Стволовых клеток, как<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

Резюме

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Аннотация

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Введение

Позвоночных нервная система выходит из нервной пластинки в виде однородного слоя нейроэпителиальных клеток. Понимание того, как программы развития индуцируется, кодируется, и установили во регионализации нервной пластинки, в настоящее время, одной из основных целей в биологии развития. По сравнению с другими системами, экспериментально поддаются Xenopus эмбрионов является модель выбора для анализа ранних стадиях нервной ^1,2 развития. Это легко получить большое число эмбрионов, и внешнего развития дает доступ к самым первым шагом нейруляции ^3. Многие инструменты доступны экспериментально манипулировать Xenopus Laevis (Х. Laevis) эмбрионального развития. Микро-инъекции мРНК или Morpholinos (МО), в том числе индуцируемых МО, вместе с биохимическими и фармакологическими средствами, позволяет контролируется усиление функции (GOF) и потерю функции (LOF) и конкретное изменение в пути ^4,5 сигнализации. Дву-stocoel крыши эктодермы, расположенный вокруг животного полюса бластулы или очень ранней гаструлы эмбриона, и упоминается как "Animal предел" (AC), является источником плюрипотентных клеток, которые могут быть запрограммированы манипуляции экспрессии генов до экспланты подготовку. В этой рукописи подробные протоколы используют X. Laevis AC эксплантов, чтобы проверить в пробирке и в естественных молекулярных механизмов и клеточных процессов основной развития нервной системы.

Техника представлена, что позволяет прекрасный наблюдение шаблонов экспрессии генов в Xenopus головастиков нервной трубки, предварительный шаг в идентификации определения судьбы киев. В то время как наблюдение плоских монтажа тканей обычно используется в исследовании эмбрионов кур ^6, она не была должным образом описаны в Xenopus. Манипуляция экспрессии генов путем введения синтетического мРНК или МО в бластомеры 2 или 4 стадии клеток эмбрионов позволяет программировать ACэкспланты ^4. Например ингибирования костного морфогенетического белка (BMP) пути экспрессией анти-фактора Noggin BMP, дает нейронной идентичность переменного клеток ^3. Протокол подробно для выполнения локального и управление временем экспозиции переменного тока с внешними эксплантов сигналы с помощью непосредственного контакта с анионообменной смолой шарик. Наконец методика описана для тестирования особенностей развития нейронных клеток-предшественников в естественных трансплантацией смешанных эксплантатов из различных приготовленных запрограммирован клеток диссоциированных и повторно связанных.

Лягушка эмбрион мощная модель для изучения раннего развития нервной системы позвоночных. Сочетание манипуляции экспрессии генов в эксплантата культур в пробирке дает важную информацию в изучении нейроэпителия регионализации, пролиферации и морфогенеза ^7-12. Программирование переменного тока эксплантов разрешается развитию функциональной сердце экс естественных условиях ^13,14. Использованиеиз эксплантов прививки ¹⁵ привели к выявлению минимальной транскрипции переключателя, вызывающего программу дифференцировки нервного гребня ^16. Зона limitans intrathalamica (ZLi) передачи сигналов центр, который выделяет звуковой еж (Shh), чтобы контролировать рост и регионализации хвостового переднего мозга. Когда постоянно подвергаются воздействию Shh нейроэпителиальные клетки совместной экспрессии генов трех транскрипционных факторов - Барх, как гомеобокс-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) и ирокез-3 (irx3) - приобрести две характеристики купе ZLi: компетентность в выразить Тсс, и способность отделить от передней части нервной пластинки клеток. В качестве модельной системы, индукция участи ZLi в нейроэпителиальных клеток будет представлено ^8.

Эти протоколы направлены на обеспечение простые, дешевые и эффективные инструменты для биологов развития и другими исследователями для изучения фундаментальной MEChanisms ключевых поведения нейронных клеток. Эти протоколы очень разносторонний и позволит расследование большом диапазоне внешних и внутренних нервных сигналов определения. Это позволяет в долгосрочной перспективе в естественных условиях анализа нейронной коммитирование, индуктивных взаимодействий и клеточных поведений.

протокол

Эксперименты соответствовать национальным и европейским нормам по защите животных, используемых для научных целей и международном уровне принципов заместительной, сокращения и изысканности.

1. Мини-установка Xenopus Laevis Головастики Передняя нервной трубки После Всего монтажа в гибридизация

1. Получить X. Laevis эмбрионов соответствии со стандартными процедурами ⁴ и возраст их, пока они не достигнут нейрулы этап 26 и старше (в соответствии с Nieuwkoop и Faber ^{таблице} 17 развития.
2. Исправлено Х. Laevis головастиков путем инкубации их в растворе 4% параформальдегида (PFA). Рок и поверните эмбрионов в стеклянный флакон 2 мл, от 1 до 1,5 ч при комнатной температуре в течение 26 этапе на сцене 38 эмбрионов, 2 ч при комнатной температуре в течение эмбрионов на поздних стадиях.
   ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным при контакте и потенциальный канцероген. Следует манипулировать под капотом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: One X. Laevis выводокОбычно фиксируется в стеклянную пробирку 2 мл но больше стеклянный сосуд может быть использован.
3. Вымойте эмбрионов в том же флаконе, используя 1x PBS с 0,1% твина (PBT), 3 мин при комнатной температуре, в два раза.
   Примечание: Если иное не указано в PBS используется с или без кальция и магния.
4. Высушить эмбрионов в 100% метаноле (MeOH) в течение не менее 12 ч при комнатной температуре в той же пробирке. Изменение MeOH 100%, по крайней мере в два раза под капотом, используя пластиковую микропипетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: МеОН получается слегка желтый, как липидов, растворенных в ней. Внимание МеОН токсичен при вдыхании и следует манипулировать под капюшоном.
5. Увлажняет эмбрионов, используя тот же флакон через градуированной серии МеОН ванн: MeOH 75% в PBS, MeOH 50% в PBS, МеОН 25% в PBS, PBS в два раза, каждый ванна 5-10 мин при комнатной температуре. Решения МеОН меняются под капотом, используя пластиковую микропипетку.
6. Использование пластиковой пипетки, передавать эмбрион будет расчленена в 60 мм чашки Петри заполнены на вершину с PBT. Использование двух тонких щипцов уходполностью удалить глаза, вставив один тонкий пинцет между глазами и нервной трубки, на уровне зрительного стебля. Снять глаза от нервной трубки. Осторожно ввести ниже эктодермы щипцы перекрывающих нервной трубки. С осторожностью, снимите эктодермы, начиная с за голову и выбросить его.
7. Выполните двойной или одного ISH, используя дигоксигенином помечены или флуоресцеина-меченых зондов, как описано выше ^18,19.
8. После ISH передачи эмбрионов в новом 60 мм чашки Петри заполнены на вершину с помощью ПБТ пластиковой пипетки.
9. Использование тонких щипцов тщательно отделить нервной трубки от остальной части зародыша. На этой стадии, передняя нервная трубка отделяется от задней части нервной трубки. Осторожно снимите оставшиеся части эктодермы, покрывающей нервной трубки, хорды, которая свободно прилагается ниже нервной трубки, слуховых пузырьков и остальных частей мезодермы. Убедитесь, что нервная трубка лишена каких-либо приложенийна данном этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание повреждения нервной трубки выполнять все нейронные передачи трубки / эмбрионов с пластиковой пипетки или микропипетки при необходимости с разрезом наконечник на конце. Диаметр верхнего конца доводят до размера нервной трубки.
10. Передача расчлененный нервной трубки (см примечание шаг 1.9) в 1,5 мл трубки, заполненной 50% глицерина, разведенного в PBS. Дождитесь нервные трубки не упали на дно раствора глицерина, как правило, O / N при 4 ° С.
11. Удалить раствор 50% глицерина / PBS с помощью микропипетки P1000 и добавить в той же пробирке 1,5 мл раствора 90% глицерина / PBS с помощью микропипетки P1000. Дождитесь нервные трубки не падают на дно 90% глицерина / раствора PBS, как правило, O / N при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для длительного хранения, использования 90% глицерина / PBS плюс антибиотики, чтобы предотвратить бактериальное развитие.
12. Передача нервных трубок на стеклянную пластину, или предметное стекло с пластмассовым пипетки.
13. Диссекта нервные трубки вдоль спинной и брюшной средней линии, используя вольфрамовые иглы. В течение этого этапа нервные трубки хранятся в 90% глицерине / PBS.
14. Установите две стороны нервной трубки в 90% глицерина / PBS с помощью арматурных кольца, покрытые покровным стеклом.
15. Fix покровные с лаком и сохранить при 4 ° С.

2. Животное Кап Экспланты Индукционная Использование анионообменной смолы бисер

1. Передача 100 мкл анионообменной смолы гранул, в 2 мл пробирку с использованием микропипетки P1000. Вымойте бисером по крайней мере, пять раз подряд стерильной дистиллированной водой. Разрешить шарики в осадок на дне пробирки и заменить стерильной дистиллированной воде с помощью микропипетки P1000. Не прикасайтесь бисером.
2. Пусть шарики замочить o / n в 2 мл пробирку, заполненную стерильной дистиллированной воды с бычьим сывороточным альбумином (BSA) (10 мг / мл) при 4 ° С.
3. Два часа перед сбором КК, место половину шариков в новые 1,5 млТрубка с помощью микропипетки P1000. Заменить стерильной дистиллированной воды с 500 мкл среды, содержащей молекулу быть проверены на его индуктивной потенциала, или известно, вызывают определенную судьбу. Хранить другую половину гранул, как они будут использованы в качестве отрицательного контроля.
4. Инкубируйте бусины при 4 ° С в течение не менее 2 ч.
5. Выполняйте все последующие шаги под стереомикроскопа и выполнять все передачи переменного тока с микропипеткой.
6. Передача бластула или очень ранних эмбрионов гаструлы в PBS с кальцием и магнием, дополненной 0,2% BSA с использованием пластиковой пипетки передачи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы развиваются 12 ° С длинна бластулы и гаструлы в 20 до 24 часов.
7. Удалить желточный мембрану эмбриона с помощью щипцов, как описано ранее ^20. Fix эмбриона с одним пинцетом. Pinch желточной оболочки со стороной других щипцов. Проведение мембраны, медленно очистить его от эмбриона. Выполните эту процедуру на веТрал (растительного) сторона эмбриона. Не повредить животное сторону эмбриона.
8. Изолировать небольших КК, как описано ранее ^21. Животное полюс пигментированные часть эмбриона. Использование тонких щипцов вырезать небольшой площади ткани из животного полюса. Переменного тока ткань содержит только эктодермальные клетки. Убедитесь, что ткань равномерной толщины. Если нет, удалить AC из анализа.
9. Поместите каждую переменного тока в Тарасаки луночные планшеты в 0.5x модифицированных Барта Солевые (MBS) ^4. Поместите AC в яме с его стороны пигментного животных вниз, в контакте с круглым дном колодца.
   Примечание: покрытия пипетки с 0,1% раствором БСА предотвращает прилипание мелких кусочков липкой ткани на пластик.
10. Разместите один шарик на каждую крышку с помощью микропипетки P20. При необходимости использовать щипцы тщательно поместить шарик в центре крышки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При замачивают в кондиционированной среде, шарики окрашены в розовый цвет. Выберите наиболее сотрудничествоlored шарики.
11. Выдержите при комнатной температуре (от 18 до 22 ° С) в течение 6 ч, не перемещая пластину Multiwell TERASAKI. Шарик прилипает к AC меньше, чем 2 часа.
12. Поместите пластину Multiwell TERASAKI сверху работ замачивают в воде. Закройте планшет пластиковый контейнер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это "влажность камера" предотвращает преждевременное испарение скважин.
13. Культура АСУ в 0.5x MBS или 3/4 NAM (см шаг 4.1) в камере влажности при 15-20 ° С до тех пор, родственные эмбрионы достигли правильного сцену, чтобы проверить эффект вашего фактора.
14. Закрепите КК в течение 1 ч в свежеприготовленный 4% PFA. Дегидрировать АСУ в 100% МеОН, как описано выше (шаг 1.4).

3. Животное крышка сотовый Диссоциация и реагрегация Перед Прививка в Xenopus Laevis нейрулы

1. Шерсть чашки Петри (60 мм) или 12-луночных планшетах с 3% агарозы в стерильной воде или в PBS без кальция и магния. Добавьте достаточно агарозы, чтобы покрыть бottom в чашке Петри или скважины. Предварительно прогреть пластин при комнатной температуре (18-22 ° C). По желанию, хранить планшетах в течение нескольких дней при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить обезвоживание.
2. Подготовка бескальциевой солевой Holtfreter (60 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 4,6 мМ HEPES, 0,1% BSA (А-7888 Сигма рН 7,6)) и солевым раствором Holtfreter (60 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 0,9 мМ CaCl _2, 4,6 мМ HEPES, 0,1% BSA рН 7,6) ^5. ПРИМЕЧАНИЕ: решение CaCl _{2, не} может быть в автоклаве.
3. Заполните агарозы покрытием также к вершине с физиологическим раствором бескальциевой Holtfreter в.
4. Подготовка бластулы или очень ранних эмбрионов гаструлы, чтобы изолировать их КК, как описано ранее (шаги 2,5 до 2,7).
5. Изолировать по крайней мере, 15 или до 30, мала КК ^21. Использование тонких щипцов вырезать небольшой площади ткани из животного полюса. Сетевой ткань содержит только эктодермальные клетки и, следовательно, равномерной толщины. Если нет, удалить AC из анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное полюс является Эмбрипигментированные часть выходов.
6. Передача КК в агарозном покрытием хорошо заполнена до краев бескальциевой физиологического раствора Holtfreter в. Поместите КК с их пигментированные стороной вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс диссоциации быстро начинает в бескальциевой физиологического раствора Holtfreter в.
7. Подождите несколько минут, клетки, чтобы начать диссоциации. Соблюдайте это через дезагрегации тканей. Использование тонких щипцов, отделить пигментированный слой от остальной части сети переменного тока и отбросить их с микропипетки P20. Полный процесс диссоциации клеток указывает на разделение клеток друг от друга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одна или две пигментные слои могут быть оставлены в повторной агрегированных эксплантата, чтобы помочь визуализации во время прививки.
8. Сосредоточьте клеток с использованием круговые движения пластины. Использование микропипетки P1000 тщательно удалить столько среду насколько это возможно. Будьте осторожны, чтобы не коснуться клетки.
9. Добавить 1 мл физиологического раствора Holtfreter с кальцием в скважину. Передача диссоциированных ККв 1,5 мл пробирку.
   Примечание: 2 мл пробирки не могут быть использованы из-за их круглым дном.
10. Гранул клетки центрифугированием, 5 мин при максимальной скорости 2000 оборотов в минуту в течение скамейке центрифуги (500 XG). Удалить супернатант тщательно микропипеткой P1000.
11. Добавить в диссоциированных клеток 20 мкл физиологического раствора Holtfreter с кальцием (60 мм NaCl, KCl 0,7 мм, 0,9 мм _CaCl 2, 4,6 мМ HEPES, 0,1% BSA (А-7888 Сигма рН 7,6) ^5.
12. Хранить диссоциированной ACS, от 3 до 6 часов при комнатной температуре (18-22 ° С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо время для клетки повторно агрегат. Повторное объединение виден как клетки образуют маленький шарик на дне пробирки.
13. Отсоединение эксплантов тщательно от нижней части трубы, добавив 1 мл 0,5 × MBS или 1 мл 3/4 ДН (см шаг 4,1). Передача эксплантов в ООН покрытием пластины, используя пластиковую пипетку передачи.
14. Этап эксплантов, используя своих братьев и сестер управления. Для длительного пользования культура антибиотиков: kanamyCIN (50 мкг / мл), ампициллин (50 мкг / мл) и гентамицина (50 мкг / мл).

4. Прививка животных Caps ЭКСПЛАНТОВ в нервной пластинки из X. Laevis эмбрионов

1. Готовят 3/4 NAM (мМ NaCl 110, KCl 2 мМ, 1 мМ Са (NO _{3) 2,} 1 мМ MgSO _4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO _3, 0,2 x PBS, 50 мкг / мл гентамицина). Не держите в течение более 1 недели для вскрытия и хранить при 4 ° С. Старая ДН могут быть использованы для подготовки агарозном покрытием рассечение блюда (ниже).
2. Пальто Петри (60 мм) с 3% агарозы в 3/4 ДН, в котором маленькие отверстия были сделаны с использованием либо силиконовые формы, или крышку стола теннисной ракеткой.
   Примечание: агарозы покрывает дно чашки Петри. Оставьте некоторое пространство, так что Петри, чтобы заполнить 3/4 ДН. В качестве альтернативы сделать рассечение блюда с невысыхающего пластилина. В глине, выжать немного эмбрионов во время процедуры вскрытия. Выкопайте маленькие отверстия вагарозы с помощью щипцов закругленными этой «рассечение блюдо 'помогает держать эмбрионов во время процедуры вскрытия.
3. Соберите рассечение инструменты: пластиковые пипетки передачи, An 'брови нож "(сделанный с бровей волос заливали в парафин на кончике стеклянной пипетки Пастера) ^22, два тонких щипцов, рассечение P1000 микропипеткой и советы, в stereosmicroscope с увеличением 8-40X, яркий источник света с оптическим волокном гидов. Держите все рассекает инструменты в чистоте; После каждого эксперимента, промыть их в два раза дистиллированной водой, один раз 100% этанолом и высушить. Хранить вдали от пыли и, если необходимо, автоклав металлических рассечения инструментов.
4. Пусть диссоциируют и повторно объединяются КК (протокол 3), и их братья Х. эмбрионы Laevis развивать, пока они не достигают стадии 13 (нейрулы) в соответствии с Nieuwkoop и Faber ^{таблице} 17 развития. Для трансплантации в стадии нервной пластинки 13, 15 эмбрионов этапе используются.
5. Провести всепоследующие шаги в рамках стереомикроскопом.
6. С помощью пластмассовой пипетки передачи, передачи эмбрионов в PBS с кальцием и магнием, дополненной 0,2% BSA. Удалить желточный мембрану эмбриона, как описано ранее ^20. Fix эмбриона с одним пинцетом. Pinch желточной оболочки со стороной других щипцов. Проведение мембрану твердо, медленно очистить его от эмбриона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У этой процедуры на брюшной (растительного) стороне зародыша. Не повредить эмбрионов нервной пластинки. Если эмбрионы были повреждены во время стадии удаления желточная мембраны, трансфер эмбрионов в 60 мм чашку Петри, содержащую 3/4 NAM с помощью пластиковой пипетки передачи и ждать 15 минут, достаточное время для процесса заживления, чтобы произойти.
7. Заполните рассечение блюдо сверху свежим 3/4 ДН.
8. Использование пластиковой пипетки передачи, передачи эмбрионов без их желточного мембрану в рассечение блюдо. Поместите эмбрионы спинной стороной вверх вколодцы. В процессе передачи не позволяют эмбриона, чтобы войти в контакт с воздухом жидкого интерфейс с X. Laevis лизируют поверхностного натяжения.
9. Передача эксплантов переменного тока для привиты в вскрытии пластины с использованием пластиковой пипетки передачи или микропипетку P1000. После того, как пипетка находится внутри жидкости, позволяют экспланты медленно опускаться под действием силы тяжести, или нажмите очень мягко.
10. Поддержание эмбрионов с закругленными щипцами. С бровей ножом сделать надрез в нервной пластинки, где вы собираетесь пересадить кусок вашего эксплантов в.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 14 передняя изгиб нервной пластинки можно использовать в качестве ориентира, он отмечает территорию, таламус (рисунок 4).
11. Вырежьте кусочек нейроэпителии, используя щипцы и закругленные брови резать ножом. Вырезать небольшой кусок эксплантата с бровей ножом.
    Примечание: часть эксплантов должно быть примерно такого же размера и формы, как нейроэпителии абляции области.
12. Поместите кусок эксплантата в нейроэпителия разрез с помощью бровей и нож тонкий пинцет. Убедитесь, что эксплантат быстро придает эмбриона.
13. В качестве альтернативы поместите кусок покровного стекла на привитым эмбриона для поддержания трансплантата на месте. Чтобы сделать это, вырезать тонкой стеклянной покровное на очень мелкие кусочки, используя грубые щипцы. Убедитесь, что размер примерно 1,5 ^мм 2. Погрузитесь штук в чашке Петри, содержащей 3/4 NAM или PBS, используя пинцет. Выберите кусок стекла больше, чем эмбриона, чтобы избежать его повреждения. Эмбрион будет немного сплющенные.
14. Подождите, по крайней мере 30 мин без движения, или двигаться только рассекает пластинку осторожно. Пусть зародыш восстановить в течение 30 мин до 2 ч и осторожно удалите покровное, если необходимо. Тщательно пипетки привитые эмбрионов в чистую чашку, наполненную 3/4 ДН, используя пластиковую пипетку передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Привитые эмбрионы имеют тенденцию к развитию бактерий или грибков загрязнения. Для долгосрочного Culture использовать антибиотики: канамицин (50 мкг / мл), ампициллин (50 мкг / мл) и гентамицин (50 мкг / мл).

Результаты

На основании морфологических соображений в различных видов, эмбриологических манипуляций, и паттерна экспрессии регуляторных генов, концептуальная модель считает, что нервная пластинка разделена на поперечные и продольные сегменты, которые определяют сетку с разв?...

Обсуждение

Нейронных развитие организованы сложного взаимодействия между клеточными программ развития и сигналов от окружающих тканей (обзор ^3,31,32). Здесь мы описываем набор протоколов, которые могут быть использованы в X. Laevis эмбрионов для изучения внешней и внутренней факторы, у?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation