שיטה פשוטה למיצוי שלב המוצק האוטומטי של דגימות מים לניתוח החיסוני של מזהמים קטנים

Summary

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

שיטה חדשה להפקה מוצקה שלב (SPE) של דגימות מים סביבתיות מוצעת. אב הטיפוס שפותח הוא יעיל וחסכוני וידידותיות למשתמש, ומאפשר לבצע SPE מהיר, אוטומטי ופשוט. הפתרון מראש מרוכז תואם ניתוח על ידי immunoassay, עם תוכן ממס אורגני נמוך. שיטה מתוארת לחילוץ ומראש ריכוז של 17β-אסטרדיול הורמון טבעי במיליליטר 100 דגימות מים. שלב הפוך SPE מתבצע עם סופג octadecyl-סיליקה וelution נעשה עם 200 μl של מתנול 50% V / V. Eluent מדולל על ידי הוספת di-מים כדי להפחית את הכמות של מתנול. לאחר ההכנה ידנית עמודת SPE, ההליך הכולל מתבצע באופן אוטומטי בשעה 1. בסופו של התהליך, ריכוז אסטרדיול נמדד באמצעות assay מסחרי צמוד אנזים חיסוני-סופג (ELISA). טרום ריכוז של פי 100 מושגת ותוכן מתנול רק 10% V / V. החלמה מלאה של המולקולההם השיגו עם 1 ננוגרם / L ממוסמר דגימות מי ים דה מיוננים וסינתטיות.

Introduction

לדוגמא הכנה היא צעד חשוב בכל תהליך אנליטי. בפרט, הסרת אפקטי מטריקס, ההפחתה של הפרעות, והעשרה של אנליטי נחוצות כדי להשיג תוצאות מדויקות ולהגיע גבולות נמוכים של גילוי. תרכובות האנדוקרינית לשבש (EDCs) הן מדאיגות במיוחד בשל פעולתם באורגניזמים החיים, גם כאשר הרמות נמוכות מאוד בהווה בסביבה. 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי קיים בזיהום המים האיחוד האירופי רשימת מעקב ונוטה להוסיף לרשימה של חומרי עדיפות מוסדרים באירופה המים מסגרת ההוראה. מיצוי שלב מוצק (SPE) מיושם בדרך כלל לניתוח של מזהמים קטנים במים, עם שני הכימית ^1-5 (כרומטוגרפיה, ספקטרוסקופיית מסות) ושיטות זיהוי חיסוניות ^6-9. האחרון זכה להתעניינות בתחום הניטור סביבתי, כimmunoassays זמין במגוון רחב של פורמטים, הם ספציפיים לת"אאנליטי r קבל, ולהגיע לגבולות נמוכים של גילוי. ^{6, 7, 10, 11} מבחני שונים אנזים קשור immunosorbent (ELISA) זמינים מסחרי ולאפשר לנתח דגימות מרובות בבת אחת על צלחת רב גם. ההליך מורכב בצעדי תגובה רצופים שיכול לקחת כמה שעות. המוצר הסופי של תגובה יכול להיות מזוהה אופטי כדי לקבוע את הריכוז של מולקולת היעד המבוססת על עקומת כיול.

נהלי SPE קלאסיים כוללים סופג מראש אוויר, חילוץ מדגם, כביסה, elution, וריכוז על ידי אידוי של eluent. הממס המשמש לדילול של תמצית זו נבחר בהתאם לשיטת זיהוי. לשיטות חיסוניות, הסכום של השפעות ממס אורגניות מאוד את הרגישות של השיטה. ¹²

בנוסף להתאוששות וההופעות טרום ריכוז, השיטה גם צריכה להיות פשוט ועלות יעילה. אוטומציה של procedurדואר עוזר להפחית שגיאות הקשורות לאדם. בעבודה הקודמת שלנו ¹³ הצגנו אב הטיפוס שלנו לSPE האוטומטי, והשיטה שלנו הייתה מוחלת על הניתוח של 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי בדגימות מי ים. עם הווידאו הנוכחי ברצוננו להדגיש את היתרונות הטכניים של השיטה שלנו בהשוואה לoff-line מסורתי ועל שורת SPE, והתאימות המסוימת שלה עם זיהוי על ידי חיסוני תגובות. אנו מתארים את הפרוטוקול מיושם על דגימות מים לגילוי 17β-אסטרדיול. SPE מתבצע עם octadecyl-סיליקה שלב סופג (C18) וelution מתבצע עם מתנול המדולל.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את SPE בוצע על 100 מדגם מיליליטר מים עם סופג C18 וelution עם 50% מתנול V / V. המדגם המועשר מדולל להגיע 10% מתנול V / V לפני ניתוח עם אנזים קשור immunosorbent assay ערכה (ELISA).

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן את דגימות המים
   1. לפני כל צעד אחר, לסנן כל דגימת 100 מיליליטר מים עם מסנני גודל 0.2 מיקרומטר נקבובית.
   2. ספייק המדגם עם ריכוז רצוי על ידי דילול הנפח מתאים של פתרון התייחסות לכמות מים. לדוגמא, להכין של דגימת מים עם 100 L / ng של E2 100 מיליליטר ידי דילול 3.3 μl של פתרון התייחסות E2 בריכוז של 300 מיקרוגרם / ליטר. לדלל את הפתרון הזה עשר פעמים כדי לקבל מדגם ממוסמר עם 10 ng / L E2. לדלל אחרון זה עוד עשר פעמים כדי לקבל מדגם של 100 מיליליטר עם 1 ננוגרם / L E2.
   3. מניחים את המדגם המסונן (ללא שינוי או ממוסמר) בבקבוק זכוכית עם Gחוט L45. השתמש במדגם באותו היום. קח חלק קטן כדי להיות מנותח עם ELISA להעריך ריכוז ראשוני.
2. הכן 300 μl של eluent על ידי דילול מתנול במי דה מיונן (di-) 50% v / v בצינור הדוק.

2. הכנת טור SPE

1. הכן 20 מ"ג / מיליליטר השעיה של חלקיקים סופגים octadecyl-סיליקה ידי הוספת 1,600 μl הראשון של מתנול ולאחר מכן 400 μl של di-מים עד 40 מ"ג של סופג שלב הפוך. חוזקה לסגור את המכסה ולהתסיס עם מערבולת.
2. התקנת הקרום התחתון בעמודה
   1. בחר קרום ניילון אחד עם הגודל נקבובית 11 מיקרומטר ולמקם אותו בשכבה כפולה של רקמות נגד אבק. עם אגרוף קוטר 3 מ"מ, לחתוך שני חלקים קטנים בקרום.
   2. תפוס את אחד מהקרומים הקטנים עם מלקחיים מסנן שטוח סוף ומניח אותו בצד אחד של הטור.
   3. הברג את המחבר שטוח תחתון עם הצינור ולהדק. הקרום הוא now במקום וניתן להוסיף סופג באופן מאובטח. צייר חץ בגוף של ההצבעה הטור לקראת הסוף שבו הקרום הוצב.
3. הכנת הטור הסופג ארוז
   1. אבטח את הטור על בעל עם החץ מצביע לכיוון החלק התחתון. העמודה חייבת להיות מוגדרת כאנכי ככל האפשר.
   2. צרף ריק 10 מיליליטר מזרק חד פעמי לסוף הצינור של הטור, באמצעות המחברים luer הנעילה.
   3. הכן מיקרו-פיפטה עם קצה 20-200 μl, להגדיר את הנפח ל -100 μl. פורמט קצה פיפטה זה מותאם לגודל של העמודה הסופגת להיות מוכנות. ההליך יהיה קשה יותר עם טיפים פיפטה גדולים כגון אלה המשמשים עם 1 מיליליטר טפטפות.
   4. להתסיס את ההשעיה הסופגת עם מערבולת, ומהירות pipet 100 μl במרכז בטור. בעוד הזרקה, לשאוב בעדינות כל פתרון pipetted שוקת הקרום באמצעות המזרק ביד השנייה. ברחוב זהגיל, הפתרון מילוי המזרק צריך להיות ברור של חלקיקים, וחלקיקי מיטת סופו של דבר יכולה להיות שנצפה בעמודה.
   5. חזור על תהליך זה פי 2 יותר על ידי התססה מניית ההשעיה בין כל הצעדים על מנת להבטיח pipetting השעיה הומוגנית של החלקיקים בתמיסה. הטור וכתוצאה מכיל 6 מ"ג של סופג.
   6. כאשר 300 μl של השעיה הוטענו ומיובש על ידי aspirating עם המזרק, לשמור את המזרק בעמדה ולמקם את קרום ניילון השני בחלק העליון על ידי שימוש במלקחיים ביד השנייה.
   7. לדפוק את המחבר השני עם צינור ולהשליך את המזרק. טור SPE מוכן לשימוש.

3. הכנת המערכת

1. הדק את טור SPE במכשיר על ידי שימוש במחברי luer הנעילה. החץ חייב להיות מצביע לאותו כיוון כמו זה שמוצג על המכשיר.
2. חבר את הבקבוק המכיל את המדגם למכשיר על ידי ההברגהסיפק כובע בטיחות GL45 על זה.
3. לטעון 200 μl של eluent במאגר 'eluent'.
4. עומס 800 μl של di-מים במאגר "הדילול".
5. הנח בקבוק ביציאת הפסולת כדי לאסוף את המים מעובד במהלך שלב חילוץ. הפורמט הוא לא חשוב, אבל הנפח צריך להיות מספיק גדול ביחס לנפח הדגימה.
6. הנח בקבוקון קטן ביציאת החיישן עם קיבולת הנפח המינימלית של 1.5 מיליליטר. נפח מרבי של 1 מיליליטר יהיה קטן מדי כבועות יהוו בשקע זה בעת איסוף eluent המועשר וחיץ דילול.
7. ודא וסת הלחץ היא במצב סגור על ידי הפיכתו באופן ידני, להפוך כיוון השעון עד תנועה נוספת אינה אפשרית.

SPE 4. עם אבטיפוס

1. הפעל את אב הטיפוס על ידי לחיצה על הכפתור בצד האחורי.
2. הכנת ממשק המשתמש ובחירת התכנית
   1. פתח את ממשק המשתמש. בחריציאת התקשורת של המחשב שאליו המכשיר מחובר מהרשימה, ולחץ על הכפתור "הבא".
   2. הזן את הערכים 580 לpset ו -30 לdpset. המשאבה תתאים לשמירה על לחץ במערכת ומאגרי הלחץ ב580 ± 30 mbar בעת הפעלה.
   3. בחר את המצב האוטומטי.
   4. בפינת המצב האוטומטית, לטעון את קובץ התכנית ב'נתיב קובץ התצורה "תיבה.
3. התאמת וסת הלחץ
   1. התחל המשאבה.
   2. הפעל ידני את וסת הלחץ עד הערך לקרוא לpreg הוא נחותה, אבל קרוב ל -320 mbar.
   3. עצור את המשאבה.
4. החל הליך SPE
   1. "התחל" לחץ בפינת המצב האוטומטית. המשאבה תעבור על והצעדים חילוץ, elution ודילול באופן אוטומטי לעקוב אחרי זה. ההליך כולו למדגם 100 מיליליטר מתבצע ב -50 דק '.
   2. ודא את הערך של preg. זה חייב להיות בטווח 320 - 350 mbar במהלך שלב החילוץ כדי להבטיח ספיקה אופטימלית.
   3. סגור את הבקבוקון הקטן וחנות ב 4-5 מעלות צלזיוס בחושך עד לניתוח. ביצוע ניתוח בשעה 30 הבאה כדי למנוע השפלה של אנליטי.
   4. השלך את המים מעובד.
5. ניקוי המערכת
   הערה: לאחר כל הליך חילוץ המערכת צריכה לנקות כדי למנוע זיהום צולב.
   1. הכן פתרון 10 מיליליטר של מתנול 70% v / v בבקבוק זכוכית 45 GL.
   2. נתק את טור SPE ולחבר את צינורות עם מחברים.
   3. במצב האוטומטי, בחר את קובץ 'הניקוי' ולהפעיל אותו עם אותו הגדרות לחץ.

5. איתור של ריכוז אסטרדיול עם ELISA

1. הכן את דגימות כיול עם ריכוזים כמפורט בפרוטוקול מצורף לערכת ELISA המשמשת. הכן calibra אחדtion להגדיר באותה מטריצה ​​כמדגם, וכיול אחת להגדיר עם מתנול 10% V / V.
2. לוותר את הסכום הדרוש של מדגם בבארות בצלחת, על פי הוראות יצרן. השתמש בדגימות כיול, דגימות מים ללא שינוי וממוסמרים שסוננו אבל לא מעובד עם SPE, והעשירו את הדגימות במתנול v 10% / V. השתמש 3 בארות לדגימה כדי להפחית את השגיאה הקשורים לassay.
3. בצע את הסימנים של הפרוטוקול המסופק בערכה לתוספת של מגיבים, זמן דגירה, כביסה ותגובה נוספת עם האנזים.
4. קראו את האות האופטי בכל טוב על פי הוראות יצרן הערכה עם מכשיר צלחת קורא ולאסוף את הנתונים.
5. השתמש בתוכנה של מכשיר צלחת הקורא כדי להתאים את עקומות הכיול ולקבוע את ריכוז E2 במדגם הראשוני עם אותו המטריצה, ובדגימות מועשרים עם מתנול 10% נ / נ.

תוצאות

שחזור של אריזה סופגת הוערך על ידי ייבוש ושקלול הסופג pipetted בבקבוקוני זכוכית והתוצאה מוצגת באיור 1. שחזור של זמן הזרקה נבדקה עבור דגימות 100 מיליליטר, כפי שמוצגת באיור 2. ריכוז ובראשוני מראש מרוכז ממוסמר דגימות נקבעו על ידי שימוש בערכת...

Discussion

שיטה חדשה להכנת דגימות מים ואחריו ניתוח באמצעות immunoassay הוצעה. המכשיר מאפשר לבצע מיצוי שלב מוצק בצורה אוטומטית וידידותי למשתמש.

הסינון של דגימת המים לפני הזרקתו למערכת הוא קריטי. כל חלקיקים שעדיין קיימים בפתרון היה פוטנציאל לגרום...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L