الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Summary

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Abstract

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introduction

يظهر الجهاز العصبي الفقاريات من لوحة العصبية باعتبارها طبقة متجانسة من الخلايا الظهارية العصبية. فهم كيفية يسببها البرامج التنموية، ترميز، وأنشأ خلال الجهوية لوحة العصبية هو، في الوقت الحاضر، وهو هدف رئيسي في البيولوجيا التطورية. مقارنة مع النظم الأخرى، والقيطم الجنين قابلة تجريبيا هو نموذج للاختيار لتحليل الخطوات الأولى من ^1،2 تطوير العصبي. فمن السهل الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة، والتنمية الخارجية يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى لتكون العصيبة ^3. تتوفر للتلاعب تجريبيا القيطم المورق (X. المورق) التطور الجنيني العديد من الأدوات. الدقيقة حقن من mRNAs أو morpholinos (MO)، بما في ذلك المنظمات الأعضاء محرض، جنبا إلى جنب مع أدوات البيوكيميائية والدوائية، يسمح السيطرة على زيادة وظيفة (GOF) وفقدان وظيفة (LOF) والتعديل المحدد من مسارات إشارات ^4،5. جيش تحرير بلوشستانstocoel سقف الأديم الظاهر، وتقع حول القطب الحيواني من الأريمة أو المعيدة الجنين في وقت مبكر جدا، ويشار إليها باسم "كاب الحيوان" (AC)، هو مصدر الخلايا المحفزة التي يمكن برمجتها من خلال التلاعب في التعبير الجيني قبل إإكسبلنتس الإعداد. في هذه المخطوطة هي بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لاستخدام X. إإكسبلنتس المورق AC لاختبار في المختبر والآليات الجزيئية الجسم الحي والعمليات الخلوية تطوير العصبية الكامنة.

ويرد تقنية، مما يتيح مراقبة دقيقة من أنماط التعبير الجيني في القيطم أنبوب الشرغوف العصبية، وهي خطوة أولية في تحديد العظة تقرير المصير. في حين أن مراقبة الأنسجة مسطحة شنت يشيع استخدامها في دراسة افراخ الدجاج ^6، أنه لم يتم وصفها بشكل صحيح في القيطم. التلاعب في التعبير الجيني عن طريق حقن مرنا الاصطناعية أو MO في عن Blastomeres من 2 أو 4 أجنة مرحلة الخلية يسمح برمجة ACإإكسبلنتس ^4. على سبيل المثال تثبيط مخلق العظام البروتين (BMP) مسار كتبها التعبير عن مكافحة BMP عامل رأس، ويعطي هوية العصبية إلى الخلايا AC ^3. هو مفصل بروتوكول لأداء التعرض المحلي والتي تسيطر عليها وقت إإكسبلنتس AC لاشارات خارجية عن طريق الاتصال المباشر مع حبة راتنج تبادل أنيون. أخيرا يوصف تقنية لاختبار الميزات التنموية من الأسلاف العصبية في الجسم الحي بواسطة زرع إإكسبلنتس مختلطة أعد من خلايا متميزة مبرمجة فصلها وإعادة المصاحب.

جنين الضفدع هو نموذج قوي لدراسة مبكرة التطور العصبي الفقاريات. الجمع بين التلاعب في التعبير الجيني ليزدرع الثقافات في المختبر يوفر معلومات هامة في دراسة الجهوية الظهارة العصبية، والانتشار، والتشكل ^7-12. برمجة إإكسبلنتس AC سمحت وضع القلب وظيفية خارج الجسم الحي ^13،14. الاستخداممن يزدرع تطعيم ¹⁵ أدت إلى التعرف على مفتاح النسخي الحد الأدنى من حمل البرنامج التمايز قمة العصبية ^16. وintrathalamica المحدد للزونا (ZLI) هو مركز الإشارات التي تفرز القنفذ سونيك (Shh على) للسيطرة على النمو والإقليمي على الدماغ الأمامي الذيلية. عندما تتعرض باستمرار لShh على الخلايا الظهارية العصبية coexpressing عامل الجينات الثلاثة النسخ - باره مثل homeobox 2 (barhl2)، orthodenticle 2 (otx2) والايروكوا-3 (irx3) - الحصول على اثنين من خصائص المقصورة ZLI: اختصاص ل التعبير عن SHH، والقدرة على فصل من الخلايا العصبية لوحة الأمامية. كنظام نموذج، وستعرض تحريض على مصير ZLI إلى خلايا عصبية ظهارية ^8.

وتهدف هذه البروتوكولات في توفير بسيطة ورخيصة، وأدوات فعالة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين على استكشاف وزارة التعليم الأساسيhanisms للسلوكيات الأساسية الخلية العصبية. هذه البروتوكولات هي متعددة للغاية وتسمح بالتحقيق في طائفة واسعة من الاشارات العصبية تقرير خارجي والجوهرية. ويسمح على المدى الطويل في التحليل المجراة على التزام النسب العصبية والتفاعلات الاستقرائي والسلوكيات الخلية.

Protocol

تجارب تتوافق مع التنظيم الوطني والأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية ومع المبادئ المعمول بها دوليا استبدال، والحد من والصقل.

1. شقة تصاعد من القيطم المورق الضفادع الصغيرة الأمامية العصبية أنبوب بعد الجامع جبل في الموقع التهجين

1. الحصول X. المورق الأجنة وفقا للاجراءات المتبعة ⁴ والسن لهم حتى يصلوا إلى مرحلة neurula 26 فما فوق (وفقا لNieuwkoop وفابر الجدول التنموي ^17.
2. الإصلاح X. المورق الضفادع الصغيرة التي تفرخ لهم في حل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA). صخرة وتدوير الأجنة في الزجاج 2 مل قارورة، 1-1،5 ساعة على RT لمرحلة 26 إلى 38 مرحلة الأجنة، 2 ساعة على RT للأجنة في مراحل لاحقة.
   تنبيه: PFA سامة عن طريق الاتصال ومادة مسرطنة مشتبه بهم. وينبغي التلاعب بها تحت غطاء محرك السيارة.
   ملاحظة: واحد X. المورق الحضنة هوعادة ثابتة في كوب 2 مل قارورة ولكن يمكن استخدامها لأكبر قارورة زجاجية.
3. غسل الأجنة في نفس القارورة باستخدام برنامج تلفزيوني 1X مع 0.1٪ توين (PBT)، 3 دقيقة في RT، مرتين.
   ملاحظة: ما لم يحدد خلاف ذلك في برنامج تلفزيوني يستخدم هو مع أو بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
4. يذوى الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ (MeOH) لا يقل عن 12 ساعة على RT في نفس القارورة. تغيير MeOH 100٪ على الأقل مرتين تحت غطاء محرك السيارة باستخدام micropipette البلاستيك.
   ملاحظة: إن MeOH يتحول إلى اللون الأصفر قليلا كما الدهون الذائبة في ذلك. يحذر MeOH سامة عن طريق الإستنشاق ويجب معالجته تحت غطاء محرك السيارة.
5. ترطيب الأجنة باستخدام نفس القارورة من خلال سلسلة متدرجة من الحمامات MeOH: MeOH 75٪ في برنامج تلفزيوني، MeOH 50٪ في برنامج تلفزيوني، MeOH 25٪ في برنامج تلفزيوني، PBS مرتين، كل حمام 5-10 دقيقة في RT. يتم تغيير الحلول MeOH تحت غطاء محرك السيارة باستخدام micropipette البلاستيك.
6. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل الجنين الى أن تشريح في 60 مم طبق بتري شغل إلى الأعلى مع PBT. عن طريق الرعاية اثنين ملقط غرامةإزالة بالكامل العينين عن طريق إدخال واحد ملقط غرامة بين العينين والأنبوب العصبي، على مستوى ساق البصري. فصل العينين من الأنبوب العصبي. إدخال بعناية ملقط تحت الأديم الظاهر تغمر الأنبوب العصبي. مع الرعاية، تقشر الأديم الظاهر بدءا من خلف الرأس وتخلص منه.
7. إجراء ISH مزدوج أو واحد باستخدام digoxigenin المسمى أو تحقيقات المسمى فلوريسئين كما سبق وصفه ^18،19.
8. بعد ISH نقل الأجنة في 60 ملم طبق بيتري جديدة مملوءة إلى الأعلى مع PBT باستخدام ماصة بلاستيكية.
9. باستخدام ملقط غرامة فصل بعناية الأنبوب العصبي عن بقية الجنين. في هذه المرحلة، والأنبوب العصبي الأمامي يفصل من الأنبوب الخلفي العصبية. فصل بعناية الأجزاء المتبقية من الأديم الظاهر تغمر الأنبوب العصبي، والحبل الظهري التي يتم تركيبها بشكل فضفاض تحت الأنبوب العصبي، والحويصلات أذني والأجزاء المتبقية من الأديم المتوسط. تأكد من أن الأنبوب العصبي يخلو من أي ملاحقفي هذه المرحلة.
   ملاحظة: لتجنب الأضرار التي لحقت الأنبوب العصبي أداء جميع العصبي نقل أنبوب / جنين مع نقل ماصة بلاستيكية أو micropipette إذا لزم الأمر مع خفض الحافة في نهايته. يتم ضبط القطر من نهاية طرف لحجم الأنبوب العصبي.
10. نقل الأنبوب العصبي تشريح (انظر الملاحظة الخطوة 1.9) في أنبوب 1.5 مل مليئة 50٪ الجلسرين مخففة في برنامج تلفزيوني. انتظر حتى تراجعت الأنابيب العصبية في الجزء السفلي من الحل الجلسرين، وعادة O / N عند 4 درجات مئوية.
11. إزالة حل 50٪ الجلسرين / PBS باستخدام micropipette P1000 وإضافة في نفس أنبوب 1.5 مل محلول 90٪ الجلسرين / PBS باستخدام micropipette P1000. انتظر حتى الأنابيب العصبية تقع في الجزء السفلي من 90٪ الجلسرين / PBS حل، وعادة O / N عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، استخدم 90٪ الجلسرين / PBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية لمنع تطور البكتيرية.
12. نقل الأنابيب العصبية على لوحة من الزجاج، أو شريحة المجهر مع نقل ماصة بلاستيكية.
13. ديسالطائفة الأنابيب العصبية على طول ظهري وبطني midlines باستخدام الإبر التنغستن. خلال هذه الخطوة يتم الاحتفاظ الأنابيب العصبية في 90٪ الجلسرين / PBS.
14. جبل جانبي الأنبوب العصبي في 90٪ الجلسرين / PBS باستخدام حلقات تعزيز مغطاة ساترة الزجاج.
15. إصلاح لل coverslips مع الورنيش والحفاظ على 4 درجات مئوية.

2. قبعة الحيوانية إإكسبلنتس التعريفي عن طريق الخرز أنيون تبادل راتينج

1. نقل 100 ميكرولتر من الخرز راتنج تبادل أنيون في أنبوب 2 مل باستخدام micropipette P1000. تغسل حبات لا يقل عن خمس مرات متتالية مع الماء المقطر المعقم. السماح للالخرز على الرسوبيات في الجزء السفلي من الأنبوب واستبدال الماء المقطر المعقم باستخدام micropipette P1000. لا تلمس الخرز.
2. السماح للالخرز نقع O / N في أنبوب 2 مل مملوءة بالماء المقطر المعقم مع مصل بقري الزلال (BSA) (10 ملغ / مل) في 4 درجات مئوية.
3. اثنين من ساعة قبل جمع أجهزة التكييف، ومكان النصف من الخرز إلى 1.5 مل جديدةأنبوب باستخدام micropipette P1000. استبدال الماء المقطر المعقم مع 500 ميكرولتر من المتوسط ​​تحتوي على جزيء لفحصها لقدرته الاستقرائي، أو معروفة للحث على مصير معين. الحفاظ على النصف الآخر من الخرز، لأنها سوف تستخدم لمراقبة سلبية.
4. احتضان حبات عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
5. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة تحت stereomicroscope وتنفيذ جميع عمليات نقل AC مع micropipette.
6. نقل الأريمة أو المعيدة الأجنة في وقت مبكر جدا في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم تستكمل مع 0.2٪ BSA باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
   ملاحظة: الأجنة النامية في 12 ° C متناول الأريمة والمعيدة مراحل في غضون 20 إلى 24 ساعة.
7. إزالة الغشاء المحي الجنين باستخدام ملقط كما هو موضح سابقا ^20. إصلاح الجنين مع واحد ملقط. قرصة الغشاء المحي مع الجانب ملقط الأخرى. عقد الغشاء، قشر ببطء قبالة الجنين. تنفيذ هذا الإجراء على فينترال (نباتية) جانب من الجنين. لا ضرر الجانب الحيواني من الجنين.
8. عزل أجهزة التكييف الصغيرة كما هو موضح سابقا ^21. القطب الحيواني هو جزء المصطبغة الجنين. قطع باستخدام ملقط غرامة من مربع صغير من الأنسجة من القطب الحيواني. تحتوي على الأنسجة AC فقط في خلايا الأدمة. تأكد من أن النسيج هو من سمك موحد. إن لم يكن، وإزالة AC من التحليل.
9. وضع كل AC في Terasaki لوحات multiwell في 0.5X التعديل بارت المالحة (MBS) ^4. وضع AC في البئر مع الجانب الحيواني المصطبغة إلى أسفل، في اتصال مع الجزء السفلي جولة من البئر.
   ملاحظة: الماصات طلاء مع حل BSA 0.1٪ يمنع التصاق قطع صغيرة من النسيج لاصق على البلاستيك.
10. وضع حبة واحدة على كل غطاء باستخدام P20 micropipette. إذا لزم الأمر، استخدام ملقط لوضع بعناية حبة في وسط الغطاء.
    ملاحظة: عندما غارقة في وسط مكيفة، يتم تلوين حبات باللون الوردي. حدد معظم المشاركينحبات lored.
11. في احتضان RT (18-22 درجة مئوية) لمدة 6 ساعات دون تحريك Terasaki لوحة multiwell. حبة تتمسك AC في أقل من 2 ساعة.
12. وضع Terasaki لوحة multiwell على رأس الصحف غارقة في المياه. تغطية لوحة مع وعاء من البلاستيك.
    ملاحظة: هذه "الغرفة الرطوبة" يمنع تبخر سابق لأوانه من الآبار.
13. ثقافة أجهزة التكييف في 0.5X MBS أو 3/4 NAM (راجع الخطوة 4.1) في غرفة الرطوبة في 15-20 درجة مئوية حتى وصلت الأجنة الأشقاء المرحلة الصحيحة لاختبار تأثير عامل الخاص بك.
14. إصلاح أجهزة التكييف لمدة 1 ساعة في طازجة 4٪ PFA. يذوى أجهزة التكييف في 100٪ MeOH كما هو موضح سابقا (الخطوة 1.4).

3. غطاء الحيوان التفكك خلية وإعادة تجميع قبل التطعيم في القيطم المورق Neurula

1. أطباق بتري معطف (60 مم) أو 12 بئرا لوحات مع 3٪ الاغاروز في الماء المعقم أو في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة الاغاروز يكفي لتغطية بottom من طبق بتري أو البئر. قبل الحارة لوحات في RT (18-22 درجة مئوية). اختياريا، وتخزينها لوحات لبضعة أيام في 4 ° C لمنع الجفاف.
2. إعداد خالية من الكالسيوم المالحة Holtfreter في (60 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7 ملي بوكل، 4.6 ملي HEPES، 0.1٪ BSA (A-7888 سيغما درجة الحموضة 7.6)) والمالحة Holtfreter في (60 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7 ملي بوكل، 0.9 ملي CaCl _2، 4.6 ملي HEPES، 0.1٪ BSA درجة الحموضة 7.6) ^5. ملاحظة: حل CaCl ₂ لا يمكن تعقيمها.
3. ملء البئر إلى الأعلى مع المياه المالحة خالية من الكالسيوم Holtfreter والمغلفة الاغاروز.
4. إعداد الأريمة أو المعيدة الأجنة في وقت مبكر جدا لعزل أجهزة التكييف الخاصة بهم كما هو موضح سابقا (الخطوات 2،5-2،7).
5. عزل لا يقل عن 15 أو ما يصل إلى 30، مكيفه صغير ^21. قطع باستخدام ملقط غرامة من مربع صغير من الأنسجة من القطب الحيواني. الأنسجة AC يحتوي فقط على خلايا الأدمة وبالتالي فهو من سمك موحد. إن لم يكن، وإزالة AC من التحليل.
   ملاحظة: القطب الحيوان هو امبريجزء س في المصطبغة.
6. نقل أجهزة التكييف إلى الاغاروز المغلفة مملوءة جيدا إلى الأعلى مع خالية من الكالسيوم المالحة Holtfreter ل. وضع أجهزة التكييف مع جانبهم المصطبغة متجهة لأعلى.
   ملاحظة: تبدأ عملية التفكك بسرعة في الكالسيوم الحرة المالحة Holtfreter ل.
7. انتظر بضع دقائق للخلايا لبدء الانفصال. نلاحظ ذلك من خلال تصنيف الأنسجة. باستخدام ملقط غرامة، فصل الطبقة المصطبغة من بقية AC والتخلص منها مع P20 micropipette. كاملة عملية التفكك خلية تشير فصل الخلايا عن بعضها البعض.
   ملاحظة: واحد أو اثنين من طبقات الصباغية يمكن أن تترك في حدود تجميعها إعادة النباتى للمساعدة في التصور خلال التطعيم.
8. توسيط الخلايا باستخدام حركات دائرية من لوحة. باستخدام micropipette P1000 إزالة بعناية بقدر المتوسطة وقت ممكن. يجب الحرص على عدم لمس الخلايا.
9. إضافة 1 مل من المياه المالحة Holtfreter مع الكالسيوم إلى البئر. نقل أجهزة التكييف نأتفي أنبوب 1.5 مل.
   ملاحظة: لا يمكن استخدام 2 مل أنابيب نظرا لأسفل في الدور.
10. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي، 5 دقائق على سرعة قصوى تصل إلى 2000 دورة في الدقيقة لجهاز للطرد المركزي مقاعد البدلاء (500 x ج). إزالة بعناية طاف مع micropipette P1000.
11. إضافة إلى الخلايا فصل 20 ميكرولتر من المياه المالحة Holtfreter مع الكالسيوم (60 ملي كلوريد الصوديوم، 0.7 ملي بوكل، 0.9 ملي CaCl _2، 4.6 ملي HEPES، 0.1٪ BSA (A-7888 سيغما درجة الحموضة 7.6) ^5.
12. إبقاء أجهزة التكييف فصل، 3-6 ساعة على RT (18-22 درجة مئوية).
    ملاحظة: هذا هو الوقت اللازم للحصول على الخلايا لإعادة مجموع المباراتين. إعادة تجميع-مرئيا كما تشكل الخلايا كرة صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب.
13. فصل يزدرع بعناية من الجزء السفلي من أنبوب عن طريق إضافة 1 مل من 0.5X MBS أو 1 مل من 3/4 NAM (راجع الخطوة 4.1). نقل يزدرع في لوحة من الامم المتحدة والمغلفة باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
14. المرحلة لل explants باستخدام الأشقاء سيطرتهم. على المدى الطويل المضادات الحيوية استخدام الثقافة: kanamyCIN (50 ميكروغرام / مل)، الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل)، وgentamycine (50 ميكروغرام / مل).

4. مسمار الحيوان قبعات إإكسبلنتس في لوحة العصبية من X. المورق الأجنة

1. إعداد 3/4 NAM (110 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملي كا (NO _{3) 2،} 1 ملي MgSO _4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم NaHCO _3، 0.2x PBS، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين). لا تبقي لأكثر من 1 في الاسبوع للتشريح وتخزينها في 4 درجات مئوية. أقدم حركة عدم الانحياز يمكن أن تستخدم لإعداد أطباق تشريح المغلفة الاغاروز (أدناه).
2. أطباق بتري معطف (60 ملم) مع 3٪ الاغاروز في 04/03 حركة عدم الانحياز إلى أي بذلت ثقوب صغيرة باستخدام قالب السيليكون، أو غطاء مضرب تنس الطاولة.
   ملاحظة: إن الاغاروز يغطي الجزء السفلي من طبق بتري. ترك بعض المساحة بحيث طبق بتري لملء مع 3/4 حركة عدم الانحياز. جعل بدلا من أطباق تشريح مع عدم تجفيف الصلصال. داخل الطين، ضغط الأجنة قليلا أثناء إجراء تشريح. حفر ثقوب صغيرة فيالاغاروز باستخدام ملقط تقريب هذا 'الطبق تشريح "تساعد على عقد الأجنة أثناء إجراء تشريح.
3. جمع أدوات تشريح: الماصات البلاستيكية نقل، وهو 'سكين الحاجب "(مع شعر الحاجبين جزءا لا يتجزأ من البارافين في غيض من الزجاج ماصة باستير) ^22، وهما ملقط تشريح غرامة، P1000 micropipette ونصائح، وstereosmicroscope مع التكبير 8-40X، مصدر الضوء الساطع مع أدلة الألياف البصرية. منع جميع الأدوات تشريح نظيفة. بعد كل تجربة، وشطف لهم مرتين بالماء المقطر، مرة واحدة مع الإيثانول بنسبة 100٪ واسمحوا الجافة. تخزين بعيدا عن الغبار وإذا الأوتوكلاف ما يلزم من أدوات تشريح المعادن.
4. السماح للفصل وإعادة تجميع أجهزة التكييف (بروتوكول 3)، وأشقائهم X. الأجنة المورق تتطور حتى تصل إلى مرحلة 13 (neurula) وفقا لNieuwkoop وفابر الجدول التنموي ^17. للزرع داخل لوحة المرحلة العصبية من 13 إلى 15 مرحلة الأجنة المستخدمة.
5. تنفيذ جميعالخطوات اللاحقة تحت stereomicroscope.
6. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ونقل الأجنة في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم تستكمل مع 0.2٪ BSA. إزالة الغشاء المحي الجنين كما هو موضح سابقا ^20. إصلاح الجنين مع واحد ملقط. قرصة الغشاء المحي مع الجانب ملقط الأخرى. عقد الغشاء بحزم، قشر ببطء قبالة الجنين.
   ملاحظة: هل هذا الإجراء على بطني (نباتية) جانب من الجنين. لا تضر الأجنة لوحة العصبية. إذا تضررت الأجنة أثناء إزالة خطوة الغشاء المحي، ونقل الأجنة في طبق بتري 60 ملم تحتوي على 3/4 NAM باستخدام ماصة نقل البلاستيك وانتظر 15 دقيقة، وهو وقت كاف لعملية الشفاء تحدث.
7. ملء طبق تشريح إلى الأعلى مع الطازجة 3/4 حركة عدم الانحياز.
8. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ونقل الأجنة دون الغشاء المحي بهم في طبق تشريح. وضع الأجنة الجانب الظهري تصل إلىالآبار. أثناء عملية النقل لا تسمح الجنين للدخول في اتصال مع واجهة الهواء السائل منذ X. وهي lysed المورق التي كتبها التوتر السطحي.
9. نقل يزدرع AC إلى أن المطعمة في لوحة تشريح باستخدام ماصة نقل البلاستيكية أو micropipette P1000. مرة واحدة ماصة هو داخل السائل، والسماح لل explants لتغرق ببطء عن طريق الجاذبية، أو دفع بلطف شديد.
10. الحفاظ على الأجنة مع ملقط مدورة. مع سكين الحاجب إجراء شق في لوحة العصبية حيث كنت تنوي الكسب غير المشروع قطعة النباتى الخاص بك.
    ملاحظة: في المرحلة 14 من الانحناء الأمامي من لوحة العصبية يمكن أن يكون استخدامها بوصفها معلما، فإنه يمثل إقليم الدماغ البيني (الشكل 4).
11. قطع قطعة صغيرة من الظهارة العصبية، وذلك باستخدام ملقط مدورة وKNIVE الحاجب. قطع قطعة صغيرة من يزدرع مع سكين الحاجب.
    ملاحظة: قطعة من يزدرع يجب أن يكون تقريبا نفس حجم وشكل على أنها منطقة ذاب الظهارة العصبية.
12. ضع قطعة من يزدرع في شق الظهارة العصبية باستخدام سكين الحاجب وملقط غرامة. تأكد من أن يزدرع تعلق بسرعة إلى الجنين.
13. وضع بدلا من ذلك قطعة من الزجاج ساترة على الجنين المطعمة للحفاظ على الكسب غير المشروع في المكان. للقيام بذلك، وقطع الزجاج ساترة الجميلة إلى قطع صغيرة جدا باستخدام ملقط الخشنة. تأكد من أن حجم ما يقرب من 1.5 مم ^2. تزج القطع في طبق بتري تحتوي على 3/4 NAM أو PBS باستخدام ملقط. اختيار قطعة من الزجاج أكبر من الجنين لتجنب الإضرار بها. فإن الجنين يكون بالارض قليلا.
14. الانتظار لمدة 30 دقيقة على الأقل دون تحريك، أو فقط نقل لوحة تشريح بلطف. السماح الجنين استعادة لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة وإزالة بلطف ساترة إذا لزم الأمر. ماصة بعناية الأجنة المطعمة في طبق نظيف مليئة 3/4 حركة عدم الانحياز، وذلك باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
    ملاحظة: المطعمة الأجنة تميل إلى تطوير البكتيريا أو الفطريات التلوث. على المدى الطويل جulture استخدام المضادات الحيوية: كانامايسين (50 ميكروغرام / مل)، الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل)، وgentamycine (50 ميكروغرام / مل).

النتائج

وبناء على الاعتبارات الشكلية في الأنواع المختلفة، والتلاعب الجنينى، ونمط التعبير عن الجينات التنظيمية، حاصل على النموذج المفاهيمي الذي ينقسم لوحة العصبية إلى عرضية وطولية شرائح التي تحدد شبكة التنموية توليد حقول histogenic متميزة. في لوحة العصبية، وك...

Discussion

ومدبرة التطور العصبي بواسطة تفاعل معقد بين البرامج التنموية الخلوية وإشارات من الأنسجة المحيطة بها (مراجعة في ^3،31،32). نحن هنا وصف مجموعة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها في X. المورق الأجنة لاستكشاف خارجي والعوامل الجوهرية التي ينطوي عليها العصبي تقرير...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation