Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Résumé

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Résumé

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introduction

Le système nerveux des vertébrés émerge de la plaque neurale comme une couche homogène de cellules neuro-épithéliales. Comprendre comment les programmes de développement sont induites, codés, et établis au cours de la régionalisation de la plaque neurale est, à l'heure actuelle, un objectif majeur en biologie du développement. Par rapport à d'autres systèmes, l'embryon de Xenopus prêtent expérimentalement est un modèle de choix pour l'analyse des étapes précoces de développement neural ^1,2. Il est facile d'obtenir un grand nombre d'embryons, et le développement externe donne accès aux toutes premières étapes de la neurulation ^3. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement Xenopus laevis (X. laevis) de développement embryonnaire. Micro-injection d'ARNm ou morpholinos (MO), y compris OM inductibles, ainsi que des outils biochimiques et pharmacologiques, permet gain de fonction (GOF) et la perte de fonction (LOF) et altération spécifique des voies de signalisation ^4,5 contrôlé. Le blastocoel toit ectoderme, situé autour du pôle animal d'une blastula, ou une gastrula embryon très tôt, et désigné comme le «Cap animale» (AC), est une source de cellules pluripotentes qui peut être programmé par la manipulation de l'expression génique avant explants préparation. Dans ce manuscrit sont des protocoles détaillés pour utiliser X. explants laevis AC pour tester in vitro et in vivo mécanismes moléculaires et cellulaires de développement processus neuronal sous-jacent.

Une technique est présentée, permettant l'observation fine de profils d'expression génique dans un tube neural têtard de Xenopus, une étape préliminaire dans l'identification de la détermination du destin des indices. Considérant que l'observation des tissus plates-montée est couramment utilisé dans l'étude des embryons de poulet ^6, il n'a pas été correctement décrit dans Xenopus. Manipulation de l'expression génique par injection d'ARNm synthétique ou MO dans les blastomères de 2 ou 4 embryons au stade de la cellule permet la programmation de l'AC⁴ explants. Par exemple inhibition de la voie Bone Morphogenetic Protein (BMP) par l'expression du facteur anti-BMP noggine, donne une identité à des cellules neurales AC ^3. Le protocole est détaillé pour la réalisation d'une exposition locale et contrôlée dans le temps des explants AC aux signaux extrinsèques par contact direct avec une perle de résine échangeuse d'anions. Enfin, une technique est décrite pour tester des fonctionnalités de développement de progéniteurs neuronaux in vivo par la transplantation d'explants mixte préparé à partir de cellules distinctes programmé dissociées et ré-associés.

L'embryon de la grenouille est un modèle puissant pour étudier le développement neural vertébrés tôt. Combinant manipulation de l'expression génique pour explantation des cultures in vitro fournit des renseignements importants dans l'étude de neuroépithélium régionalisation, la prolifération et la morphogenèse ^7-12. La programmation des explants AC permis le développement d'un cœur fonctionnel ex vivo ^13,14. L'utilisationexplant de greffage ¹⁵ a conduit à l'identification de l'interrupteur de transcription induisant minimal du programme de différenciation de la crête neurale ^16. Le limitans zona intrathalamica (ZLI) est un centre de signalisation qui sécrète sonic hedgehog (Shh) pour contrôler la croissance et la régionalisation du cerveau antérieur caudale. Lorsque permanence exposé à Shh, les cellules neuro co-exprimant le facteur trois gènes de transcription - Barh-like Homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) et Iroquois-3 (irx3) - acquièrent deux caractéristiques du compartiment ZLI: la compétence pour shh exprimer, et la capacité à séparer à partir de cellules de la plaque neurale antérieure. En tant que système modèle, l'induction d'une destinée neuro-épithéliales dans des cellules ZLI sera présenté ^8.

Ces protocoles visent à fournir, et des outils efficaces simples et bon marché pour les biologistes du développement et d'autres chercheurs pour explorer le mec fondamentalehanisms de comportements clés de cellules neurales. Ces protocoles sont très polyvalents et permettent à l'enquête sur une large gamme de extrinsèques et intrinsèques détermination signaux neuronaux. Il permet long terme dans l'analyse in vivo de l'engagement de la lignée de neurones, les interactions inductives et les comportements cellulaires.

Protocole

Des expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l'échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement.

1. plat montage des têtards de Xenopus laevis antérieure Neural Tube Après totalité montage hybridation in situ

1. Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard et les ⁴ vieillir jusqu'à ce qu'ils atteignent neurula étage 26 ans et plus (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement ^17.
2. Fix X. laevis têtards en les incubant dans une solution de paraformaldehyde à 4% (PFA). Roche et faire tourner les embryons dans un flacon de 2 ml en verre, de 1 à 1,5 heure à température ambiante pour l'étape 26 à l'étape 38 embryons, 2 heures à température ambiante pour les embryons à des stades ultérieurs.
   ATTENTION: PFA est toxique par contact et soupçonné d'être cancérigène. Il doit être manipulé sous une hotte.
   REMARQUE: One X. laevis couvaingénéralement fixé dans un flacon de 2 ml en verre, mais un plus grand flacon en verre peut être utilisé.
3. Laver les embryons dans le même flacon avec 1x PBS avec 0,1% de Tween (PBT), 3 min à température ambiante, deux fois.
   REMARQUE: Sauf indication contraire de la PBS est utilisé avec ou sans calcium et magnésium.
4. Déshydrater les embryons dans 100% de methanol (MeOH) pendant au moins 12 heures à température ambiante dans le même flacon. Changez le MeOH 100% au moins deux fois sous le capot à l'aide d'une micropipette plastique.
   NOTE: Le MeOH jaunit légèrement en lipides dissous. Attention le MeOH est toxique par inhalation et doit être manipulé sous une hotte.
5. Réhydrater les embryons en utilisant le même flacon à travers une série de bains à gradient de MeOH dans du MeOH à 75% dans du PBS, 50% de MeOH dans du PBS, 25% de MeOH dans du PBS, PBS deux fois, chaque bain de 5 à 10 min à température ambiante. Les solutions MeOH sont changés sous le capot à l'aide d'une micropipette plastique.
6. En utilisant une pipette en plastique, transférer l'embryon à être disséqué dans un plat 60 mm de Pétri remplie à ras bord de PBT. L'utilisation de deux pinces fines soinssupprimer complètement les yeux en insérant une pince fine entre les yeux et le tube neural, au niveau de la tige optique. Détachez les yeux du tube neural. Introduire délicatement la pince ci-dessous l'ectoderme recouvrant le tube neural. Avec des soins, décoller l'ectoderme à partir de derrière la tête et le jeter.
7. Effectuez une ISH double ou simple en utilisant digoxigénine ou des sondes marquées à la fluorescéine comme décrit précédemment ^18,19.
8. Après l'ISH transférer les embryons dans une nouvelle boîte de 60 mm de Pétri remplie vers le haut avec PBT aide d'une pipette en plastique.
9. En utilisant des pinces fines soigneusement détacher du tube neural du reste de l'embryon. A ce stade, le tube neural antérieur sépare du tube neural postérieur. Détacher soigneusement parties restantes de l'ectoderme neural recouvrant le tube, la notochorde qui est fixée de façon lâche au-dessous du tube neural, les vésicules otiques et autres parties du mésoderme. Assurez-vous que le tube neural est dépourvue de tout annexesà ce stade.
   NOTE: Pour éviter d'endommager le tube neural effectuer tous les transferts / tube neural embryonnaire avec une pipette de transfert en plastique ou une micropipette si nécessaire avec une coupe de pointe à son extrémité. Le diamètre de l'extrémité de pointe est adaptée à la taille du tube neural.
10. Transférer le tube neural disséqué (voir la note étape 1.9) dans un tube de 1,5 ml remplie avec 50% de glycérol dilué dans du PBS. Attendez jusqu'à ce que les tubes neuronaux sont tombés au fond de la solution de glycérol, habituellement O / N à 4 ° C.
11. Retirer la solution de glycerol à 50% / PBS aide d'une micropipette P1000 et ajouter dans le même tube de 1,5 ml d'une solution de 90% de glycérol / PBS aide d'une micropipette P1000. Attendez jusqu'à ce que les tubes de neurones tombent au fond de la solution 90% de glycérol / PBS, habituellement O / N à 4 ° C.
    REMARQUE: pour le stockage à long terme, utiliser 90% de glycérol / PBS plus des antibiotiques pour prévenir le développement des bactéries.
12. Transférer les tubes neuraux sur une plaque de verre ou une lame de microscope avec une pipette de transfert en plastique.
13. Dissecte tubes neuronaux le long de la dorsale et ventrale médianes l'aide d'aiguilles de tungstène. Au cours de cette étape, les tubes neuraux sont conservés dans 90% de glycérol / PBS.
14. Monter les deux côtés du tube neural dans 90% de glycérol / PBS en utilisant des anneaux de renforcement recouvertes d'une lamelle de verre.
15. Fixer les lamelles avec vernis et de garder à 4 ° C.

2. Cap animaux explants induction en utilisant des billes de résine d'échange d'anions

1. Transférer 100 pl de perles de résine échangeuse d'anions dans un tube de 2 ml en utilisant une micropipette P1000. Laver les billes au moins cinq fois de suite avec de l'eau distillée stérile. Permettre aux billes de sédiments au fond du tube et remplacer l'eau distillée stérile à l'aide d'une micropipette P1000. Ne touchez pas les perles.
2. Laissez tremper les perles O / N dans un tube de 2 ml remplie avec de l'eau distillée stérile avec sérum albumine bovine (BSA) (10 mg / ml) à 4 ° C.
3. Deux heures avant la collecte de l'AC, le lieu de la moitié des billes dans un nouveau 1,5 mltube à l'aide d'une micropipette P1000. Remplacer l'eau distillée stérile avec 500 ul de milieu contenant la molécule à tester pour sa capacité inductive, ou connus pour induire une destinée spécifique. Garder l'autre moitié des billes, car ils seront utilisés comme contrôle négatif.
4. Incuber les perles à 4 ° C pendant au moins 2 heures.
5. Effectuer toutes les étapes ultérieures sous la loupe binoculaire et effectuer tous les transferts AC avec une micropipette.
6. Transfert blastula ou très jeunes embryons gastrula dans du PBS avec calcium et magnésium complété avec 0,2% de SAB en utilisant une pipette de transfert en plastique.
   REMARQUE: Les embryons en développement à 12 ° C portée blastula et gastrula étapes de 20 à 24 h.
7. Retirer la membrane vitelline de l'embryon en utilisant une pince comme décrit précédemment ^20. Fixer l'embryon avec une pince. Pincer la membrane vitelline à côté des autres pinces. Tenir la membrane, peler lentement hors de l'embryon. Effectuez cette procédure sur le ventrale (végétale) côté de l'embryon. Ne pas endommager le côté animal de l'embryon.
8. Isoler petites AC comme décrit précédemment ^21. Le pôle animal fait partie pigmentée de l'embryon. Utilisation des pinces fines découpées un petit carré de tissu sur le pôle animal. Le tissu AC ne contient que les cellules ectodermiques. Assurez-vous que le tissu a une épaisseur uniforme. Sinon, retirez le secteur de l'analyse.
9. Placez chaque secteur dans un Terasaki plaques à puits multiples à 0.5x modifiés Saline (MBS) de Barth ^4. Placez l'AC dans le puits avec son côté animal pigmenté vers le bas, en contact avec le fond rond du puits.
   REMARQUE: pipettes de revêtement avec une solution de BSA à 0,1% empêche l'adhérence de petits morceaux de tissu adhésif à la matière plastique.
10. Placer une bille sur chaque capuchon à l'aide d'une micropipette P20. Si nécessaire, utilisez une pince pour placer soigneusement le talon dans le centre de la calotte.
    REMARQUE: Lorsque trempé dans un milieu conditionné, les perles sont colorées en rose. Sélectionnez les la plupart des colored perles.
11. Incubation à température ambiante (18 à 22 ° C) pendant 6 heures sans bouger la plaque multi-puits Terasaki. La perle colle à la AC en moins de 2 heures.
12. Placer la plaque à puits multiples Terasaki sur le dessus de papiers trempés dans l'eau. Recouvrir la plaque avec un récipient en plastique.
    NOTE: Cette «chambre d'humidité 'empêche l'évaporation prématurée des puits.
13. Culture l'AEC 0,5x MBS ou 3/4 NAM (voir l'étape 4.1) dans la chambre d'humidité à 15-20 ° C jusqu'à ce que les embryons frères et sœurs ont atteint le stade approprié pour tester l'effet de votre facteur.
14. Fixer le CA pendant 1 h à 4% fraîchement préparé PFA. Déshydrater le CA dans 100% de MeOH comme décrit précédemment (étape 1.4).

3. Cap dissociation des cellules animales et réagrégation avant la greffe dans un Xenopus laevis Neurula

1. Manteau de plats de Petri (60 mm) ou 12 puits des plaques avec 3% d'agarose dans de l'eau stérile ou dans du PBS sans calcium et magnésium. Ajouter suffisamment d'agarose pour couvrir le bOttom de la boîte de Pétri ou le bien. Préchauffer les plaques à température ambiante (18-22 ° C). En option, les plaques stockées pour deux jours à 4 ° C pour éviter la déshydratation.
2. Préparer sans calcium la saline de Holtfreter (60 mM de NaCl, KCl 0,7, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) et une solution saline de Holtfreter (60 mM de NaCl, KCl 0,7 mM, CaCl 0,9 _2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA, pH 7,6) ^5. REMARQUE: la solution de CaCl ₂ ne peut pas être stérilisé à l'autoclave.
3. Remplissez le agarose revêtu ainsi vers le haut avec une solution saline de calcium sans Holtfreter.
4. Préparez blastula ou très jeunes embryons gastrula pour isoler leurs AC tel que décrit précédemment (étapes 2.5 à 2.7).
5. Isolez au moins 15 ou jusqu'à 30, petite AC ^21. Utilisation des pinces fines découpées un petit carré de tissu sur le pôle animal. Le tissu AC ne contient que des cellules ectodermiques et est donc d'une épaisseur uniforme. Sinon, retirez le secteur de l'analyse.
   NOTE: Le pôle animal est le Embrypartie pigmentée de o.
6. Transférer les CA dans un agarose revêtu bien rempli vers le haut avec une solution saline sans calcium de Holtfreter. Placez le CA avec leur côté pigmentée vers le haut.
   Remarque: Le processus de dissociation commence rapidement sans calcium saline de Holtfreter.
7. Attendez quelques minutes pour que les cellules commencent à se dissocier. Observez ce grâce à la désagrégation des tissus. En utilisant des pinces fines, séparer la couche pigmentée du reste de l'AC et de les jeter avec un P20 micropipette. Complete processus de dissociation cellulaire indique la séparation des cellules les unes des autres.
   REMARQUE: Une ou deux couches pigmentées peuvent être laissés à l'expiant de ré-agrégées pour aider à la visualisation lors du greffage.
8. Centrer les cellules en utilisant des mouvements circulaires de la plaque. Avec une micropipette P1000 enlevez soigneusement autant moyen que possible. Veillez à ne pas toucher les cellules.
9. Ajouter 1 ml de solution saline de calcium avec Holtfreter au puits. Transférer les CA dissociéesdans un tube de 1,5 ml.
   Note: 2 ml tubes ne peuvent pas être utilisés en raison de leur fond rond.
10. Pellet les cellules par centrifugation, 5 min à une vitesse maximale de 2000 tours par minute pendant une centrifugeuse de paillasse (500 xg). Retirer soigneusement le surnageant avec une micropipette P1000.
11. Ajouter aux cellules dissociées 20 ul d'une solution saline de Holtfreter avec calcium (60 mM de NaCl, KCl 0,7 mM, 0,9 _mM de CaCl2, 4,6 mM de HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) ^5.
12. Gardez les CA dissocié, 3 à 6 heures à température ambiante (18-22 ° C).
    NOTE: Ceci est temps nécessaire pour que les cellules réagréger. La ré-agrégation est visible que les cellules forment une petite boule en bas du tube.
13. Détachez l'expiant attentivement du fond du tube en ajoutant 1 ml de 0,5x MBS ou de 1 ml de 3/4 NAM (voir l'étape 4.1). Transférer l'expiant dans une plaque non-revêtu en utilisant une pipette de transfert en plastique.
14. Stade, les explants utilisant leurs frères et sœurs de contrôle. Pour l'utilisation des antibiotiques culture à long terme: kanamycin (50 ug / ml), de l'ampicilline (50 ug / ml) et de gentamycine (50 ug / ml).

4. Intensification des animaux Caps explants dans la plaque neurale de X. laevis embryon

1. Préparation 4.3 NAM (110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO _{3) 2,} 1 mM de MgSO _4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO _3, 0,2 x PBS, 50 pg / ml de gentamycine). Ne pas garder pour plus de 1 semaine pour la dissection et conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtues (ci-dessous).
2. Manteau plats de Petri (60 mm) avec 3% d'agarose en 3/4 NAM dans laquelle de petits trous ont été réalisés en utilisant soit un moule en silicone, ou le couvercle d'une raquette de tennis de table.
   NOTE: L'agarose recouvre le fond de la boîte de Pétri. Laissez un espace de sorte que la boîte de Pétri à remplir avec 3/4 NAM. Alternativement faire des plats de dissection avec des non-séchage pâte à modeler. Dans l'argile, serrer les embryons légèrement au cours de la procédure de dissection. Creuser de petits trous dans laagarose en utilisant une pince arrondis Ce «plat de dissection» contribue à maintenir les embryons pendant la procédure de dissection.
3. Recueillir des outils de dissection: pipettes de transfert en plastique, un «couteau de sourcil» (faite avec des cheveux de sourcil inclus dans la paraffine à la pointe d'une pipette Pasteur en verre) ^22, deux pinces à dissection fines, P1000 micropipette et des conseils, un stereosmicroscope avec un grossissement 8-40X, une source de lumière avec des guides de fibre optique. Gardez tous les outils de dissection propre; après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l'eau distillée, une fois avec 100% d'éthanol et laisser sécher. Stocker à l'écart de la poussière et si nécessaire autoclave les outils de dissection de métal.
4. Laissez le dissociée et ré-agrégées ACS (protocole 3), et leurs frères et sœurs X. laevis embryons se développent jusqu'à ce qu'ils atteignent l'étape 13 (neurula) selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement ^17. Pour la transplantation de neurones dans le stade de la plaque 13 à l'étape 15 embryons sont utilisés.
5. Effectuer tousétapes ultérieures sous la loupe binoculaire.
6. En utilisant une pipette de transfert en plastique, le transfert des embryons dans du PBS avec calcium et magnésium complété avec 0,2% de BSA. Retirer la membrane vitelline de l'embryon comme décrit précédemment ^20. Fixer l'embryon avec une pince. Pincer la membrane vitelline à côté des autres pinces. Tenir la membrane fermement, peler lentement hors de l'embryon.
   REMARQUE: Effectuez cette procédure sur le (végétale) face ventrale de l'embryon. Ne pas endommager les embryons plaque neurale. Si les embryons ont été endommagés lors de l'étape d'enlèvement de membrane vitelline, transférer les embryons dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 3/4 NAM en utilisant une pipette de transfert en plastique et attendre 15 minutes, un temps suffisant pour le processus de guérison de se produire.
7. Remplissez le plat de dissection vers le haut avec des produits frais 3/4 NAM.
8. En utilisant une pipette de transfert en plastique, transférer les embryons sans leur membrane vitelline dans le plat de dissection. Placez les embryons côté dorsale vers le haut dansles puits. Pendant le processus de transfert ne permet pas l'embryon d'entrer en contact avec l'interface air-liquide depuis X. laevis sont lysées par tension superficielle.
9. Transférer l'expiant AC à greffer dans la plaque de dissection à l'aide d'une pipette de transfert en plastique ou une micropipette P1000. Une fois que la pipette est à l'intérieur du liquide, les explants permettre à couler lentement vers le bas par gravité, ou poussent très doucement.
10. Maintenir les embryons avec des pinces arrondis. Avec le couteau de sourcil faire une incision dans la plaque neurale, où vous avez l'intention de greffer le morceau de votre explantation.
    REMARQUE: À l'étape 14 la flexion antérieure de la plaque neurale peut être utilisé comme un point de repère, il marque le territoire de diencéphale (figure 4).
11. Découpez un petit morceau de neuroépithélium, en utilisant des pinces et un couteau arrondis de sourcil. Coupez un petit morceau de l'expiant avec le couteau de sourcil.
    NOTE: La pièce d'explantation devrait être d'environ la même taille et la forme que la zone d'ablation neuroépithélium.
12. Placez le morceau de explantation dans l'incision de neuroépithélium utilisant le couteau de sourcil et pinces fines. Assurez-vous que l'explant se fixe rapidement à l'embryon.
13. Sinon placez un morceau de lamelle de verre sur l'embryon greffé à maintenir la greffe en place. Pour ce faire, couper une lamelle de verre fin en très petits morceaux à l'aide de forceps grossières. Assurez-vous que la taille est d'environ 1,5 mm ^2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince. Choisissez un morceau de verre plus grand que l'embryon d'éviter de l'endommager. L'embryon sera un peu aplatie.
14. Attendez au moins 30 minutes sans bouger, ou seulement déplacer délicatement la plaque de dissection. Laissez l'embryon récupérer pendant 30 min à 2 h et retirez délicatement la lamelle si nécessaire. Pipetter prudemment les embryons greffés dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, l'aide de la pipette de transfert en plastique.
    NOTE: greffé embryons ont tendance à développer des bactéries ou des champignons de la contamination. Pour long terme culture utiliser des antibiotiques: la kanamycine (50 ug / ml), de l'ampicilline (50 ug / ml) et de gentamycine (50 ug / ml).

Résultats

Sur la base de considérations morphologiques chez différentes espèces, les manipulations embryonnaires, et le profil d'expression des gènes régulateurs, un modèle conceptuel qui tient la plaque neurale est divisé en segments longitudinaux et transversaux qui définissent une grille de développement histogène générer des champs distincts. Dans la plaque neurale, les ébauches du cerveau antérieur, le mésencéphale, le cerveau postérieur et la moelle épinière sont tous ...

Discussion

Le développement neuronal est orchestré par une interaction complexe entre les programmes de développement et les signaux cellulaires des tissus environnants (Avis à ^3,31,32). Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peut être utilisé dans X. laevis embryons à explorer facteurs extrinsèques et intrinsèques impliquées dans la détermination du destin de neurones et de la morphogenèse neuronale in vitro et in vivo. Ces protocoles peuvent être utilisés te...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation