Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l'analisi immunologiche di piccole inquinanti

Riepilogo

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

Si propone un nuovo metodo per l'estrazione in fase solida (SPE) di campioni di acqua ambientale. Il prototipo sviluppato è conveniente e facile da usare, e consente di eseguire un rapido, automatizzato e semplice SPE. La soluzione pre-concentrata è compatibile con l'analisi mediante immunodosaggio, con un basso contenuto di solvente organico. Un metodo è descritto per l'estrazione e pre-concentrazione di ormone naturale 17β-estradiolo in 100 ml campioni di acqua. Fase inversa SPE viene eseguita con sorbente ottadecil-silice e eluizione avviene con 200 ml di metanolo al 50% v / v. Eluente viene diluito con l'aggiunta di acqua per abbassare la quantità di metanolo. Dopo aver preparato manualmente colonna SPE, la procedura generale viene eseguita automaticamente entro 1 ora. Al termine del processo, la concentrazione di estradiolo è misurato utilizzando un commerciale immuno-adsorbente assay enzimatico (ELISA). 100 volte pre-concentrazione si ottiene e il contenuto di metanolo in solo il 10% v / v. Recuperi completi della molecolavengono raggiunti con 1 ng / L spillo campioni deionizzata e sintetici acqua di mare.

Introduzione

La preparazione del campione è un passo importante in ogni processo di analisi. In particolare, la rimozione degli effetti matrice, diminuzione delle interferenze e arricchimento dell'analita sono necessari per ottenere risultati precisi e raggiungere limiti di rilevabilità. Sistema endocrino composti (IE) sono di particolare interesse per la loro azione su organismi viventi, anche quando presenti a livelli molto bassi per l'ambiente. L'ormone naturale 17β-estradiolo è presente sul inquinamento delle acque dell'UE selezione e soggetto ad essere aggiunto alla lista delle sostanze prioritarie disciplinati dalla direttiva quadro sulle acque europee. Estrazione in fase solida (SPE) è comunemente applicato per l'analisi di piccole inquinanti in acqua, sia chimica ^1-5 (cromatografia, spettrometria di massa) e immunologici ^6-9 metodi di rilevamento. Quest'ultimo ha guadagnato interesse nel campo del monitoraggio ambientale, come saggi immunologici sono disponibili in un'ampia varietà di formati, sono specifici per la taanalita rget, e raggiungere limiti di rilevabilità. ^{6, 7, 10, 11} Vari Enzyme Linked immunoassorbimento (ELISA) sono commercialmente disponibili e consentono di analizzare più campioni contemporaneamente su una piastra multi-pozzo. La procedura consiste in fasi successive di reazione che possono prendere un paio d'ore. Il prodotto finale di reazione può essere rilevato otticamente per determinare la concentrazione della molecola bersaglio sulla base di una curva di calibrazione.

Procedure SPE Classical includono sorbente pre-condizionamento, dell'estrazione del campione, lavaggio, eluizione e concentrazione per evaporazione dell'eluente. Il solvente utilizzato per la diluizione di questo estratto è scelto in funzione del metodo di rilevamento. Per i metodi immunologici, la quantità di solvente organico influenze fortemente la sensibilità del metodo. ¹²

Oltre al recupero e le prestazioni pre-concentrazione, il metodo deve anche essere semplice ed economicamente conveniente. Automazione dei SEGUIRE IL PROCEDIMENTOe aiuta a ridurre gli errori umani legati. Nel nostro lavoro precedente ¹³ abbiamo introdotto il nostro prototipo per SPE automatizzata, e il nostro metodo è stato applicato all'analisi della ormone naturale 17β-estradiolo in campioni di acqua di mare. Con la presente il video che vorremmo evidenziare i vantaggi tecnici del nostro metodo rispetto alle tradizionali off-line e on-line SPE, e la sua particolare compatibilità con rilevamento da immuno-reazioni. Descriviamo il protocollo applicato ai campioni di acqua per la rilevazione di 17β-estradiolo. SPE viene eseguita con octadecil-silice (C18) Fase sorbente e eluizione viene eseguita con metanolo diluito.

Protocollo

Nota: Il protocollo seguente descrive la SPE effettuato su 100 ml del campione d'acqua con C18 sorbente e eluizione con 50% v / v di metanolo. Il campione arricchito viene diluita a raggiungere il 10% v / v di metanolo prima analisi con un enzima linked immunosorbent assay (ELISA) Kit.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare i campioni di acqua
   1. Prima di qualsiasi altro passo, filtrare ogni campione di 100 ml di acqua con filtri a 0,2 micron di dimensione dei pori.
   2. Additiva con concentrazione desiderata diluendo il volume appropriato di soluzione di riferimento in un volume di acqua. Ad esempio, preparare 100 ml di campione con 100 ng / L di E2 diluendo 3,3 ml di soluzione di riferimento E2 ad una concentrazione di 300 mg / L. Diluire questa soluzione dieci volte per ottenere un campione a spillo con 10 ng / L E2. Diluire quest'ultima altri dieci volte per ottenere un campione di 100 ml con 1 ng / L E2.
   3. Collocare il campione filtrato (non modificato o spillo) in una bottiglia di vetro con GFilo L45. Utilizzare l'esempio lo stesso giorno. Prendere una piccola frazione da analizzare con il test ELISA per stimare concentrazione iniziale.
2. Preparare 300 ml di eluente diluendo in metanolo (di-) acqua deionizzata al 50% v / v in un tubo stretto.

2. Preparazione della colonna SPE

1. Preparare a 20 mg / ml sospensione di particelle adsorbenti ottadecil-silice aggiungendo primi 1.600 ml di metanolo e poi 400 ml di acqua demineralizzata a 40 mg di sorbente in fase inversa. Strettamente chiudere il coperchio e agitare con un vortice.
2. Installazione della membrana inferiore della colonna
   1. Seleziona una membrana di nylon con dimensione dei pori 11 micron e metterlo su un doppio strato di tessuto anti-polvere. Con un diametro del punzone 3 mm, tagliare due piccole parti nella membrana.
   2. Afferrare una delle piccole membrane con TV a fascia pinza filtra e posizionarlo su un lato della colonna.
   3. Avvitare il connettore a fondo piatto con il tubo e stringere. La membrana è now nel luogo e l'assorbente può essere aggiunto in modo sicuro. Disegnare una freccia sul corpo della colonna di puntamento verso la fine dove è stata posta la membrana.
3. Preparazione della colonna assorbente imballato
   1. Fissare la colonna a supporto con la freccia rivolta verso il basso. La colonna deve essere impostato più verticale possibile.
   2. Attaccare un vuoto 10 ml siringa monouso all'estremità del tubo della colonna, utilizzando i connettori Luer-Lock.
   3. Preparare un micro-pipetta con una punta di 20-200 microlitri, impostare il volume di 100 l. Questo formato puntale viene adattata alle dimensioni della colonna sorbente essere preparati. La procedura sarebbe più difficile con punte per pipette più grandi, come quelli usati con 1 ml pipette.
   4. Agitare la sospensione sorbente con un vortice, e rapidamente pipettare 100 microlitri al centro della colonna. Mentre l'iniezione, aspirare delicatamente tutta la soluzione pipettato trogolo membrana utilizzando la siringa con l'altra mano. A questo stl'età, la soluzione di riempimento della siringa deve essere libera da particelle, e un letto particella può eventualmente essere osservata nella colonna.
   5. Ripetere questa operazione altre 2 volte agitando la sospensione di scorta tra tutti fasi di pipettamento per garantire la sospensione omogenea delle particelle nella soluzione. La colonna risultante contiene 6 mg di assorbente.
   6. Quando i 300 ml di sospensione sono stati caricati ed essiccato aspirando con la siringa, tenere la siringa in posizione e posizionare la seconda membrana di nylon sulla parte superiore usando le pinze con l'altra mano.
   7. Avvitare il secondo connettore con il tubo e smaltire la siringa. La colonna SPE è pronto all'uso.

3. Preparazione del sistema

1. Serrare colonna SPE il dispositivo utilizzando i connettori Luer-Lock. La freccia deve puntare nella stessa direzione come quella mostrata sul dispositivo.
2. Collegare la bottiglia contenente il campione al dispositivo avvitando ilprevisto tappo di sicurezza GL45 su di esso.
3. Carico 200 ml di eluente nel serbatoio 'Eluente'.
4. Carico 800 ml di di-acqua nel serbatoio 'diluizione'.
5. Posizionare una bottiglia all'uscita rifiuti per raccogliere l'acqua elaborati durante fase di estrazione. Il formato non è importante, ma il volume deve essere sufficientemente grande per quanto riguarda il volume del campione.
6. Mettere una piccola fiala all'uscita sensore con capacità minima volume di 1,5 ml. Un volume massimo di 1 ml sarà troppo piccolo come le bolle si formano in questo sbocco al momento del ritiro eluente arricchito e tampone di diluizione.
7. Verificare il regolatore di pressione è in posizione chiusa ruotando manualmente, reverse-orario fino ulteriore movimento non è possibile.

4. SPE con il Prototype

1. Accendere il prototipo premendo il pulsante sul retro.
2. Preparare l'interfaccia utente e selezionando il programma
   1. Aprire l'interfaccia utente. Selezionarela porta di comunicazione del computer a cui il dispositivo è collegato dalla lista, e fare clic sul pulsante 'Avanti'.
   2. Immettere i valori per 580 pset e 30 per dpset. La pompa regolerà per mantenere la pressione nel sistema di pressione e serbatoi a 580 ± 30 mbar durante l'esecuzione.
   3. Selezionare la modalità automatica.
   4. Nell'angolo modalità automatica, caricare il file di programma nel 'percorso del file di configurazione' scatola.
3. Regolazione del regolatore di pressione
   1. Avviare la pompa.
   2. Attivare manualmente il regolatore di pressione fino a quando il valore letto per preg è inferiore ma vicino a 320 mbar.
   3. Fermare la pompa.
4. Avvio della procedura di SPE
   1. Premere 'start' nell'angolo modalità automatica. La pompa si accenderà e le fasi di estrazione, eluizione e diluizione seguirà automaticamente l'un l'altro. L'intera procedura per un campione di 100 ml viene eseguita in 50 min.
   2. Verificare il valore di preg. Deve essere compreso nell'intervallo 320 - 350 mbar durante la fase di estrazione per garantire una portata ottimale.
   3. Chiudere la piccola fiala e conservare a 4-5 ° C al buio fino al momento dell'analisi. Effettuare analisi nella seguente 30 ore per impedire la degradazione dell'analita.
   4. Smaltire l'acqua trattata.
5. Pulizia del sistema
   Nota: Al termine di ogni procedura di estrazione del sistema deve essere pulito per evitare la contaminazione incrociata.
   1. Preparare una soluzione di 10 ml di metanolo 70% v / v in una bottiglia di vetro GL 45.
   2. Scollegare colonna SPE e collegare il tubo di connettori.
   3. In modalità automatica, selezionare il file 'pulizia' e avviarlo con impostazioni di pressione stessi.

5. Individuazione di Estradiolo Concentrazione con ELISA

1. Preparare i campioni di calibrazione con concentrazioni come indicato nel protocollo fornito con il kit ELISA utilizzato. Preparare uno calibrazione impostato con la stessa matrice del campione, e un set di calibrazione con metanolo 10% v / v.
2. Dispensare la quantità necessaria di campione nei pozzetti sulla piastra, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare campioni di calibrazione, campioni di acqua non modificati e spillo che sono stati filtrati, ma non trattati con SPE, e arricchito i campioni in metanolo 10% v / v. Utilizzare 3 pozzetti per campione per ridurre l'errore associato con il test.
3. Seguire le indicazioni del protocollo fornito con il kit per l'aggiunta dei reagenti, tempo di incubazione, lavaggio e ulteriore reazione con l'enzima.
4. Leggere il segnale ottico in ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore corredo con uno strumento lettore di piastre e raccogliere i dati.
5. Utilizzare il software dello strumento lettore di piastre per adattarsi alle curve di calibrazione e determinare la concentrazione di E2 nel campione iniziale con stessa matrice, e nei campioni arricchiti con metanolo 10% v / v.

Risultati

Riproducibilità dell'imballaggio sorbente è stata valutata con l'essiccazione e la ponderazione del sorbente pipettato in flaconcini di vetro ed il risultato è mostrato in Figura 1. Riproducibilità del tempo di iniezione è stato testato per 100 ml di campioni, come mostrato nella Figura 2. Concentrazione iniziale e pre concentrato spillo campioni sono stati determinati utilizzando un kit ELISA commerciale pe...

Discussione

È stato proposto un nuovo metodo per la preparazione dei campioni di acqua seguita da analisi mediante immunodosaggio. Lo strumento permette di eseguire l'estrazione in fase solida in modo automatizzato e facile da usare.

La filtrazione del campione di acqua prima della sua iniezione nel sistema è critica. Eventuali particelle ancora presenti nella soluzione potrebbe potenzialmente causare l'intasamento della rete fluidica e ostacolare colonna SPE. Un altro passo importante è la p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L