Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты

Резюме

Эта рукопись описывает простую и высокую пропускную способность метода для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов, которая основана на воде в масле. Показана эффективность метода в сборке отечественных хлорофиллов с четырьмя вариантами рекомбинантного растворимого в воде-хлорофиллом связывающих белков (WSCPs) из Brassica растений , выраженных в Е. палочки.

Аннотация

Хлорофилл (ЧЛС) и бактериохлорофиллы (BChls) являются основными кофакторами, которые осуществляют сбор урожая фотосинтетический света и переноса электронов. Их функциональные возможности в значительной степени зависит от их конкретной организации в крупных и сложных белковых комплексов мультисубъединичный трансмембранных. Для того, чтобы понять, на молекулярном уровне, как эти комплексы облегчить преобразование солнечной энергии, важно понимать белок-пигмент, и пигмент-пигментных взаимодействия, а также их влияние на динамику возбужденными. Одним из способов получения такого понимания является путем построения и изучения комплексов ЧЛС с помощью простых водорастворимых рекомбинантных белков. Тем не менее, включающий липофильные ЧЛС и BChls в водорастворимые белки трудно. Более того, не существует общего метода, который может быть использован для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов. Здесь мы покажем простую и высокую пропускную способность системы, основанной на воде в масле, что позволяет задницуembly водорастворимых белков с гидрофобными ЧЛС. Новый метод был проверен путем сборки рекомбинантных версий растворимого в воде хлорофилла связывающего белка Brassicaceae растений (WSCP) с Хл. Показано , успешное проведение монтажных работ Хл А с использованием сырой лизаты WSCP , выражающие E. палочка клетка, которая может быть использована для разработки генетической системы экрана для новых водорастворимых белков Chl-связывающих, а также для изучения Хл-белковых взаимодействий и процессов сборки.

Введение

Гидрофобные пигменты, такие как хлорофиллы (ЧЛС), бактериохлорофиллов (BChls) и каротиноидов являются основными кофакторами в фотосинтезирующих реакционных центров и легких белков лесозаготовок, которые осуществляют перенос электронов, а также захватить световой энергии и передачи. Центры реакции и большинство Chl-связывающих уборочных комплексов легких являются трансмембранными белками. Fenna-Мэттьюз-Olson (Предприятию) белок не-кислородных бактерий фотосинтетический зеленовато-серой ^1,2, а белок перидинина-Хл (РСР) динофлагеллят ³ являются исключительными примерами водорастворимых белков светособирающих. Водорастворимые хлорофилл связывающие белки (WSCPs) из Brassicaceae, Polygonaceae, маревых и Amaranthaceae растения ^{4, 5} являются еще одним уникальным примером, но в отличие от FMO и PCP, они не являются ни участвовать в легкой уборке , ни в какой - либо реакции первичного фотосинтетического , и их точное PHYsiological функции пока неясно , ^5-8. Их высокое сродство Хл связывания привели к предложенной функции в качестве переходных носителей ЧЛС и производных Chl ^9,10. В качестве альтернативы, была выдвинута гипотеза о том , что WSCP играет роль в продувочного ЧЛС в поврежденных клетках и защищает от Chl-индуцированной фотоокислительном повреждения ^7,11-13. Совсем недавно было высказано предположение , что функции WSCP в качестве ингибитора протеазы и играет определенную роль в процессе сопротивления травоядных , а также регулирует гибель клеток во время развития цветка ^14. WSCPs делятся на два основных класса в зависимости от их фотофизические свойства. Первый класс (класс I, например. От марь белая) могут подвергаться фотоконверсии при освещении. Класс WSCPs II из Brassica растений, которые не претерпевают фотоконверсии ^5,10, далее подразделяются на класс IIa (например., Из капуста огородная, Raphanus Sativus) и IIb (например., От Lepidium virginicum ). Структура класса IIb WSCP из Lepidium virginicum была решена с помощью рентгеновской кристаллографии с разрешением 2,0 Å ^8. Она показывает симметричный гомотетрамера, в котором белковые субъединицы образуют гидрофобную сердцевину. Каждая субъединица связывает одну Chl, что приводит к жесткой расположение четырех плотно упакованными CHLS в пределах core.This просто вся компоновка Хл делает WSCPs потенциально полезную модель системы для изучения связывания и сборки Хл-белковых комплексов, а также влияние соседних CHLS и белковые среды на спектральные и электронных свойств отдельных ЧЛС. Кроме того, она может предоставить шаблоны для построения искусственных Chl-связывающих белков, которые могут быть использованы для светособирающих модулей в искусственных устройствах фотосинтетических.

Строгие исследования нативных WSCPs не представляется возможным , поскольку комплексы , очищенные из растений всегда содержат гетерогенную смесь тетрамеров с различными комбинациями Хли Хл б ^9. Таким образом, способ сборки рекомбинантно экспрессировать WSCPs с ЧЛС в пробирке требуется. Это сталкивается с проблемой незначительной растворимостью в воде ЧЛС , что делает невозможным собрать комплекс в пробирке путем простого смешивания водорастворимых апопротеины с пигментами в водных растворах. В пробирке сборки путем смешивания апопротеинов с мембранах тилакоидов ¹⁵ была продемонстрирована, но этот способ ограничен нативной ЧЛС, присутствующего в тилакои. Шмидт и др. сообщила о сборке нескольких CHL и ВСЫ производные WSCP из цветной капусты (CaWSCP) путем рекомбинантно экспрессии гистидин-меченый белок в Е. палочки иммобилизации его на колонку Ni-аффинной и введение CHL производных растворили в моющих средствах ^11. Успешно восстановление рекомбинантных WSCPs из A. thaliana ^6, и брюссельская капуста (BoWSCP), японская дикая редька (RshWSCP)d Вирджиния pepperweed (LvWSCP) аналогичным методом были также зарегистрированы.

Здесь мы представляем новый, общий, простой метод для сборки ЧЛС с WSCP, которые не требуют мечение или иммобилизации белков. Он опирается на приготовления эмульсий из их водных растворов водорастворимых апобелков в минеральном масле. Белки , таким образом , инкапсулированные в воде в масле (W / O) микрокапель с очень высокой удельной поверхностью по отношению к объему ^16. Гидрофобные кофакторы затем растворяют в масле и легко введены в капельки из масляной фазы. Мы сообщаем об использовании способа сборки нескольких вариантов WSCP апобелков рекомбинантно экспрессировали в E. палочка с Хл. Продемонстрирована сборку из сырого лизата WSCP-гиперэкспрессией бактерий, которые могут быть использованы в качестве системы скрининга для разработки новых CHL связывающих белков.

протокол

1. Подготовка CHL запаса Решения

1. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Выполните все этапы подготовки хлорофилла в химической капот, под зеленым светом (520 нм) или в темноте, чтобы минимизировать фотоповреждения. Всегда добавляйте азот или аргон перед замораживанием пигментов для хранения. Убедитесь, что все растворители аналитической степени чистоты.
2. Взвесьте около 5 мг лиофилизированных клеток спирулины или других цианобактерии клеток , содержащих только Хл в мембранах тилакоидов и раздавить его , используя ступку и пестик.
3. Нагрузка измельченные клетки на стеклянную колонку и промывают около 50-100 мл 100% ацетона, чтобы удалить каротиноиды. Откажитесь элюированного оранжевый / зеленый фракции.
   Примечание: Если оранжевая фракция не элюируют 100 мл ацетона продолжают промыванием клеток с ацетоном, пока зеленая фракция не начнет элюции.
4. Обмен ацетона со 100% -ным метанолом и собирают зеленую фракцию , содержащую Хл. Объем элюированного fractион может варьироваться от 50-100 мл. В начале, элюированной фракции имеет темно-зеленый цвет, который меняется в бледно-зеленый цвет в конце элюирования. Когда цвет элюированной фракции превращается в бледно-зеленый цвет остановить вымывание.
5. Упаривают метанол, используя роторный испаритель, пока экстракт не высохнет. Не прикладывать тепло к решению; убедитесь, что температура воды ванны испарителя не превышает 30 ° C.
   Примечание: Время испарения зависит от объема метанола фракции упариванием и может варьироваться от 10-60 мин. Важно, чтобы полностью высушить экстракт.
6. Растворите пигменты из высушенного экстракта в небольшом объеме диэтилового эфира (около 5-10 мл), и фильтруют через вату. Убедитесь, что пигменты полностью растворяют в эфире перед фильтрованием.
7. Упаривают диэтиловый эфир до тех пор, пигменты полностью не высохнут (10-30 мин).
   Примечание: Сухие пигменты могут быть продувают и держали под азотом или аргоном при -20 ° С, в темноте до дальнейшей обработки.
8. Растворите сухие пигменты в самом маленьком объеме возможной 100% метанола (около 1 мл), даже если не все полностью приостановлено. Добавляют 4 мл ацетона, к раствору, и вылить стакан осторожно, чтобы полностью растворить пигменты.
9. С помощью пипетки Пастера, загрузить образец осторожно на колонку ДЭАЭ сефарозе, уравновешенную 100% ацетона.
10. Элюции каротиноиды (оранжево-желтая полоса) с 100% ацетона. Затем элюции Хл (зеленая полоса) с 3: 1 об / об ацетон / метанол.
    Примечание: объем ацетона и ацетон / метанол, приблизительно эквивалентна объему ДЭАЭ сефарозе наносили на колонку.
11. Проверьте CHL чистоту с помощью тонкослойной хроматографии с использованием 68: 25: 5: 2 дихлорметан / н-гексан / изопропанол / метанол (об / об) в качестве элюента смесь ^17.
12. Растворитель испар ют с помощью роторного испарителя , пока Хл полностью высохнет (10-60 мин).
    Примечание: Сухой Хл можно продуть азотом или аргоном и хранили в атмосфере аргона при -20 ° С в темноте.
13. Подготовка CHL исходного раствора путем повторного растворения сухого Хл а в 2-4 мл 100% этанола.
    Примечание: Коэффициент экстинкции Хл при 663 нм , составляет 74400 см ^-1 М ^-1 (83,3 см ^-1 (мг / мл) ^-1) в этаноле. Типичный раствор должен иметь внешний диаметр, соответствующий 1860 в концентрации 25 мМ (23 мг / мл). Добавление 20 мкл этого запаса в эмульсию , содержащую 5 мл органической фазы и 1 мг WSCP в 1 мл водного раствора приводит фазы в смеси с 10 - кратным мольным избытком Хл а против WSCP.

2. Подготовка органической фазы эмульсии

Примечание: Органическая фаза эмульсии состоит из минерального масла, содержащего 4,5% (об / об) Спан 80, и 0,4% (об / об) твина 80.

1. Взвешивают в 50 мл трубки 0,2 г ТWEEN 80, 1,8 г Span 80, и 38 г минерального масла. Тщательно перемешать все компоненты и остывают на льду.
   Примечание: Органическая фаза может быть сохранена в 4 ° С в течение одной недели.

3. Подготовка Водную фазу эмульсии

Примечание: Водная фаза эмульсии может состоять или из очищенного WSCP или неочищенного экстракта бактерий с гиперэкспрессией WSCP.

1. Приготовление водной фазы, содержащей очищенный WSCP.
   1. Grow бактерии Е. coli BL21 , не содержащих плазмиду WSCP ¹² в 1 л LB среды при 37 ° С до OD 0,3-0,6.
   2. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 1 мМ IPTG. После индукции бактерии растут при температуре 30 ° С в течение 12-16 ч.
   3. Урожай бактерий путем центрифугирования при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
   4. Растворить осадок в буфере для связывания и соникатные на льду (30 сек на 15 сек, выключен, в пять раз). С помощью 10 мл буфера для Осадок, полученный после центрифугирования 250 млLB среду с клетками с гиперэкспрессией белка.
      Примечание: В зависимости от способа очистки, связывающим буфером может состоять из 100 мМ фосфатного буфера, рН 7,2 или 50 мМ Трис, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА.
   5. Спин вниз Клеточный лизат при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° C.
   6. Очищают WSCP с помощью аффинной хроматографии. В зависимости от тега, слитого с WSCP, очищают рекомбинантные белки с использованием соответствующего коммерчески доступную систему аффинной хроматографии для очистки белков в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Для приготовления эмульсии, используют очищенный WSCP в 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,8. Убедитесь в том, что окончательное количество белка для восстановления составляет 0,5-1,0 мг на 1 мл буфера.
2. Приготовление водной фазы, содержащей сырой бактериальный лизат с WSCP.
   1. Рост клеток Е. coli BL21 , не содержащие плазмиды , экспрессирующие WSCP в 250 мл LB среде при температуре 37 ° С до OD 0,3-0,6.
   2. Индуцируют экспрессию белка с1 мМ IPTG и выращивать бактерии в течение ночи при температуре 30 ° C.
   3. Урожай бактериальные клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
   4. Растворить осадок в 1-2 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,8, гомогенат (30 сек на 15 сек выкл, три раза) и центрифугировать при 12000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С.
   5. Готовят водную фазу эмульсии путем смешивания 0,125 мл супернатанта с помощью 0,875 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера с рН 7,8.

4. Монтаж WSCP с Хл в Emulsion

1. Передача 5 мл масла-поверхностно-активное вещество, приготовленное в стеклянный флакон и охладить его на льду. Перед пипеткой, убедитесь, что все компоненты органической фазы тщательно перемешивают и нет разделения фаз между поверхностно-активных веществ и минеральных масел.
2. Добавить 1 мл охлажденной льдом водной фазы, полученной как описано в разделе 3 по 5 мл органической фазы.
3. Смешайте обе фазы с помощью гомогенизатора тканей в течение 2 мин при 9,500 оборотах в минуту на льду.
4. Важным шагом: Начиная с этого этапа на выполните все дальнейшие шаги в зеленом свете (520 нм) с целью минимизации фотоповреждения. Добавьте 20 мкл 25 мМ Chl исходного раствора (смотри раздел 1.13) к эмульсии. Дисперсные Смахивающее и переворачивая стеклянный пузырек. Убедитесь, что Хл равномерно распределяется в эмульсии.
5. Выдержите эмульсии в течение 1-2 ч на льду в темноте.
6. Для того, чтобы разрушить эмульсию и отдельные капли воды из органической фазы переноса эмульсии 1,5 мл пластиковые пробирки и центрифуге при 14000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Если сборка прошла успешно, нижнюю водную фазу должны иметь зеленый цвет.
7. Утилизировать верхнюю фазу масла и добавьте 1 мл минерального масла. Хорошо перемешайте минеральное масло с гранулированным эмульсии путем вихря или с помощью тщательно переворачивая трубку. Спин вниз образца при 14000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг до получения прозрачного мениском, разделяющей водную и рудничныемасляные фазы Al, без какой-либо промежуточной эмульсии получается.
8. Выполните этот шаг в химической капот. После того, как водные и минеральные масляные фазы четко разделены, удалить минеральное масло и добавляют 1 мл насыщенного водой диэтилового эфира. Vortex и спином вниз образца при 14000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды.
9. После второго центрифугирования, удалить диэтиловый эфир и оставить пробирки открытыми в течение 5-20 мин в капюшоне.
10. И, наконец, загрузить водную фазу , содержащую WSCP / CHL комплекс на колонку для обессоливания и элюции с помощью буфера , пригодных для дальнейших экспериментов.
    Примечание: Белок стабилен в Трис и не содержащие фосфатов буферов в широком диапазоне рН (6,0-7,5). Образец можно хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света до одного месяца.

Результаты

Рекомбинантные WSCP апопротеины были собраны с Хл в W эмульсий / O в соответствии с протоколом , описанным в предыдущем разделе. Протокол был реализован с использованием водной фаз , содержащих либо в чистом виде WSCPs или лизаты клеток E.coli с гиперэкспрессией WSCP (ри?...

Обсуждение

Наша цель состояла в том, чтобы разработать новую общую систему для сборки водорастворимых хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными пигментов. Здесь показано , что новая система восстановление на основе W / O эмульсии общий подход доказал свою работу для сборки WSCP апобелков из брюсс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mineral oil	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges	Bio Rad	10011164	Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Chromatography medium for chlorophyll purification