Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

Özet

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Özet

Çevre su numunelerinin katı faz ekstraksiyonu (SPE) için yeni bir yöntem önerilmiştir. Geliştirilen prototip maliyet-etkin ve kullanıcı dostu ve hızlı otomatik ve basit SPE gerçekleştirmenizi sağlar. Önceden konsantre edilmiş çözelti, düşük bir organik çözücü içeriğine sahip immunodeney ile analiz ile uyumludur. Bir yöntem olup 100 mL su örneklerinde doğal hormon 17β-estradiol ekstraksiyonu ve konsantrasyonu için önceden tarif edilmiştir. Ters faz SPE oktadesil- silis sorbent ile gerçekleştirilir ve elüsyon metanol 50% v / v, 200 ul ile yapılır. Elüent metanol miktarı azaltmak için, di-su eklenerek seyreltilmiştir. El SPE sütunu hazırladıktan sonra, genel işlem 1 saat içinde otomatik olarak gerçekleştirilir. İşlemin sonunda, östradiol konsantrasyonu, ticari bir enzim-bağlantılı bağışıklık-sorbent deneyi (ELISA) kullanılarak ölçülmüştür. 100-kat ön konsantrasyonu elde edilir ve yalnızca 10% v / v metanol içeriği. Molekülün tam geri kazanım1 ng ile elde edilir / L-de iyonize ve sentetik deniz suyu örnekleri çivili.

Giriş

Numune hazırlama herhangi bir analitik sürecinde önemli bir adımdır. Özel olarak, matriks etkileri, etkileşimleri azalmasını ve analit zenginleştirilmesi kaldırılması kesin sonuçlar elde edilir ve algılama düşük sınırları ulaşmak için gereklidir. Endokrin bozucu bileşikler (EDCs) nedeniyle canlı organizmalar üzerindeki etkisine özellikle kaygı olduğunda bile çevrede bulunan çok düşük seviyeleri. Doğal hormon 17β-östradiol Avrupa Su Çerçeve Direktifi kapsamında düzenlenen öncelikli maddeler listesine eklenecek AB su kirliliği İzleme Listesi mevcut ve eğilimli. Katı faz ekstraksiyonu (SPE), genel olarak, her iki kimyasal ^1-5 (kromatografısi, kütle spektrometrisi) ile immünolojik ^6-9 tespit yöntemleri ile, su içinde, küçük kirletici analizi için tatbik edilir. İkincisi immünoanalizler, formatlarda çok çeşitli mevcuttur ta özgü olarak, çevresel izleme alanındaki ilgisini kazanmıştıranalit rYer ve algılama düşük sınırlara ulaşır. ^{6, 7, 10, 11} Çeşitli enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ticari olarak temin edilebilir ve çok oyuklu bir plaka üzerinde aynı anda birden fazla numune analiz için olanak sağlar. İşlem birkaç saat sürebilir ardışık reaksiyon adımlarla oluşur. Reaksiyonun Nihai ürün kalibrasyon eğrisine göre hedef molekülün konsantrasyonunu belirlemek için, optik olarak tespit edilebilir.

Klasik SPE prosedürler eluent buharlaştırma ile sorbent ön kurutma, örnek ekstraksiyon, yıkama, elüsyon ve konsantrasyonu içerir. Bu ekstrenin seyreltme için kullanılan çözücü, algılama yöntemine bağlı olarak seçilir. Immünolojik yöntemler için, güçlü organik çözücü etkilere yöntemin duyarlılığı miktarı. ¹²

Kurtarma ve ön konsantrasyonu performansları ek olarak, yöntem, aynı zamanda, basit olabilir ve maliyet etkin gerekmektedir. Prosedüründe otomasyonue insan ile ilgili hataları azaltmaya yardımcı olur. Daha önceki çalışmalarında ¹³ biz otomatik SPE için prototip tanıttı ve bizim yöntem deniz suyu örneklerinde doğal hormon 17β-östradiol analizi uygulanmıştır. Mevcut videoda biz SPE ve bağışıklık reaksiyonları ile algılama ile kendi özel uyumluluk geleneksel off-line ve on-line karşılaştırıldığında bizim yöntemin teknik avantajları vurgulamak istiyorum. Bu 17β-estradiyol tespiti için su numuneye uygulanan protokol açıklar. SPE oktadesil-silis (C18) sorbent faz ve elüsyon seyreltilmiş metanol ile yerine getirilmiştir gerçekleştirilir.

Protokol

Not: Aşağıdaki protokol SPE% 50 h / h metanol ile C18 sorbent ve elüsyon ile 100 ml su numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştir açıklanmaktadır. Zenginleştirilmiş örneği (ELISA) kiti linked immunosorbent bir enzim ile analizden önce,% 10 hac / hac metanol ulaşmak için seyreltilmiştir.

1. Reaktifleri hazırlanması

1. Su örnekleri hazırlayın
   1. Önceki herhangi bir başka aşamasına, 0.2 um gözenek boyutlu filtreler ile, her 100 ml su örneği filtre.
   2. Bir su hacmi içine bir referans çözeltisi uygun hacimde seyreltilerek istenen konsantrasyona sahip örnek başak. Örneğin, 300 mg / L'lik bir konsantrasyonda E2 referans çözeltisinin 3,3 ul seyreltilmesiyle E2 100 ng / L su numunesi 100 ml hazırlanır. Bir örnek 10 ng / L E2 ile çivili almak için bu çözüme on kez sulandırmak. 1 ng / L E2 ile 100 ml 'lik bir numune elde etmek için bu ikinci bir on kat seyreltilir.
   3. G, bir cam şişe içinde (modifiye edilmemiş veya kirpi), süzüldü örnek yerleştirinL45 konu. Aynı gün numune kullanılır. Küçük bir bölümünü alın başlangıçtaki konsantrasyon tahmin etmek ELISA ile analiz edilecek.
2. Sıkı bir tüp içinde 50% v / v deiyonize (di) su içinde metanol ile elüsyon seyreltilerek 300 ul hazırlayın.

SPE Column 2. Hazırlık

1. İlk metanol 1600 ul ve ardından ters fazlı sorbent 40 mg di-su 400 ul ekleyerek oktadesil- silis sorbent partikülleri bir 20 mg / ml süspansiyon hazırlayın. Sıkıca kapağını kapatın ve bir girdap ile çalkalayın.
2. Sütununda taban zarı takılması
   1. Gözenek büyüklüğü 11 mikron ile tek Naylon membran seçin ve anti-toz dokusunun çift kat üzerine yerleştirin. 3 mm çaplı zımba ile, zarın iki küçük parça kesin.
   2. Düz uç filtre forseps küçük membran tut ve kolonun bir tarafına yerleştirin.
   3. Tüp düz taban konnektörü Vida ve sıkın. Membran nakış ve yerinde güvenli bir şekilde sorbent eklenebilir. Membran yerleştirildi nerede sonlarına doğru sütun işaret gövdesi üzerinde bir ok çizin.
3. Paketlenmiş sorbent sütun hazırlanması
   1. Dibe doğru okun tutucuya sütun sabitleyin. Sütun dikey olarak mümkün olduğu ayarlanmalıdır.
   2. Luer-Lock bağlayıcıları kullanarak sütun borusunun ucuna boş 10 ml tek kullanımlık şırınga takın.
   3. Bir 20-200 ul ucu ile bir mikro-pipet hazırlayın 100 ul seviyesini ayarlamak. Bu pipet ucu biçimi hazırlanacak emici sütunun büyüklüğüne uyarlanır. Prosedür böyle 1 ml pipetler ile kullanılan olanlar gibi büyük pipet uçları ile daha zor olacaktır.
   4. Bir girdap ile sorbent süspansiyon ajite ve hızla sütun üzerinde merkezde 100 ul pipetlemeyin. Enjekte ederken, aspire nazikçe tüm Pipetlenen çözüm Öte yandan şırıngayı kullanarak zarı yalak. Bu st atyaş, şırınga doldurma çözeltisi parçacıkların açık olmalıdır ve parçacık yatağı sonunda sütununda görülmektedir.
   5. Çözeltide parçacıkların homojen süspansiyon sağlamak için bütün pipetleme adımları arasındaki stok süspansiyon çalkalayarak bu işlemi 2 kez daha tekrarlayın. Ortaya çıkan kolon sorbent 6 mg içerir.
   6. Süspansiyon 300 ul yüklendi ve şırınga ile aspire kurutuldu edildiğinde, pozisyonda şırınga tutmak ve diğer elle forseps kullanılarak üstüne ikinci naylon membran yerleştirin.
   7. Tüp ile ikinci konektörü aşağı Vida ve şırınga atmayın. SPE sütunu kullanıma hazırdır.

3. Hazırlama Sistemi

1. Luer-Lock konnektörleri kullanarak cihaz üzerinde SPE sütunu sıkın. Ok cihaz üzerinde gösterilen biri olarak aynı yöne işaret olmalıdır.
2. Vidalama cihaza örneğini içeren şişeyi bağlayınBunun üzerine GL45 emniyet kapağını sağladı.
3. 'Yıkama sıvısı' rezervuar içinde eluent 200 ul yükleyin.
4. Yük 'Sulandırma' rezervuar di-su 800 ul.
5. Ekstraksiyon aşamasında işlenmiş suyu toplamak için atık çıkışında bir şişe yerleştirin. Biçimi önemli değildir, ancak birim numune hacmi ile ilgili olarak yeterince büyük olması gerekir.
6. 1,5 ml minimum hacim kapasiteli algılayıcı çıkışın küçük bir şişe yerleştirin. Zenginleştirilmiş yıkama sıvısı ve seyreltme tamponu toplarken baloncuklar bu çıkışında oluşturacak şekilde 1 ml maksimum hacmi çok küçük olacaktır.
7. Basınç regülatörü elle döndürerek kapalı konumda olduğunu kontrol edin, ters saat yönünde daha fazla hareket etmesi mümkün değildir kadar.

Prototip 4. SPE

1. Arkasındaki düğmeye basarak prototip açın.
2. Kullanıcı arayüzü hazırlama ve programı seçerek
   1. Kullanıcı arabirimini açın. SeçinBilgisayarın iletişim portu hangi cihaz listeden bağlı ve düğme 'İleri' tıklayın olduğu.
   2. Değerleri pset 580 ve dpset 30 girin. Pompa çalışırken 580 ± 30 mbar'da basınçlı sistem ve rezervuarlarda basıncı korumak için ayarlayacaktır.
   3. Otomatik modu seçin.
   4. Otomatik mod köşesinde, kutu 'yapılandırma dosyası yolu' program dosyası yüklenemedi.
3. Basınç regülatörü ayarlanması
   1. Pompayı başlatın.
   2. Süleyman Demirel için okunan değer aşağı ama 320 mbar yakın kadar elle basınç regülatörü çevirin.
   3. Pompayı durdurun.
4. SPE işlemi başlatılıyor
   1. Otomatik mod köşesinde Basın 'başlangıç'. Pompa açılacaktır ve çıkarma, ayrıştırma ve seyreltme adımlar otomatik olarak birbirini takip edecektir. 100 ml'lik bir örnek için bütün işlem 50 dakika içinde gerçekleştirilir.
   2. Süleyman Demirel değerini doğrulayın. Uygun bir akış oranını sağlanması için ekstraksiyon aşaması esnasında 350 mbar - Bu aralık 320 olmalıdır.
   3. Analize kadar karanlıkta 4-5 ° C'de küçük şişe ve mağaza kapatın. Analitin bozulmasını önlemek için aşağıdaki 30 saat içinde analiz gerçekleştirin.
   4. İşlenmiş su imha ediniz.
5. Sisteminin temizlenmesi
   Not: Sistem gereken her ekstraksiyon işlemi çapraz bulaşmayı önlemek için temizlenmesi sonra.
   1. GL 45 bir cam şişeye, metanol 70% v / v, 10 ml çözelti hazırlayın.
   2. SPE sütunu çekin ve konnektörleri ile tüp takın.
   3. Otomatik modda, 'temizlik' dosyasını seçin ve aynı basınç ayarları ile başlatın.

ELISA ile Estradiol Konsantrasyon 5. Algılama

1. Kullanılan ELISA kit ile birlikte verilen protokol içerisinde belirtilen konsantrasyonlarda kalibrasyon numuneleri hazırlayın. Tek Calibra hazırlayınmetanol,% 10 v / v ayarlanır, aynı örnek olarak matris ve bir kalibrasyon ile ayarlanır tion.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, levha üzerindeki kuyu numunenin gerekli miktarda koyun. Kalibrasyon numuneleri, filtre edildi, ancak metanol 10% v örnekleri SPE ile işlenir ve zenginleştirilmiş değil, değişikliğe uğratılmamış ve kirpi su numuneleri kullanarak / h. Tahlil ile ilişkili hatayı azaltmak için numune başına 3 kuyu kullanın.
3. Enzim ile reaktiflerin eklenmesi için kit, inkübasyon süresi, yıkama ve başka reaksiyon ile sağlanan protokol endikasyonları izleyin.
4. Bir plaka okuyucusu aletle kit üreticisinin talimatlarına göre her kuyuda optik sinyalin okuma ve verileri toplar.
5. Metanol,% 10 v zenginleştirilmiş örnekleri kalibrasyon eğrileri uygun aynı matrisin ile ilk numunedeki E2 konsantrasyonunu belirlemek, ve plaka okuyucusu aletin yazılımını kullanarak / h.

Sonuçlar

Sorbent ambalaj tekrarlanabilirliği kurutma ile değerlendirildi ve cam viyaller içinde pipetlendi sorbentin ağırlık ve ilk ve pre Şekil 2. Konsantrasyon gösterildiği gibi sonuç, 100 mi örnekler için test edildi enjeksiyonu sırasında Şekil 1. Tekrarlanabilirliği de gösterilmiştir edildi Konsantre örnekleri 17β-estradiol için ticari bir ELISA kiti kullanılarak tespit edilmiş ve Şekil 3'te gösterilmektedir çivi...

Tartışmalar

Immünolojik test kullanılarak analiz ve ardından su örneklerinin hazırlanması için yeni bir yöntem önerilmiştir. Enstrüman otomatik ve kullanıcı dostu bir şekilde katı faz ekstraksiyon gerçekleştirmenizi sağlar.

Sistem üflenmeden önce su numunesi filtrasyon kritiktir. Çözelti içinde hala mevcut herhangi bir parçacık potansiyel olarak akışkan ağ tıkar ve SPE sütunu engelleyebilir. Diğer önemli bir adım SPE kolonundan hazırlanmasıdır. Sütununda parçacıkla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L