריים המבצעות קציר פוטוסינתטיים אור העברת אלקטרונים. הפונקציונליות שלהם תלויה באופן קריטי לארגון הספציפי שלהם בתוך קומפלקסי חלבונים הטרנסממברני multisubunit גדולות ומסועפים. על מנת להבין ברמה המולקולרית איך קומפלקסים אלה להקל המרת אנרגית שמש, זה הכרחי כדי להבין חלבון-פיגמנט, ואינטראקציות פיגמנט-פיגמנט, והשפיע על דינמיקה נרגשת. אחת דרכים להשיג הבנה כזו היא על ידי בנייה ולומד קומפלקסים של Chls עם חלבונים רקומביננטיים מסיסים במים פשוטים. עם זאת, המשלב בתוכו את Chls ו BChls lipophilic לחלבונים מסיסים במים קשה. יתר על כן, אין שיטה כללית, אשר יכול לשמש להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת תפוקה פשוט גבוהה המבוססת על אמולסיות מים-in-שמן, המאפשרת את תחתembly של חלבונים מסיסים במים עם Chls הידרופובי. השיטה החדשה קיבלה תוקף על ידי הרכבת גרסאות רקומביננטי של חלבון מסיס במים כלורופיל מחייב של צמחים מצליבים (WSCP) עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה המוצלחת של Chl lysates גולמי באמצעות של WSCP להביע E. תא קולי, אשר עשוי לשמש לפיתוח מערכת מסך גנטי חלבונים מסיסים במים הרומן Chl מחייב, וכן לבדיקות של אינטראקציות Chl בחלבונים תהליכי ההרכבה.

Introduction

פיגמנטים הידרופובי כגון כלורופיל (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) וקרוטנואידים הם הקו-הפקטורים העיקריים במרכזי תגובה פוטוסינתטיים וחלבוני קצירת אור מבצעות העברת אלקטרונים, ללכוד את אנרגית אור והעברה. מרכזי התגובה ורוב מתחמי הקציר Chl מחייבים אור הם חלבונים הטרנסממברני. Fenna-מתיוס-אולסון (FMO) החלבון של חיידקי גופרית ירוקה פוטוסינתטיים הלא חמצנית ^1,2, ואת חלבון peridinin-Chl (PCP) של dinoflagellates ³ ​​דוגמאות יוצאות דופן של חלבוני קצירת אור מסיסים במים. החלבונים מחייבים מסיסים במים כלורופיל (WSCPs) של המצליבים, ארכוביתיים, Chenopodiaceae ו ירבוזיים צמחים ^{4, 5} הם עוד דוגמא ייחודית, עדיין בניגוד FMO ו PCP, אלה אינם מעורבים בקצירת אור ולא בשום התגובה פוטוסינתטיים העיקרית , ו PHY המדויק שלהםפונקציות siological הן עדיין לא ברורות ^5-8. הזיקה הגבוהה Chl המחייב שלהם הובילה פונקציה הציעה כנישאים חולפים של Chls ונגזר Chl ^9,10. לחלופין, זה היה שיערו כי WSCP ממלא תפקיד הדחה Chls ב תאים פגומים ומגן מפני נזק photooxidative הנגרמת Chl ^7,11-13. לאחרונה, הוצע כי פונקציות WSCP כמעכב פרוטאז וממלא תפקיד במהלך התנגדות אוכלי עשב כמו גם מסדיר מוות של תאים במהלך התפתחות הפרח ^14. WSCPs נחלקים לשתי קבוצות עיקריות על פי מאפייני photophysical שלהם. המחזור הראשון (אני בכיתה, למשל. מן כף אווז לבנה) עשוי לעבור photoconversion על תאורה. Class II WSCPs מצמחים Brassica, שאינם עוברים photoconversion ^5,10, מחולקים נוספת לכיתה IIa (למשל., מ oleracea Brassica, sativus Raphanus) ו IIb (למשל., מן שחליים virginicum ). המבנה של הכיתה IIb WSCP מן שחליים virginicum נפתרה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן על 2.0 ברזולוציה ^8. הוא מגלה homotetramer סימטרי שבו יחידות משנת חלבון יוצרי ליבה הידרופובי. למקטע כל נקשר Chl אחת שתוצאתה הסדר הדוק של ארבעה Chls מקרוב ארוז בתוך core.This פשוט כל הסדר Chl עושה WSCPs מערכת מודל שימושי פוטנציאלי ללימוד מחייב והרכבה של מתחמי Chl-חלבון, ואת ההשפעות של השכנה Chls וסביבות חלבון על תכונות ספקטרליות ואלקטרוניקה של Chls הפרט. יתר על כן, היא עשויה לספק תבניות לבניית חלבונים מלאכותיים Chl מחייב כי ניתן להשתמש עבור מודולים אור-קציר בהתקנים המבצעים פוטוסינתזה מלאכותית.

מחקרים קפדניים של WSCPs ילידי הארץ הם ​​לא ריאליים כי מתחמי מטוהרי מצמחים תמיד מכילים תערובת הטרוגנית של tetramers עם שילובים שונים של Chlו Chl ב ^9. לפיכך, שיטה להרכבת WSCPs recombinantly הביע עם Chls במבחנה נדרשה. זה מוטל בספק על ידי המים המסיסים הזניחה של Chls מה שהופך את זה אי אפשר להרכיב את המורכבות במבחנה פשוט על ידי ערבוב apoproteins מסיס במים עם פיגמנטים בתמיסות מימיות. במבחנת הרכבה ידי ערבוב apoproteins עם ממברנות תילקואיד ¹⁵ הודגם, אבל שיטה זו מוגבלת בהווה Chls הילידים תילקואיד. שמידט ואח '. דיווח על הרכבת כמה נגזרים Chl ו BChl עם WSCP מ כרובית (CaWSCP) על ידי recombinantly לבטא חלבון מתויג-היסטידין ב E. coli לשתק אותו על עמודה Ni-זיקה והחדרת נגזרים Chl solubilized ב דטרגנטים ^11. כינון מחדש בהצלחה של WSCPs רקומביננטי מ א thaliana ^6, וכרוב ניצנים (BoWSCP), צנון בר יפני (RshWSCP)ד וירג'יניה pepperweed (LvWSCP) על ידי שיטה דומה גם דווח.

כאן, אנו מציגים רומן, כללית, שיטה פשוטה להרכבת Chls עם WSCP שאינו דורש תיוג או לשתק את החלבונים. היא מסתמכת על הכנת אמולסיות מהפתרונים מהימיים שלהם של apoproteins מסיס במים בשמן מינרלים. החלבונים ובכך הם הגלום מים ב-שמן (W / O) microdroplets עם משטח גבוה מאוד יחס נפח ^16. קו-פקטורים הידרופובי אז הם מומסים בשמן מוצגים בקלות לתוך טיפות משלב שמן. אנו מדווחים על השימוש בשיטה להרכבה של מספר הגירסות של apoproteins WSCP הביעו recombinantly ב E. coli עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה מ lysate הגולמי של חיידקים ביתר-WSCP אשר עשוי לשמש כמערכת הקרנה לפיתוח חלבוני Chl מחייבים רומן.

Protocol

1. הכנת Chl פתרונות במלאי

1. שלב קריטי: בצע את כל השלבים של הכנת כלורופיל במנדף כימי, תחת אור ירוק (520 ננומטר) או בחושך כדי למזער נזקי. תמיד להוסיף חנקן או ארגון לפני ההקפאה הפיגמנטים לאחסון. ודא שכל ממיסים הם כיתה אנליטי.
2. שוקל כ 5 מ"ג של תאי platensis ספירולינה lyophilized או תאי cyanobacterium אחרים המכילים Chl רק ממברנות תילקואיד ולרסק אותו בעזרת מכתש ועלי.
3. טען תאים התנפלו טור זכוכית ולשטוף עם על אצטון 50-100 מ"ל של 100% על מנת להסיר קרוטנואידים. מחק את השבריר הכתום / ירוק eluted.
   הערה: אם השבר תפוז אינו eluted עם 100 מ"ל של אצטון ממשיכים לשטוף את התאים עם אצטון עד שבריר ירוק מתחיל elute.
4. המרת אצטון עם 100% מתנול ולאסוף את החלק היחסי ירוק המכיל Chl א. היקף Fract elutedיון עשוי להשתנות בין 50-100 מ"ל. בהתחלה השבר eluted יש צבע ירוק כהה, אשר משנה לתוך ירוק בהיר בסוף elution. כאשר הצבע של חלק eluted הופך ירוק בהיר לעצור את elution.
5. לאדות את מתנול באמצעות מאייד רוטרי עד התמצית יבשה לחלוטין. אין ליישם חום לפתרון; ודא שהטמפרטורה באמבט מים של המאייד אינה עולה על 30 מעלות צלזיוס.
   שימו לב: בפעם של אידוי תלוי בנפח של שבריר מתנול להיות התאדו ועשויה להשתנות בין 10-60 דקות. חשוב לייבש את התמצית לחלוטין.
6. ממיסים את הפיגמנטים מהתמצית יבשים בנפח קטן של אתר diethyl (כ 5-10 מ"ל), ולסנן דרך צמר גפן. ודא פיגמנטים מתמוססים לחלוטין ב אתר לפני הסינון.
7. לאדות את אתר diethyl עד פיגמנטים יבשים לחלוטין (10-30 דקות).
   הערה: פיגמנטים היבשים ניתן מטוהר עם ומשייך תחת חנקן או ארגון ב -20 ° C, בחושך עד לעיבוד נוסף.
8. ממיסים את הפיגמנטים יבש נפח קטן ככל האפשר של מתנול 100% (כ 1 מ"ל), גם אם לא הכל מושעה לחלוטין. הוסף 4 מ"ל של אצטון לפתרון, קפיצי הזכוכית בעדינות כדי לפזר את הפיגמנטים לחלוטין.
9. בעזרת פיפטה פסטר, לטעון את המדגם בעדינות על טור של DEAE sepharose equilibrated אצטון 100%.
10. קרוטנואידים Elute (להקה כתומה-צהוב) עם 100% אצטון. לאחר מכן, elute Chl A (להקה ירוקה) עם 3: 1 v / v אצטון / מתנול תערובת.
    הערה: היקף אצטון תערובת אצטון / מתנול הוא כ שווה לנפח של DEAE sepharose נטען על עמודה.
11. ודא Chl טוהר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה באמצעות 68: 25: 5: 2 dichloromethane / n-הקסאן / isopropanol / מתנול (v / v) תערובת כמו eluent ^17.
12. להתאדות הממס באמצעות המאייד רוטרי עד א Chl יבש לחלוטין (10-60 דק ').
    הערה: יבש Chl ניתן מטוהר עם חנקן או ארגון ומאוחסנים תחת אווירה ארגון ב -20 ° C בחושך.
13. כן Chl פתרון מניות על ידי מחדש המסת א Chl היבשה 2-4 מיליליטר של 100% אתנול.
    הערה: מקדם הכחדה של Chl ב 663 ננומטר הוא 74,400 ^-1 ס"מ M ^-1 (83.3 ס"מ ^-1 (מ"ג / מ"ל) ^-1) באתנול. פתרון המניות טיפוסי צריך OD של 1,860 המתאים לריכוז של 25 מ"מ (23 מ"ג / מ"ל). הוספת 20 μl של המניה הזו כדי תחליב המכיל 5 מ"ל של שלב אורגני, 1 מ"ג של WSCP ב 1 מ"ל של תוצאות השלב מימית בתערובת עם 10 עודף טוחנת קיפול של Chl א 'לעומת WSCP.

2. הכנת שלב אורגני של אמולסיה

הערה: השלב האורגני של התחליב מורכב שמן מינרלי המכיל 4.5% (v / v) Span 80, ו -0.4% (v / v) Tween 80.

1. לשקול בתוך g 50 מ"ל צינור 0.2 TWeen 80, 1.8 גרם של Span 80, ו -38 גרם של שמן מינרלי. מערבבים היטב את כל המרכיבים להתקרר על הקרח.
   הערה: בשלב אורגני ניתן לאחסן 4 ° C עד שבוע.

3. הכנת מימית שלב של אמולסיה

הערה: השלב המימי של התחליב יכול להיות מורכב משני WSCP המטוהר, או לחלץ גולמי של חיידקי overexpressing WSCP.

1. הכנת שלב מימייה המכיל WSCP המטוהר.
   1. לגדול חיידקי E.coli BL21 המכילים WSCP פלסמיד ¹² ב 1 ליטר של מדיום LB ב 37 ° C עד OD של 0.3-0.6.
   2. להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ"מ. לאחר אינדוקציה לגדול חיידקים על 30 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
   3. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
   4. ממס את הגלולה ב חיץ מחייב ו sonicate על קרח (30 שניות על, 15 שניות את, חמש פעמים). השתמש 10 מ"ל של חיץ עבור גלולה המתקבל צנטריפוגה של 250 מ"ל שלLB בינוני עם תאים overexpressing החלבון.
      הערה: בהתאם שיטת טיהור, למאגר מחייב יכול להיות מורכב 100 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.2 או 50 מ"מ טריס, pH 7.5, 500 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA.
   5. ספין למטה lysate התא XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C.
   6. לטהר WSCP ידי כרומטוגרפיה זיקה. בהתאם התג התמזג WSCP, לטהר חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכת כרומטוגרפיה הזיקה המתאימה הזמינה מסחרי עבור טיהור חלבונים בהתאם להוראות יצרן.
   7. להכנת תחליב, השתמש WSCP מטוהר 50 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.8. ודא שכמות החלבון הסופי המשמש הכינון מחדש הוא 0.5-1.0 מ"ג לכל 1 מ"ל של חיץ.
2. הכנת שלב מימייה המכיל lysate חיידקים גולמי עם WSCP.
   1. לגדל תאים E.coli BL21 המכיל WSCP להביע פלסמיד ב 250 מ"ל של מדיום LB ב 37 ° C עד OD 0.3-0.6.
   2. להשרות ביטוי חלבון עםIPTG 1 מ"מ ולגדול חיידקים לילה בשעה 30 ° C.
   3. תאים חיידקיים קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
   4. ממיסים את גלולה ב 1-2 מ"ל של 50 מ"מ חיץ פוספט נתרן pH 7.8, sonicate (30 שניות על, 15 שניות את, שלוש פעמים) ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 30 דקות ב 4 °.
   5. מכינים את השלב מימית של התחליב על ידי ערבוב 0.125 מ"ל של supernatant עם 0.875 מ"ל של pH חיץ פוספט נתרן 50 מ"מ 7.8.

4. האסיפה של WSCP עם Chl ב אמולסיה

1. העברת 5 מ"ל של תערובת-פעילי שטח שמן לתוך בקבוקון זכוכית לקרר אותו על הקרח. לפני pipetting, לוודא שכל המרכיבים של השלב האורגני מעורבבים היטב ואין הפרדת פאזות בין פעילי שטח ושמן מינרלים.
2. הוסף 1 מ"ל של שלב מימית קר כקרח מוכנים כמו בסעיף 3 עד 5 מ"ל של השלב האורגני.
3. מערבבים שני שלבים באמצעות homogenizer רקמה 2 דקות ב -9,500 סל"ד על הקרח.
4. שלב קריטי: משלב זה והלאה, לבצע את כל צעדים נוספים תחת אור ירוק (520 ננומטר) על מנת למזער נזקי. הוסף 20 μl של 25 מ"מ Chl פתרון המניות (ראו סעיף 1.13) כדי התחליב. לפזר על ידי מצליף ו היפוך בקבוקון זכוכית. ודא כי Chl מופץ באופן שווה התחליב.
5. דגירה אמולסיה במשך 1-2 שעות על הקרח בחושך.
6. על מנת לשבור את תחליב טיפות מים נפרד מהשלב אורגני להעביר את תחליב צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: אם האסיפה היא מוצלחת, בשלב מהימי התחתון צריך להיות בצבע ירוק.
7. השלך את שלב שמן העליון ולהוסיף 1 מיליליטר של שמן מינרלים. מערבבים היטב את שמן מינרלי עם אמולסיה pelleted ידי מערבולת או על ידי מרפרף צינור ביסודיות. ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עד המניסקוס ברור המפריד בין מימיים כוריםשלבי שמן אל, ללא כל אמולסיה ביניים מתקבלים.
8. בצע פעולה זו במנדף כימי. לאחר שלבי שמן מימייה ומינרלים מופרדים בבירור, להסיר שמן מינרלים ולהוסיף 1 מיליליטר של אתר diethyl-רווי מים. וורטקס ו ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על פעולה זו פעמיים.
9. לאחר צנטריפוגה השני, להסיר את אתר diethyl ולהשאיר את הצינורות פתוחים עבור 5-20 דקות בתוך הכובע.
10. לבסוף, טען את השלב מהימי המכיל את WSCP / Chl קומפלקס על טור desalting ו elute עם מאגר מתאים עבור ניסויים נוספים.
    הערה: החלבון יציב מאגרי phosphate- ו טריס במגוון רחב של pH (6.0-7.5). המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 ° C מוגן מפני אור עד חודש.

תוצאות

Apoproteins WSCP רקומביננטי הורכב עם Chl תחליבי W / O על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף הקודם. הפרוטוקול יושם באמצעות שלבי מימייה המכילים גם WSCPs הטהור, או lysates תאי E.coli overexpressing WSCP (איור 1). הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר ואינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד homo...

Discussion

המטרה שלנו היתה לפתח מערכת חדשה כללית להרכבה של חלבונים מסיסים במים מחייב כלורופיל עם פיגמנטים הידרופובי. כאן זה מוצג שמערכת הכינון מחדש החדשה המבוססת על אמולסיה W / O היא גישה כללית הוכחה לעבוד להרכבת apoproteins WSCP מן כרוב ניצנים, כרובית, חזרת יפנית pepperweed וירג'יניה הביע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification