طريقة بسيطة لالآلي المرحلة الصلبة استخراج عينات المياه للتحليل المناعية من الملوثات الصغيرة

Summary

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

ويقترح طريقة جديدة لاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) من العينات البيئية للمياه. النموذج المتقدمة ودية فعالة من حيث التكلفة وسهلة، ويمكن أن تؤدي SPE السريع، والآلي وبسيط. الحل قبل المركز متوافق مع تحليلها من قبل المناعية، مع نسبة منخفضة من المذيبات العضوية. وصفت طريقة لاستخراج وقبل تركيز الهرمون الطبيعي 17β استراديول في 100 مل عينات المياه. يتم تنفيذ المرحلة العكسية SPE مع octadecyl السيليكا المواد الماصة ويتم شطف مع 200 ميكرولتر من الميثانول 50٪ ت / ت. غير المخفف شاطف بإضافة مياه دي لخفض كمية من الميثانول. بعد إعداد يدويا العمود SPE، يتم تنفيذ الإجراء الشامل تلقائيا في غضون 1 ساعة. في نهاية هذه العملية، يتم قياس تركيز الاستراديول باستخدام انزيم مرتبط التجاري المناعية بالأنزيم (ELISA). ويتحقق 100 أضعاف ما قبل التركيز ومحتوى الميثانول في 10٪ فقط ت / ت. المبالغ المستردة كامل للجزيءتتحقق مع 1 نانوغرام / L ارتفعت عينات مياه البحر غير المتأينة والاصطناعية.

Introduction

إعداد نموذج يمثل خطوة مهمة في أي عملية التحليل. على وجه الخصوص، وإزالة آثار مصفوفة، انتقاص من تدخلات، وإثراء الحليلة ضرورية للحصول على نتائج دقيقة وتصل إلى حدود منخفضة من الكشف. الغدد الصماء المركبات (EDCs) تثير القلق بشكل خاص نظرا لعملها على الكائنات الحية حتى عندما الحالية في مستويات منخفضة جدا في البيئة. هرمون الطبيعي 17β استراديول موجود على تلوث المياه الاتحاد الأوروبي قائمة المراقبة وعرضة لتضاف إلى قائمة المواد ذات الأولوية تنظيمها بموجب الإطار التوجيهي للمياه الأوروبي. يتم تطبيق المرحلة الصلبة استخراج (SPE) عادة لتحليل الملوثات الصغيرة في الماء، مع كل الكيميائي ^1-5 (اللوني، مطياف الكتلة) والمناعية ^6-9 طرق الكشف. اكتسب هذا الأخير مصلحة في مجال الرصد البيئي، كما هي المناعية المتاحة في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأشكال، هي محددة لتاالحليلة r يمكنك الحصول، والوصول إلى حدود منخفضة من الكشف. ^6، هي ^{7 و 10 و 11} مختلفة انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA) المتاحة تجاريا وتمكن لتحليل عينات متعددة في وقت واحد على لوحة متعددة أيضا. يتكون الإجراء في خطوات التفاعل المتعاقبة التي يمكن أن يستغرق بضع ساعات. ويمكن الكشف عن المنتج النهائي من ردود الفعل البصري لتحديد تركيز جزيء الهدف على أساس منحنى المعايرة.

وتشمل الإجراءات SPE الكلاسيكية الماصة قبل تكييف، واستخراج عينة والغسيل والشطف، والتركيز عن طريق التبخر من شاطف. المذيبات المستخدمة للتخفيف من هذا المستخلص يتم اختياره تبعا لطريقة الكشف. للحصول على طرق المناعية، وكمية من المذيبات العضوية التأثيرات بشدة حساسية هذه الطريقة. ¹²

بالإضافة إلى الانتعاش والأداء ما قبل الاعتقال، يحتاج الأسلوب أيضا أن تكون بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. أتمتة الاجراءه يساعد على الحد من الأخطاء المتعلقة البشرية. في عملنا السابق ¹³ قدمنا ​​النموذج من أجل SPE الآلي، وتطبيق أسلوبنا في تحليل الهرمون الطبيعي 17β استراديول في عينات مياه البحر. مع الفيديو الحالي نود تسليط الضوء على المزايا التقنية من أسلوبنا مقارنة مع التقليدية خارج الخط وعلى الخط SPE، والتوافق خاص مع الكشف عن طريق تفاعلات المناعية. وصفنا بروتوكول تطبيقها على عينات المياه للكشف عن 17β استراديول. يتم تنفيذ SPE مع يتم تنفيذ octadecyl السيليكا (C18) المرحلة الماصة وشطف مع الميثانول المخفف.

Protocol

ملاحظة: يصف بروتوكول التالية إجراء SPE على 100 عينة مل من الماء مع C18 الماصة وشطف مع 50٪ ت / ت الميثانول. يتم تخفيف العينة المخصب لتصل الى 10٪ ت / ت الميثانول قبل التحليل مع انزيم مرتبط المناعي مقايسة (ELISA) عدة.

1. إعداد الكواشف

1. تحضير عينات المياه
   1. قبل أي خطوة أخرى، تصفية كل عينة 100 مل من الماء مع مرشحات حجم 0.2 ميكرون المسام.
   2. ارتفاع العينة مع التركيز المطلوب عن طريق تمييع حجم مناسب من حل إشارة إلى حجم المياه. على سبيل المثال، وإعداد 100 مل من عينة المياه مع 100 نانوغرام / L من E2 عن طريق تمييع 3.3 ميكرولتر من محلول إشارة E2 بتركيز 300 ميكروغرام / لتر. تمييع هذا الحل عشر مرات للحصول ارتفعت عينة مع 10 نانوغرام / L E2. تمييع هذا الأخير مرة أخرى العشر للحصول على عينة من 100 مل مع 1 نانوغرام / L E2.
   3. ضع العينة التي تمت تصفيتها (معدلة أو ارتفعت) في زجاجة مع GL45 الموضوع. استخدام عينة في نفس اليوم. أخذ جزء صغير ليتم تحليلها مع ELISA لتقدير تركيز الأولي.
2. إعداد 300 ميكرولتر من شاطف عن طريق تمييع الميثانول في دي المتأينة (DI-) المياه إلى 50٪ ت / ت في أنبوب ضيق.

2. إعداد العمود SPE

1. إعداد 20 ملغ / مل تعليق من الجسيمات octadecyl السيليكا المواد الماصة عن طريق إضافة ميكرولتر 1600 الأولى من الميثانول ثم 400 ميكرولتر من مياه دي إلى 40 ملغ من العكسي المرحلة الماصة. بإحكام إغلاق الغطاء وتستنهض الهمم مع دوامة.
2. تركيب غشاء أسفل في العمود
   1. اختر واحدا غشاء نايلون مع حجم المسام 11 ميكرون ووضعه على طبقة مزدوجة من النسيج مكافحة الغبار. مع 3 مم لكمة، وقطع اثنين من أجزاء صغيرة في الغشاء.
   2. انتزاع واحدة من الأغشية صغيرة مع نهاية مسطحة ملقط مرشح ووضعه على جانب واحد من العمود.
   3. المسمار الموصل مسطحة القاع مع أنبوب وتشديد. الغشاء هو نآه في المكان والمواد الماصة ويمكن أن يضاف بشكل آمن. رسم السهم على جثة لافتا عمود في نهاية حيث وضعت الغشاء.
3. إعداد العمود الماصة معبأة
   1. تأمين العمود على حامل مع سهم يشير نحو القاع. يجب تعيين العمود رأسيا وقت ممكن.
   2. إرفاق فارغة 10 مل حقنة القابل للتصرف في نهاية الأنبوب العمود، باستخدام موصلات لور للقفل.
   3. إعداد ماصة صغيرة مع طرف 20-200 ميكرولتر، ضبط مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر. ويتم تكييف هذا الشكل طرف ماصة لحجم العمود الماصة لتكون مستعدة. فإن الإجراء سيكون أكثر صعوبة مع نصائح ماصة أكبر مثل تلك التي استخدمت مع 1 مل الماصات.
   4. تستنهض الهمم تعليق الماصة مع دوامة، والماصة بسرعة 100 ميكرولتر في المركز على العمود. في حين حقن، نضح بلطف عن الحل pipetted الحوض الصغير الغشاء باستخدام الحقنة باليد الأخرى. في هذه الحاديالعمر، ويجب أن يكون الحل ملء الحقنة واضح من الجسيمات، ويمكن في نهاية المطاف أن تراعى سرير الجسيمات في العمود.
   5. كرر هذه العملية 2 مرات أكثر من تهييج تعليق الأسهم بين جميع الخطوات pipetting للضمان وقف متجانس من الجزيئات في الحل. العمود الناتج يحتوي على 6 ملغ من المواد الماصة.
   6. عندما تم تحميل 300 ميكرولتر من تعليق وتجفيفها بواسطة الشفط مع حقنة، والحفاظ على حقنة في موقف ووضع غشاء نايلون الثاني على رأس باستخدام ملقط مع جهة أخرى.
   7. برغي أسفل موصل الثاني مع أنبوب والتخلص الحقنة. العمود SPE جاهزا للاستخدام.

3. إعداد النظام

1. تشديد العمود SPE على الجهاز باستخدام موصلات لور للقفل. يجب أن يكون السهم الذي يشير إلى نفس اتجاه واحد هو مبين على الجهاز.
2. ربط زجاجة تحتوي العينة إلى الجهاز عن طريق الشدقدمت GL45 سلامة غطاء على ذلك.
3. تحميل 200 ميكرولتر من شاطف في الخزان "شاطف".
4. تحميل 800 ميكرولتر من مياه دي في الخزان "التخفيف".
5. ضع زجاجة عند مخرج النفايات لجمع المياه المعالجة خلال خطوة الاستخراج. الشكل ليس مهما ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة الحجم بما فيه الكفاية فيما يتعلق حجم العينة.
6. ضع قارورة صغيرة عند مخرج الاستشعار لديها القدرة حجم الحد الأدنى من 1.5 مل. وهناك أقصى حجم 1 مل تكون صغيرة جدا كما فقاعات ستشكل في هذا المنفذ عند جمع شاطف المخصب وعازلة التخفيف.
7. تحقق من منظم الضغط هو في موقف مغلقة بتحويلها يدويا، عكس اتجاه عقارب الساعة حتى مزيد من الحركة ليست ممكنة.

4. SPE مع النموذج

1. تشغيل النموذج عن طريق الضغط على زر على ظهره.
2. إعداد واجهة المستخدم واختيار البرنامج
   1. فتح واجهة المستخدم. اختارمنفذ الاتصال من الكمبيوتر الذي يتم توصيل الجهاز من القائمة، ثم انقر على زر "التالي".
   2. أدخل القيم 580 PSET و 30 لdpset. والمضخة ضبط للحفاظ على الضغط في نظام الضغط والخزانات في 580 ± 30 مليبار عند تشغيل.
   3. تحديد وضع الآلية.
   4. في الزاوية وضع الآلي، تحميل ملف البرنامج في "مسار ملف التكوين" مربع.
3. ضبط منظم ضغط
   1. بدء تشغيل المضخة.
   2. تحويل يدويا منظم الضغط حتى قيمة القراءة لPREG هو أدنى ولكن قريبة من 320 مليبار.
   3. إيقاف المضخة.
4. البدء في إجراء SPE
   1. اضغط على "بدء" في وضع زاوية الآلي. ومضخة التبديل على وسوف الاستخراج، وشطف وتخفيف الخطوات تتبع تلقائيا بعضها البعض. يتم تنفيذ الإجراء بأكمله لعينة 100 مل في 50 دقيقة.
   2. تحقق من قيمة PREG. يجب أن تكون في حدود 320-350 مليبار خلال خطوة الاستخراج لضمان معدل التدفق الأمثل.
   3. إغلاق قارورة صغيرة وتخزينها في 4-5 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل. تحليل أداء في 30 ساعة التالية لمنع تدهور الحليلة.
   4. التخلص من المياه المعالجة.
5. تنظيف النظام
   ملاحظة: بعد كل إجراء استخراج النظام يحتاج إلى تنظيفها لمنع انتقال التلوث.
   1. إعداد 10 مل من محلول الميثانول 70٪ ت / ت في زجاجة GL 45.
   2. افصل العمود SPE وتوصيل الأنابيب مع الموصلات.
   3. في وضع الآلي، حدد "تنظيف" الملف وتشغيله مع ضبط ضغط نفسها.

5. الكشف عن استراديول تركيز مع ELISA

1. إعداد العينات المعايرة مع تركيز على النحو المبين في بروتوكول المتوفرة مع عدة ELISA الذي يتم استخدامه. إعداد calibra واحدنشوئها مع مجموعة نفس المصفوفة كما العينة، ومعايرة مجموعة واحدة مع الميثانول 10٪ ت / ت.
2. الاستغناء عن المبلغ اللازم للعينة في الآبار على لوحة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام عينات المعايرة، وعينات المياه غير المعدلة وارتفعت التي تم تصفيتها لكن لم تتم معالجتها مع SPE، وإثراء العينات في الميثانول 10٪ ت / ت. استخدام 3 آبار في عينة للحد من الخطأ المرتبط الفحص.
3. اتبع مؤشرات على البروتوكول الذي يتم توفيرها مع عدة لإضافة المواد المتفاعلة، فترة حضانة والغسيل ومزيد من التفاعل مع الإنزيم.
4. قراءة إشارة ضوئية في كل بئر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة عدة مع أداة قارئ لوحة وجمع البيانات.
5. استخدام البرنامج للصك قارئ لوحة لتناسب منحنيات المعايرة وتحديد تركيز E2 في العينة الأولية مع نفس المصفوفة، والعينات المخصب مع الميثانول 10٪ ت / ت.

النتائج

تم تقييم استنساخ المواد الماصة التعبئة من قبل التجفيف والترجيح والمواد الماصة pipetted في قوارير زجاجية ويتم إظهار النتيجة في الشكل 1. استنساخ وقت الحقن تم اختباره لمدة 100 مل العينات، كما هو مبين في الشكل 2. التركيز في البداية ...

Discussion

واقترح طريقة جديدة لإعداد عينات من المياه تليها التحليل باستخدام المناعية. تمكن أداة لتنفيذ استخراج المرحلة الصلبة بطريقة مؤتمتة وسهلة الاستعمال.

الترشيح من عينة المياه قبل الحقن لها في النظام أمر بالغ الأهمية. فإن أي الجسيمات ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L